Een contrast van drie inentingstechnieken die worden gebruikt om het ras van onbekend Fusarium oxysporum f.sp. te bepalen. niveum Isolaten

Dit protocol kan degenen die betrokken zijn bij de watermeloengemeenschap helpen bij het evalueren van de fusariumverwelkingspathogeen, en dit zal helpen bij het bepalen van de pathogene populaties die aanwezig zijn en helpen deze effectief te beheren. Race-typing fusarium verwelking is complex en tijdrovend om te voltooien, en het hebben van drie levensvatbare race-typerende bioassay-opties stelt gebruikers in staat om een methode te kiezen die het meest geschikt is voor hun experimentele omstandigheden. Alle drie de methoden helpen plantgezondheidsdeskundigen bij het diagnosticeren van de potentiële ernst van fusariumverwelkingsinfecties gerelateerd aan een specifiek isolaat.

Deze informatie maakt geïnformeerde en effectieve geïntegreerde ziektebeheerbeslissingen mogelijk. Om de voorbereiding voor het planten te beginnen, vult u 8x16 cel die flats begint met plantmedium terwijl u naar beneden tikt om de grond te comprimeren. Zaai vervolgens zaden met hun top naar boven gericht tot een diepte die gelijk is aan hun lengte.

Nadat zaden zijn gezaaid, bedek je het medium met de begraven zaden met Fuller's aarde tot een diepte van 0,3175 tot 0,635 centimeter en benevel je vervolgens de flats om het medium te bevochtigen zonder stilstaand of poolend water te creëren. Houd het medium daarna vochtig door elke 180 minuten gedurende vijf dagen 20 seconden te vernevelen totdat het zaad ontkiemt. Geef na het ontkiemen de flats eenmaal per dag water.

Plaats vijf dagen na het planten geïnfiltreerde papieren schijven met een diameter van 1 tot 1,25 centimeter met het gewenste fusarium oxysporumisolaat op één geklaard V8-sapmedium en 1/4-sterkte aardappeldextrose-agar, of QPDA-mediaplaat, om ze acht dagen in een incubator bij 28 graden Celsius te bewaren. Breng op de achtste dag de V8- en QPDA-platen over naar een bioveiligheidskast voordat u conidia ontwricht door een steriele celverspreider over het mediumoppervlak te schrapen en de vloeibare conidia-suspensie te bundelen in een steriele kweekbuis van 50 milliliter. Kwantificeer vervolgens het aantal sporen en bereid de uiteindelijke entoplossing voor door het berekende volume van ongeveer 1 miljoen sporen over te brengen naar de verse steriele kweekbuis en het totale volume op 30 milliliter te brengen met steriel gedeïoniseerd water.

Om zich voor te bereiden op de inenting, plaatst u 6x12 cel piepschuim flats die eerder zijn ontsmet met 10% bleekmiddel en goed gespoeld om de ingeënte planten te ontvangen. Enkele uren voorafgaand aan de inenting, geef de planten grondig water. Verwijder twee uur na het water geven de plantjes uit de 8x16 cel piepschuim flats en spoel hun wortels.

Bewaar de gespoelde planten vervolgens tijdelijk in schone containers met leidingwater tot gebruik, waarbij de cultivars van elkaar gescheiden blijven. Scheid later de plantjes in groepen van zes individuen en houd de zaailinggroepen gewikkeld in natte papieren handdoeken op een laboratoriumbak. Plaats 25 tot 30 kubieke centimeter grond op de bodem van elke cel van de 6x12 array piepschuimbak en gebruik een spuitfles om de grond nat te maken totdat deze zichtbaar vochtig is.

Begin met de gezonde controle en plaats een groep van de onbeschadigde zes zaailingen van dezelfde cultivar in de 50-milliliterbuizen met het entmateriaal. Om te enten, vortex de buizen van plantjes met wortels ondergedompeld gedurende 30 seconden. Plaats vervolgens een enkel plantje per cel in de 6x12 piepschuimflats met de planten van dezelfde cultivar in één kolom van de tray.

Bedek de plantjes met plantmedium en zet voorzichtig uit. Gebruik een spuit om de plant met 20 milliliter water nat te maken en vermijd spatten. Wanneer alle planten zijn herplant, plaats je de plantjes een nacht in een afgesloten donkere omgeving met een gemiddelde temperatuur van 27 graden Celsius.

Om de pitten te besmetten, bereidt u entmateriaal door een fusarium oxysporum niveum-stam op een plaat QPDA te isoleren en te kweken tot het punt dat de groei de helft van de plaat bedekt. Bereid de pitten door steriel leidingwater toe te voegen aan de glazen Erlenmeyers van één liter met 200 gram pitten om de korrels tot ten minste vijf centimeter volledig te bedekken. Nadat je de pitten twee uur in de kolven bij 24 graden Celsius hebt geweekt, giet je het water uit de kolf en sluit je de opening van de kolf af met een stuk katoenen rol gewikkeld in kaasdoek voordat je de opening bedekt met aluminiumfoliefolie.

Steriliseer de kolven in de autoclaaf gedurende één uur met vijf minuten droogtijd in een zwaartekrachtcyclus en laat de kolven vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur. Breng de korrels over in een champignonkweekzak met een filter. Haal de lucht uit de zak en vouw vervolgens het overtollige plastic eromheen.

Plaats de zak in een plastic autoclaafveilige bak en dek de bak af met aluminiumfoliefolie en autoclaaf vervolgens opnieuw met dezelfde instellingen als voorheen. Laat de schimmel na het autoclaveren gedurende drie weken op de pitten in de zak incuberen. Gebruik een steriele kurkboring van nummer vier om agarschijven met een diameter van zes millimeter uit de zone van actieve groei op de kweekplaat te snijden.

Vouw de zak uit om vijf agarschijven te plaatsen met een strikte steriele techniek. Gebruik een steriele maatcilinder van 50 milliliter om te meten en voeg 35 milliliter steriel leidingwater toe aan de zak. Vul een plastic pot met een potgrond en voeg vervolgens de afgemeten hoeveelheid potgrond toe aan een grote plastic zak met 14 korrels aangetaste pitten.

Maak een luchtkussen in de zak en sluit het af voordat je de pitten en aarde mengt door de zak meerdere keren om te keren. Als u klaar bent, vult u een oppervlakte-gesteriliseerde pot met het aangetaste grondmengsel. Herhaal het proces voor elke resterende watermeloenvariëteit voor een totaal van vier volle potten besmette grond per isolaat dat wordt getest.

Zaai vervolgens zes watermeloenzaden in de pot met het uiteinde van het zaad naar boven gericht. Maak met een spuitfles de bovenste 0,3 tot 0,6 centimeter grond nat met water en plaats vervolgens een doorzichtig plastic schaaltje onder en over elke pot. Vul 48 celinzetstukken met stoom gepasteuriseerd zand, turf, vermiculiet in de verhouding 4:1:1 en tik op de inzetstukken om de grond samen te persen.

Plaats vervolgens de inzetstukken in plastic bakjes en zaai de zaden zoals eerder uitgelegd. Zeven dagen voor het planten, ent vijf QPDA-platen met geïnfiltreerd papier om ze acht dagen in een geïncubeerd gebied op te slaan in een donkere cyclus van 14 uur / 10 uur. Breng op de zevende dag twee agarpluggen van een vierkante centimeter over in elke Erlenmeyer van 250 milliliter met 100 milliliter aardappeldextrose en plaats de Erlenmeyers op een shaker op een bankje.

Oogst op de inentingsdag de sporen door het entmateriaal door vier lagen steriel kaasdoek te filteren om de microconidiale concentratie van de kolf te bepalen. Breng 14 dagen na het zaaien de celinzetstukken met de zaailingen over in de lade met zwemvliezen en plaats vervolgens de lade met zwemvliezen met de zaailingen in een plastic kuip met de zeven liter entsuspensie. Na 15 minuten het entmateriaal ongestoord te hebben gehouden, brengt u de celinzetstukken met de ingeënte zaailingen over in gatloze trays en plaatst u de gatloze trays op de kasbank, gevolgd door water geven indien nodig.

Handhaaf de licht- en omgevingscondities zoals eerder beschreven voor de worteldip bioassay. Afhankelijk van de gebruikte methode, begint u de beoordeling door de incidentie van verwelking en plantensterfte te observeren en te berekenen en neemt u digitale afbeeldingen om de voortgang van de ziekte te documenteren. In de aangepaste tray dip methode vertoonden de Black Diamond en Charleston Gray cultivars geïnfecteerd met een ras-2 isolaat ernstige symptomen en stierven.

De Citrullus amarus PI cultivar daarentegen vertoonde resistentie. In de worteldipmethode overleefden de zaailingen die besmet waren met een ras-0-isolaat meestal, terwijl bijna alle zaailingen die besmet waren met een ras-3-isolaat stierven. In de besmette kernelmethode zijn Sugar Baby- en Charleston Gray-cultivars gekweekt in ras-2-aangetaste grond begonnen te verwelken en af te sterven, terwijl de Citrullus amarus PI-planten er nog steeds gezond uitzien.

Vergeet niet om planten op de juiste manier te zaaien en te onderhouden, het pathogeenisolaat op levensvatbaarheid te controleren, de unieke technieken van elke inentingsmethode te begrijpen en consistent te zijn bij het beoordelen van ziektesymptomen. Met de resultaten van deze methoden kunnen onderzoekers de onderliggende genetische determinanten onderzoeken die differentiële variantie-expressie tussen de isolaten regelen door middel van sequencing en vergelijkende genomica-analyse. Met behulp van deze methoden zijn onderzoekers in staat geweest om de prevalentie van verschillende virulentiefenotypen op verschillende locaties te evalueren en deze fenotypen te vergelijken met waarneembare genetische elementen.