Name: Het voorbereiden en fokken van axeeninsecten met weefsel gekweekte zaailingen voor gastheer-darmmicrobiota-interactiestudies van de bladkever (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Leer axenische insecten fokken met weefselgekweekte bladeren voor darmmicrobiota-onderzoek bij bladkevers. Deze methode vermijdt antibiotica en kunstmatige diëten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (31971663) en het Young Elite Scientists Sponsorship Program door CAST (2020QNRC001).

1. Insectenopfok
<ol><li>Houd de P. versicolora populatie in een groeikamer op de conditie van 27 °C en 70 ± 5% relatieve vochtigheid met een fotoperiode van 16 h licht/8 h donker. Leg ze in geperforeerde plastic dozen met betegeld nat absorberend papier en voer ze verse populierentakken. Spuit schoon water op absorberend papier om vocht vast te houden en ververs de takken om de twee dagen.</li>
	<li>Isoleer volwassenen voor ovipositie na verpopping. Voer ze zachte bladeren om meer eieren te krijgen.</li>
	<li>Verzamel nieuw gelegde eieren (binnen 24 uur). Leg de eieren gedurende 60 uur op vochtig absorberend papier om axeenlarven te bereiden. OPMERKING: Nieuw gelegde eieren komen na ~ 72 uur uit. De beste tijd om eioppervlakken te steriliseren is de dag voor het uitkomen; anders zal het aantal met succes uitgekomen eieren afnemen.</li>
</ol>2. Kiemvrije populieren kweken
<ol><li>Bereid Murashige en Skoog (MS) medium en 1 mg/ml α-naftaleen azijnzuur (NAA) stamoplossingen (zie de tabel met materialen).</li>
	<li>Voeg in een bioveiligheidskap 50 μL 1 mg / ml NAA-stamoplossing toe aan 500 ml MS-medium, schud om goed te mengen en giet ~ 50 ml per weefselkweekcontainer en wacht op stolling.</li>
	<li>Bereid scalpels, alcohollamp en tang voor; steriliseer de scalpels en tangen in de alcohollampvlam in de bioveiligheidskap.</li>
	<li>Snijd 3-4 cm stengelsegmenten met apicale knoppen of laterale knoppen van populierenzaailingen bij ~ 1 maand groei (kiemvrije weefselgekweekte zaailingen) en breng ze in het kweekmedium, een of twee stengelsegmenten per container.</li>
	<li>Incubeer deze stengelsegmenten in een groeikamer bij 25 °C en 50 ± 10 cd lichtintensiteit met een fotoperiode van 16 h licht/8 h donker gedurende ongeveer 30 dagen. Gebruik de kiemvrije bladeren om de axeenlarven te voeden.</li>
</ol>3. Sterilisatie van het eioppervlak en het fokken van axeenlarven
<ol><li>Autoclaaf Petrischalen, verfborstels, filtreerpapier, gedestilleerd water en een petrischaal met LB (Luria-Bertani) agar medium.</li>
	<li>Leg bladeren met aanhangende eieren in een petrischaaltje, verwijder de eieren voorzichtig van de bladeren met een tang en breng ze over naar een andere petrischaal. OPMERKING: Deze stap moet zeer voorzichtig worden uitgevoerd omdat de eieren zich aan de bladeren hechten.</li>
	<li>Was deze eieren gedurende 8 minuten met 75% ethanol en herhaal de was vier keer met steriel water.</li>
	<li>Breng de eieren over op LB-agarmedium om vocht te behouden voor het uitkomen. OPMERKING: Het gebruik van LB-agarmedium kan helpen om te controleren of het gedesinfecteerde ei kiemvrij is.</li>
	<li>Plaats de petrischaal in een groeikamer en wacht tot de eieren binnen 24 uur uitkomen.</li>
	<li>Tegel in een bioveiligheidskap drie stukken nat filterpapier in een petrischaaltje, leg kiemvrije populierenbladeren op het papier, verzamel de larven en leg ze op de bladeren, sluit de petrischaal af met parafilm en incubeer ze in een groeikamer bij 27 °C en 70 ± 5% relatieve vochtigheid met een fotoperiode van 16 uur licht / 8 uur donker. OPMERKING: De weefsel gekweekte bladeren zijn delicaat en kunnen snel water verliezen. Het gebruik van vochtig filterpapier is dus noodzakelijk bij het overbrengen van de bladeren naar de petrischaal.</li>
	<li>Vervang de bladeren om de twee dagen.</li>
	<li>Breng voor de conventioneel gekweekte groepen de eieren van de bladeren over naar een petrischaal met vochtig filterpapier en voed deze larven met kiemvrije populierenbladeren.</li>
</ol>4. Verificatie van axeenlarven met cultuurafhankelijke assays
<ol><li>Selecteer willekeurig drie1e,2e en3e instarlarven uit de kiemvrije en conventioneel gekweekte groepen.</li>
	<li>Ontleed de3e instarlarven met een steriele schaar en tang onder een stereomicroscoop en verzamel hun ingewanden in microcentrifugebuizen. Verzamelintacte 1e en2e instarlarven in buizen. OPMERKING: Verzamel hele1e en2e instarlarven omdat ze te klein zijn om te ontleden en houd hun ingewanden intact.</li>
	<li>Voeg 100 μL fosfaat gebufferde zoutoplossing en drie stalen kogels toe aan buizen van 1,5 ml en maal de weefsels tot homogenaten met behulp van een kralenkerende homogenisator.</li>
	<li>Voeg 100 μL homogenaat toe aan LB-agarmedium en -plaat met behulp van een steriele glazen uitspreidstaaf.</li>
	<li>Plaats de platen gedurende 24 uur op 37 °C en observeer de bacteriekolonies.</li>
</ol>5. Verificatie van axeen individuen met cultuuronafhankelijke assays
<ol><li>Extraheer het totale DNA van weefsels (verkregen in sectie 4) met behulp van een DNA-extractiekit.</li>
	<li>Meet de DNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer bij 260 nm.</li>
	<li>Versterk het bacteriële 16S rRNA-gen met behulp van universele 16S rRNA-primers met PCR. Stel het reactiesysteem in met 18 μL van 1,1x PCR-mastermix (zie de tabel met materialen), 0,5 μL 27F-primer (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3'), 0,5 μL 1495R-primer (5'-ACGGATACCTTGTTACGAC-3') en 100 ng template DNA. Stel de PCR-omstandigheden in op 95 °C gedurende 3 minuten; 28 cycli van 95 °C gedurende 30 s, 55 °C gedurende 1 minuut en 72 °C gedurende 1 minuut; gevolgd door 72 °C gedurende 10 min. Bewaar de PCR-producten bij 4 °C tot verdere analyse.</li>
	<li>Meng de PCR-producten met nucleïnezuurkleurstof en analyseer ze met behulp van elektroforese op een 1% agarosegel in 1x TAE-buffer. Gebruik 10 μL van een DNA-marker als referentie.</li>
	<li>Observeer de gel met een UV-transilluminator en zoek naar het doelfragment rond 1.500 bp.</li>
</ol>

<ol><li>Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+and+ecological+consequences+of+gut+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Ecology%2C+Evolution%2C+and+Systematics%22%5BJournal%5D)">Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities.</a> Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).</li>
<li>Warnecke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+and+functional+analysis+of+hindgut+microbiota+of+a+wood-feeding+higher+termite%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite.</a> Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).</li>
<li>Tokuda, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber-associated+spirochetes+are+major+agents+of+hemicellulose+degradation+in+the+hindgut+of+wood-feeding+higher+termites%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fiber-associated spirochetes are major agents of hemicellulose degradation in the hindgut of wood-feeding higher termites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 11996-12004 (2018).</li>
<li>Wang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+microbiome+confer+multigenerational+host+resistance+after+sub-toxic+pesticide+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure.</a> Cell Host & Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).</li>
<li>Shin, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+microbiome+modulates+host+developmental+and+metabolic+homeostasis+via+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling.</a> Science. 334 (6056), 670-674 (2011).</li>
<li>Storelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacillus+plantarum+promotes+Drosophila+systemic+growth+by+modulating+hormonal+signals+through+TOR-dependent+nutrient+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing.</a> Cell Metabolism. 14 (3), 403-414 (2011).</li>
<li>Salem, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+supplementation+by+gut+symbionts+ensures+metabolic+homeostasis+in+an+insect+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings.+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Vitamin supplementation by gut symbionts ensures metabolic homeostasis in an insect host.</a> Proceedings. Biological Sciences. 281 (1796), 20141838(2014).</li>
<li>Koch, H., Schmid-Hempel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Socially+transmitted+gut+microbiota+protect+bumble+bees+against+an+intestinal+parasite%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19288-19292 (2011).</li>
<li>Cirimotich, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+microbe-mediated+refractoriness+to+Plasmodium+infection+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural microbe-mediated refractoriness to Plasmodium infection in Anopheles gambiae.</a> Science. 332 (6031), 855-858 (2011).</li>
<li>Kaltenpoth, M., Gottler, W., Herzner, G., Strohm, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiotic+bacteria+protect+wasp+larvae+from+fungal+infestation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Symbiotic bacteria protect wasp larvae from fungal infestation.</a> Current Biology. 15 (5), 475-479 (2005).</li>
<li>Yuan, C., Xing, L., Wang, M., Hu, Z., Zou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota+modulates+gut+immunity+and+promotes+baculovirus+infection+in+Helicoverpa+armigera%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Microbiota modulates gut immunity and promotes baculovirus infection in Helicoverpa armigera.</a> Insect Science. , (2021).</li>
<li>Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pheromones+-+Exploitation+of+gut+bacteria+in+the+locust%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pheromones - Exploitation of gut bacteria in the locust.</a> Nature. 403 (6772), 851(2000).</li>
<li>Xu, L. T., Lou, Q. Z., Cheng, C. H., Lu, M., Sun, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-associated+bacteria+of+Dendroctonus+valens+and+their+involvement+in+verbenone+production%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Gut-associated bacteria of Dendroctonus valens and their involvement in verbenone production.</a> Microbial Ecology. 70 (4), 1012-1023 (2015).</li>
<li>Schretter, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gut+microbial+factor+modulates+locomotor+behaviour+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila.</a> Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiome+modulates+Drosophila+aggression+through+octopamine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Gut microbiome modulates Drosophila aggression through octopamine signaling.</a> Nature Communications. 12 (1), 2698(2021).</li>
<li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+and+immunological+effects+of+gut+microbiota+in+leaf+beetles+at+the+local+and+systemic+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Zoology%22%5BJournal%5D)">Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels.</a> Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+action+of+the+gut+microbiota+in+environmental+RNA+interference+in+a+leaf+beetle%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle.</a> Microbiome. 9 (1), 98(2021).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+in+an+invasive+bark+beetle+infected+by+a+pathogenic+fungus+accelerates+beetle+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pest+Science%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota in an invasive bark beetle infected by a pathogenic fungus accelerates beetle mortality.</a> Journal of Pest Science. 92, 343-351 (2019).</li>
<li>Berasategui, A., Shukla, S., Salem, H., Kaltenpoth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+applications+of+insect+symbionts+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Potential applications of insect symbionts in biotechnology.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (4), 1567-1577 (2016).</li>
<li>Tikhe, C. V., Martin, T. M., Howells, A., Delatte, J., Husseneder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+genetically+engineered+Trabulsiella+odontotermitis+as+a+%27Trojan+Horse%27+for+paratransgenesis+in+termites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Assessment of genetically engineered Trabulsiella odontotermitis as a 'Trojan Horse' for paratransgenesis in termites.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 202(2016).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fighting+malaria+with+engineered+symbiotic+bacteria+from+vector+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fighting malaria with engineered symbiotic bacteria from vector mosquitoes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12734-12739 (2012).</li>
<li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+symbionts+activate+honey+bee+immunity+and+limit+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens.</a> Science. 367 (6477), 573-576 (2020).</li>
<li>Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+germ-free+Drosophila+to+study+gut-microbe+interactions%3A+protocol+to+rear+Drosophila+under+axenic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Generating germ-free Drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions.</a> Current Protocols in Toxicology. 77 (1), 52(2018).</li>
<li>Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+lifespan+enhancement+by+exogenous+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).</li>
<li>Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+axenic+Aedes+aegypti+demonstrate+live+bacteria+are+not+required+for+mosquito+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development.</a> Nature Communications. 9 (1), 4464(2018).</li>
<li>Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+germ-free+mosquitoes+via+transient+colonisation+allows+stage-specific+investigation+of+host-microbiota+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 942(2021).</li>
<li>Berasategui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota+of+the+pine+weevil+degrades+conifer+diterpenes+and+increases+insect+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota of the pine weevil degrades conifer diterpenes and increases insect fitness.</a> Molecular Ecology. 26 (15), 4099-4110 (2017).</li>
<li>Lin, X. L., Kang, Z. W., Pan, Q. J., Liu, T. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+five+antibiotics+on+larval+gut+bacterial+diversity+of+Plutella+xylostella+%28Lepidoptera%3A+Plutellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Evaluation of five antibiotics on larval gut bacterial diversity of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae).</a> Insect Science. 22 (5), 619-628 (2015).</li>
<li>Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y., Shi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+red+palm+weevil+Rhynchophorus+Ferrugineus+%28Olivier%29+%28Coleoptera%3A+Dryophthoridae%29+germ-free+larvae+for+host-gut+microbes+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies.</a> Bio-protocol. 9 (24), 3456(2019).</li>
<li>Gelman, D. B., Bell, R. A., Liska, L. J., Hu, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+diets+for+rearing+the+Colorado+potato+beetle%2C+Leptinotarsa+decemlineata%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Artificial diets for rearing the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata.</a> Journal of Insect Science. 1, 7(2001).</li>
<li>Bengtson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+program+for+the+evaluation+of+artificial+diets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+World+Aquaculture+Society%22%5BJournal%5D)">A comprehensive program for the evaluation of artificial diets.</a> Journal of the World Aquaculture Society. 24 (2), 285-293 (2007).</li>
<li>Utsumi, S., Ando, Y., Ohgushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+feeding+preference+in+a+leaf+beetle%3A+the+importance+of+phenotypic+plasticity+of+a+host+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+Letters%22%5BJournal%5D)">Evolution of feeding preference in a leaf beetle: the importance of phenotypic plasticity of a host plant.</a> Ecology Letters. 12 (9), 920-929 (2009).</li>
<li>Ishihara, M., Ohgushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+inactivity+and+prolonged+developmental+time+induced+by+seasonal+decline+in+host+plant+quality+in+the+willow+leaf+beetle+Plagiodera+versicolora+%28Coleoptera%3A+Chrysomelidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Entomology%22%5BJournal%5D)">Reproductive inactivity and prolonged developmental time induced by seasonal decline in host plant quality in the willow leaf beetle Plagiodera versicolora (Coleoptera: Chrysomelidae).</a> Environmental Entomology. 35 (2), 524-530 (2006).</li>
<li>Bright, M., Bulgheresi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+journey%3A+transmission+of+microbial+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A complex journey: transmission of microbial symbionts.</a> Nature Reviews: Microbiology. 8 (3), 218-230 (2010).</li>
<li>Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertically+transmitted+gut+bacteria+and+nutrition+influence+the+immunity+and+fitness+of+Bactrocera+dorsalis+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 596352(2020).</li>
<li>Hosokawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obligate+bacterial+mutualists+evolving+from+environmental+bacteria+in+natural+insect+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Obligate bacterial mutualists evolving from environmental bacteria in natural insect populations.</a> Nature Microbiology. 1, 15011(2016).</li>
<li>Habineza, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoting+effect+of+gut+microbiota+on+growth+and+development+of+red+palm+weevil%2C+Rhynchophorus+ferrugineus+%28Olivier%29+%28Coleoptera%3A+Dryophthoridae%29+by+modulating+its+nutritional+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The promoting effect of gut microbiota on growth and development of red palm weevil, Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) by modulating its nutritional metabolism.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1212(2019).</li>
<li>Meilan, R., Ma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poplar+%28Populus+spp.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Poplar (Populus spp.).</a> Methods in Molecular Biology. 344, Clifton, N.J. 143-151 (2006).</li>
<li>Wani, Z. A., Ashraf, N., Mohiuddin, T., Riyaz-Ul-Hassan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-endophyte+symbiosis%2C+an+ecological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Plant-endophyte symbiosis, an ecological perspective.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (7), 2955-2965 (2015).</li>
<li>Grout, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meristem-tip+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Meristem-tip culture.</a> Methods in Molecular Biology. 6, Clifton, N.J. 81-91 (1990).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Bereiding van kiemvrije larven en het verkrijgen van gnotobiotische larven door specifieke bacteriestammen opnieuw te introduceren, zijn krachtige methoden om de mechanismen die ten grondslag liggen aan gastheer-microbe-interacties op te helderen. Pas uitgekomen larven verkrijgen darmmicrobiota op twee belangrijke manieren: verticale overdracht van de moeder naar het nageslacht of horizontale acquisitie van broers en zussen en de omgeving34. De eerste kan worden vervuld door ouderlijke overdracht ...

Net als bij zoogdieren is het spijsverteringskanaal van insecten een holte voor voedselvertering en -absorptie. De meeste insecten herbergen diverse commensale bacteriën die gedijen in hun darmen en leven van voeding geleverd door gastheren1. De darmcommensale gemeenschap heeft een diepgaande invloed op meerdere fysiologische processen bij insecten, waaronder voedselvertering en ontgifting 2,3,4, voeding en ontwikkeling 5,6,7, verdediging tegen pathogenen en parasieten 8,9,10,11, chemische communicatie 12,13 en gedragingen14 ,15. Intrigerend genoeg kunnen sommige darmmicrobiota facultatief pathogeen zijn of worden gemanipuleerd door pathogenen binnen te dringen om de infectie te verergeren, wat aangeeft dat darmbacteriën in sommige gevallen schadelijk kunnen zijn 16,17,18. Darmbacteriën kunnen ook dienen als een microbiële hulpbron voor biotechnische toepassingen en ongediertebestrijding. Lignocellulose-verterende bacteriën uit fytofagote en xylofagische insecten werden bijvoorbeeld gebruikt om plantencellen te verteren voor de ontwikkeling van biobrandstoffen19. De verspreiding van gemanipuleerde darmsymbionten die bioactieve moleculen tot expressie brengen, is een nieuwe en veelbelovende tactiek om land- en bosbouwplagen en muggen die infectieziekten overbrengen te beheren 19,20,21, die ook kunnen worden gebruikt om de fitheid van nuttige insecten te verbeteren 22. Illustreren hoe een darmbacterie zich in vivo gedraagt, wordt daarom als een prioriteit beschouwd om zijn functie volledig te benutten en verder te benutten voor verschillende toepassingen.
Dieren kunnen 1 tot >1000 symbiotische microbiële soorten in de darmherbergen 1. Als gevolg hiervan is het moeilijk om nauwkeurig te verifiëren hoe individuele bacteriële taxa of hun assemblage in een dier presteren en of de gastheer of zijn microbiële partners een specifieke functie aansturen. Daarom is het voorbereiden van axeenlarven om gnotobiotische insecten te verkrijgen door mono- of multi-species kolonisatie noodzakelijk om de bacteriële functie en interactie met insecten te onderzoeken23. Op dit moment zijn het toedienen van antibioticacocktails en het steriliseren van het oppervlak van insecteneieren gebruikelijke methoden om darmbacteriën te verwijderen 14,24,25,26. Antibioticadiëten kunnen darmbacteriën echter niet volledig elimineren en hebben een negatief effect op de fysiologie van gastheerinsecten27,28. Bijgevolg kan het gebruik van met antibiotica behandelde insecten de ware vermogens van sommige darmbacteriën verdoezelen. Gelukkig kan oppervlaktesterilisatie van eieren dit probleemtenietdoen 23,29, wat geen of verwaarloosbare effecten heeft op experimentele insecten. Bovendien kunnen kunstmatige diëten niet volledig lijken op natuurlijk insectenvoer en het ontwikkelen van een kunstmatig dieet is een kostbaar en arbeidsintensief proces30,31.
De wilgenbladkever, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), is een wijdverspreide bladetende plaag die zich voornamelijk voedt met heilzame bomen, zoals wilgen (Salix) en populier (Populus L.) 32,33. Hier werd de wilgenbladkever gebruikt als representatief bladetende insect om een protocol te ontwikkelen om een kiemvrij insect voor te bereiden en groot te brengen. We maakten gebruik van plantenweefselkweek om kiemvrije populierenbladeren te verkrijgen om P. versicolora axeenlarven uit gesteriliseerde eieren te kweken. De axeenstatus van P. versicolora-larven werd geverifieerd via cultuurafhankelijke en cultuuronafhankelijke testen. Dit protocol kan axeeninsecten in stand houden die de wilde toestand beter nabootsen dan het fokken van insecten met een kunstmatig dieet. Wat nog belangrijker is, deze methode is handig tegen zeer lage kosten, wat de haalbaarheid verhoogt van het verkrijgen van axeeninsecten voor toekomstige interactiestudies tussen insecten en darmmicrobiota, vooral voor niet-modelinsecten zonder goed ontwikkelde kunstmatige diëten.

<table><tbody><tr><td>0.22 &micro;m spuitfilter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>1 mg/mL NAA-stockoplossing</td><td></td><td></td><td>a. Bereid 0.1 M NaOH-oplossing (los 0.8 g NaOH op in 200 mL gedistilleerd water). b. Voeg 0.2 g NAA toe in een 250 mL beker, voeg een beetje 0.1 M NaOH-oplossing toe tot NAA is opgelost en pas het eindvolume aan tot 200 mL met gedistilleerd water. c. Filter de oplossing om bacteriën te verwijderen met een 0.22 &micro;m spuitfilter en een 50 mL steriele spuit, verpak de oplossing in 1.5 mL centrifugebuizen en bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifugebuisjes</td><td>Sangon Biotech</td><td>F600620</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS-stockoplossing</td><td>Biosharp Life Sciences</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>2 M KOH-oplossing</td><td></td><td></td><td>Los 22.44 g KOH op (molecuulgewicht: 56.1) in 200 mL gedistilleerd water en autoclaveer het gedurende 20 min bij 121 &deg;C.</td></tr><tr><td>250 mL en 2.000 mL bekers</td><td>Shubo</td><td>sb16455</td><td></td></tr><tr><td>50 mL steriele spuiten</td><td>Jinta</td><td>JT0125789</td><td></td></tr><tr><td>500 mL maatcilinder</td><td>Shubo</td><td>sb1601</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE-stockoplossing</td><td></td><td></td><td>a.&nbsp;Los 242 g Tris en 18.612 g EDTA op in 700 mL gedistilleerd water. b. Pas de pH aan tot 7.8 met ongeveer 57.1 mL azijnzuur. c. Pas het eindvolume aan tot 1.000 mL. d. De stockoplossing werd verdund tot 1x TAE-buffer bij gebruik.</td></tr><tr><td>75% ethanol</td><td>Xingheda trade</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-naftaleenazijnzuur (NAA)</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>86-87-3</td><td></td></tr><tr><td>Absorbeerpapier</td><td></td><td></td><td>22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm</td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Coolaber</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biowest</td><td>111860</td><td></td></tr><tr><td>Autoclaaf</td><td>Panasonic</td><td>MLS-3781L-PC</td><td></td></tr><tr><td>Parelslag homogenisator</td><td>Jing Xin</td><td>XM-GTL64</td><td></td></tr><tr><td>DNA-extractiekit</td><td>MP Biomedicals</td><td>116560200</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Saiguo Biotech</td><td>1340</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Jiaojie</td><td></td><td>70 mm diameter</td></tr><tr><td>Gelelektroforese-eenheid</td><td>Bio-rad</td><td>164-5052</td><td></td></tr><tr><td>Gel Signaal Green nucleïnezuurkleuring</td><td>TsingKe</td><td>TSJ003</td><td></td></tr><tr><td>Kiemvrije populierenzaailingen</td><td></td><td></td><td>Shan Xin populier uit Ludong University in Shandong Province</td></tr><tr><td>Golden Star Super PCR Master Mix (1,1&times;)</td><td>TsingKe</td><td>TSE101</td><td></td></tr><tr><td>Kweekkamer</td><td>Ruihua</td><td>HP400GS-C</td><td></td></tr><tr><td>LB-agarmedium</td><td></td><td></td><td>a. Los 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g gistextract op in 300 mL gedistilleerd water. b. Pas het eindvolume aan tot 500 mL, breng de oplossing over naar een 1.000 mL kegelfles en voeg 7,5 g agar toe. c. Autoclaveer het medium gedurende 20 min bij 121 &deg;C.</td></tr><tr><td>Mini centrifuge</td><td>DRAGONLAB</td><td>D1008</td><td></td></tr><tr><td>MS basismedium</td><td>Coolaber</td><td>PM1121-50L</td><td>M0245</td></tr><tr><td>MS vast medium voor kiemvrije populierenzaailingencultuur</td><td></td><td></td><td>a. Los 4.43 g MS basismediumpoeder en 30 g sucrose op in 800 mL gedistilleerd water. b. Pas de pH aan tot ongeveer 5.8 met 2 M KOH door een pH-meter. c. Pas het eindvolume aan tot 1.000 mL, verdeel in twee delen, breng over naar twee 1.000 mL kegelflessen en voeg 2.6 g agar per 500 mL toe. d. Autoclaveer gedurende 20 min bij 121 &deg;C.</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 spectrofotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schilderkwast</td><td></td><td></td><td>1 cm breedte, gebruikt om de eieren te verzamelen</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermo Cyclers</td><td>Eppendorf</td><td>6331000076</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Supin</td><td></td><td>90 mm diameter</td></tr><tr><td>pH-meter</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>FE20</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten 0,2-2 &micro;L</td><td>Gilson</td><td>ECS000699</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten 100-1.000 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3120000267</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten 20-200 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3120000259</td><td></td></tr><tr><td>Pipetten 2-20 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3120000232</td><td></td></tr><tr><td>Plantenweefselkweekcontainer</td><td>Chembase</td><td>ZP21</td><td>240 mL</td></tr><tr><td>Kunststof doos</td><td></td><td></td><td>2,35 L</td></tr><tr><td>Kaliumhydroxide (KOH)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primers voor het amplificeren van het bacteriële 16S rRNA-gen</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td>27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’</td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide (NaOH)</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stalen ballen</td><td></td><td>0,25 mm</td><td>gebruikt om weefsels te malen</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>OLYMPUS</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trans2K plus II DNA-marker</td><td>Transgene Biotech</td><td>BM121-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Bio

het voorbereiden en fokken van axeeninsecten met weefsel gekweekte zaailingen voor gastheer-darmmicrobiota-interactiestudies van de bladkever

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

Insectendarmen worden gekoloniseerd door diverse bacteriën die de fysiologische eigenschappen van de gastheer diepgaand kunnen beïnvloeden. Het introduceren van een bepaalde bacteriestam in een axeeninsect is een krachtige methode om de microbiële darmfunctie te verifiëren en de mechanismen op te helderen die ten grondslag liggen aan interacties tussen darmmicroben en gastheer. Het toedienen van antibiotica of het steriliseren van eioppervlakken zijn twee veelgebruikte methoden om darmbacteriën van insecten te verwijderen. Naast de mogelijke nadelige effecten van antibiotica op insecten, gaven eerdere studies echter aan dat het voeren van antibiotica darmbacteriën niet kon elimineren. Kiemvrije kunstmatige diëten worden dus over het algemeen gebruikt om axeeninsecten te behouden, wat een vervelend en arbeidsintensief proces is dat niet volledig kan lijken op voedingscomponenten in natuurlijk voedsel. Hier wordt een efficiënt en eenvoudig protocol beschreven om axeenlarven van een bladkever (Plagiodera versicolora) te bereiden en te onderhouden. In het bijzonder werden oppervlakken van de kevereieren gesteriliseerd, waarna kiemvrije populierenbladeren werden gebruikt om axeenlarven op te voeden. De axeenstatus van de insecten werd verder bevestigd door middel van cultuurafhankelijke en cultuuronafhankelijke testen. Gezamenlijk, door het combineren van eierdesinfectie en kiemvrije teelt, werd een efficiënte en handige methode ontwikkeld om axeen P. versicolora te verkrijgen, een gemakkelijk overdraagbaar hulpmiddel voor andere bladetende insecten.

De levensfasen van P. versicolora zijn weergegeven in figuur 1. Het volwassen mannetje is kleiner dan het volwassen vrouwtje (figuur 1A). In het veld clustert de kever zijn eieren op een blad; hier werden vier eieren losgemaakt van een blad (figuur 1B). De populierenstengelsegmenten en zaailingen die worden gebruikt voor het fokken van axeeninsecten zijn weergegeven in figuur 2. De darm van een...

Om een axeeninsect te verkrijgen, wordt het eioppervlak gesteriliseerd en wordt de uitgekomen larve vervolgens grootgebracht met behulp van axeenbladeren. Deze methode biedt een efficiënte manier voor axeeninsectenbereiding zonder antibiotica toe te dienen of een kunstmatig dieet te ontwikkelen, dat ook kan worden toegepast op andere bladetende insecten.

Het voorbereiden en fokken van axeeninsecten met weefsel gekweekte zaailingen voor gastheer-darmmicrobiota-interactiestudies van de bladkever

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...

De darmbacteriën kunnen meerdere fysiologische processen van insectengastheren beïnvloeden. Het voorbereiden en onderhouden van axeenlarven is een krachtig hulpmiddel om darmbacteriënfuncties te bestuderen. De belangrijkste voordelen van dit protocol zijn dat plantenweefselkweek wordt gebruikt om kiemvrije bladeren te verkrijgen om axeenbladetende insecten te achterhalen die zijn afgeleid van oppervlaktegesteriliseerde eieren, en dat deze methode niet wordt beperkt door kunstmatige diëten.Deze methode is handig en verhoogt de zichtbaarheid van het behoud van axeeninsecten voor toekomstige darmbacteriënstudies, vooral voor niet-modelinsecten zonder goed ontwikkelde kunstmatige diëten. Houd de P.versicolora-populatie in een groeikamer op 27 graden Celsius en 70% relatieve vochtigheid, met een licht van 16 uur en een donkere fotoperiode van acht uur. Plaats de insecten in geperforeerde plastic dozen met gekanteld nat absorberend papier en voer ze verse populierentakken.Spuit schoon water op absorberend papier om vocht vast te houden en ververs de takken om de twee dagen. Isoleer volwassenen voor ovipositie na verpopping en voer ze zachte bladeren om meer eieren te verkrijgen. Verzamel binnen 24 uur nieuw gelegde eieren en plaats ze gedurende 60 uur op vochtig absorberend papier om axeenlarven te bereiden.Bereid MS-medium in één milligram per milliliter alfa-naftaleenazijnzuur of NAA-stamoplossingen. Voeg in een bioveiligheidskap 50 microliter van de NAA-voorraadoplossing toe aan 500 milliliter MS-medium en schud om goed te mengen. Giet vervolgens ongeveer 50 milliliter per weefselkweekcontainer en wacht op stolling.Steriliseer scalpels en tangen in een alcohollampvlam in de bioveiligheidskap. Snijd drie tot vier centimeter stengelsegmenten met apicale knoppen of laterale knoppen van populierenzaailingen bij ongeveer een maand groei en breng ze in het kweekmedium, een of twee stengelsegmenten per container. Incubeer deze stengelsegmenten ongeveer 30 dagen in een groeikamer.En gebruik deze kiemvrije bladeren om de axeenlarven te voeden. Autoclaaf Petrischaaltjes, verfkwasten, filtreerpapier, gedestilleerd water in een petrischaaltje met LB-agarmedium. Leg bladeren met aanhangende eieren in een petrischaaltje.Verwijder vervolgens voorzichtig de eieren van de bladeren met een tang en breng ze over naar een andere petrischaal. Was deze eieren acht minuten met 75% ethanol. Herhaal vervolgens de was vier keer met steriel water.Breng de eieren over op LB-agarmedium om vocht te behouden voor het uitkomen. Plaats de petrischaal in een groeikamer en wacht tot de eieren binnen 24 uur uitkomen. Tegel in een bioveiligheidskap drie stukken nat filterpapier in een petrischaaltje en plaats kiemvrije populierenbladeren op het papier.Verzamel de larven en plaats ze op de bladeren. Sluit de petrischaal af met Parafilm en incubeer deze in een groeikamer. Vervang de bladeren om de twee dagen.Breng voor de conventioneel gekweekte groepen de eieren van de bladeren over naar een petrischaal met vochtig filterpapier en voed deze larve met kiemvrije populierenbladeren. Selecteer willekeurig drie eerste, tweede en derde instarlarven uit de kiemvrije en conventioneel gekweekte groepen. Ontleed de derde instarlarven met een steriele schaar en tang onder een stereomicroscoop en verzamel hun ingewanden in microcentrifugebuizen.Verzamel intacte eerste en tweede instar larven in buizen. Voeg 100 microliter PBS en drie stalen kogels toe aan de buizen van 1,5 milliliter en maal de weefsels tot homogenaten met behulp van een kralenklophomogenisator. Voeg 100 microliter homogenaat toe aan LB-agarmedium en -plaat met behulp van een steriele glazen spreidstaaf.Incubeer de platen bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. Observeer vervolgens de bacteriekolonies. Extraheer het totale DNA van de eerder verkregen weefsels met behulp van een DNA-extractiekit en meet de DNA-concentratie met een spectrofotometer.Amplify het bacteriële 16S rRNA-gen met behulp van universele 16S rRNA-primers met PCR, waardoor de reactie wordt opgezet zoals beschreven in het teksthandschrift. Bewaar de PCR-producten bij vier graden Celsius tot verdere analyse. Meng de PCR-producten met nucleïnezuurkleurstof en analyseer ze met behulp van elektroforese op een 1% agarose-gel in 1X TAE-buffer.Gebruik 10 microliter van een DNA-marker als referentie. Observeer de gel met een UV-transilluminator en zoek naar het doelfragment rond 1.500 basenparen. Hoewel er geen bacteriekolonies werden waargenomen in een kiemvrije groep, werden ze waargenomen in alle conventioneel gekweekte groepen, wat aangeeft dat larven uit gesteriliseerde eieren die weefsel gekweekte populierenbladeren kregen, geen bacteriën bevatten.De 1.500 basenpaar PCR-banden verschenen in alle conventioneel gekweekte groepen. Daarentegen werd geen band waargenomen in de kiemvrije groepen of de negatieve controle, wat impliceert dat er geen darmbacteriën bestonden in axeenlarven. Voor insectensoorten met kleine eieren moesten de soorten ontsmettingsmiddelen en sterilisatieduur worden geoptimaliseerd.Bovendien moeten endofyten in weefsel gekweekte planten opmerkelijk zijn. Dit protocol biedt een nieuwe methode om kiemvrije insecten te behouden, wat een handig hulpmiddel is om interactiestudies tussen insecten en darmbacteriën te vergemakkelijken, vooral voor niet-modelinsecten zonder goed ontwikkelde kunstmatige diëten.

preparing-rearing-axenic-insects-with-tissue-cultured-seedlings-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates a method to establish a Mycobacterium bovis infection model in the larvae of the greater wax moth, Galleria mellonella. A bioluminescent strain of Mycobacterium bovis BCG is injected into the hemolymph of the larva to establish infection, and the bioluminescence is measured at predefined intervals to study the progress of infection.

A Technique to Establish a Bacterial Infection Model in Insect Larvae

Het doel van deze presentatie is in vivo en in vitro technieken voor het opfokken van entomopathogene nematoden aan te tonen. In vivo methoden beschouwen het fokken van deze nematoden met een insect host, terwijl de in-vitro-methoden maken gebruik van rich media-agar.

In vivo en in vitro kweken van Entomopathogene Nematoden (Steinernematidae en Heterorhabditidea)

De mediterrane fruitvlieg (Ceratitis capitata) (Diptera: Tephritidae) is een wereldwijde plaag in de landbouw. Een dieper begrip van zijn biologie is cruciaal voor het beheersen van fruitvliegpopulaties en daarmee het verminderen van de economische impact. Micro-injectie van embryo's is een fundamenteel hulpmiddel dat zowel transformatie van de kiemlijn als reverse genetica studies in deze soort mogelijk maakt.

Levering van nucleïnezuren door middel van Embryo micro-injectie in de Worldwide Landbouw Pest Insect,<em&gt; Middellandse-Zeevlieg</em

Hier presenteren we protocollen voor het kweken van een intermediair-kiem kever, Dermestes maculatus (D. maculatus) in het lab. We hebben ook protocollen voor de embryonale en ouderlijke RNAi en methodes te delen voor het analyseren van embryonale fenotypes voor bestudering van genfunctie in deze soort.

Grootbrengen en Double-stranded RNA-gemedieerde gen knock-down in het verbergen Kever, Dermestes maculatus

De bladluis Aphis Oleanderpijlstaart koloniseert op zeer verdedigd planten uit de familie van de onderfamilie (Apocyanaceae) en biedt tal van mogelijkheden om te studeren plant-insect interacties. Hier presenteren we een reeks van protocollen voor het onderhoud van de installaties en de bladluis culturen, en de generatie en de analyse van moleculaire en - dienst gegevens voor A. Oleanderpijlstaart.

Behoud van de biologische culturen en meten van de genexpressie in Aphis Oleanderpijlstaart: een Non-modelsysteem voor Plant-insect interacties

Dit artikel schetst basismethoden om belangrijke factoren zoals dichtheid, voerbeschikbaarheid, hydratatiebron en omgevingscontroles te standaardiseren voor het langdurig kweken van laboratoriumculturen van de eetbare krekel, Gryllus bimaculatus.

Het onderhouden van laboratoriumculturen van Gryllus bimaculatus, een veelzijdig orthopteraanmodel voor insectenlandbouw en ongewervelde fysiologie

Entomopathogene nematoden leven in symbiose met bacteriën en samen infecteren ze met succes insecten door hun aangeboren immuunsysteem te ondermijnen. Om onderzoek naar de genetische basis van nematodeninfectie te bevorderen, worden methoden beschreven voor het handhaven en genetisch manipuleren van entomopathogene nematoden.

Kweken en genetisch manipuleren van entomopathogene nematoden

Hier presenteren we een protocol voor het verkrijgen van entomopathogene schimmels van een boshoutboorder en een vervangende manier om hun entomopathogene activiteiten te evalueren met behulp van een Coleoptera-modelinsect. Deze methode is efficiënt en handig voor het verkennen van entomopathogene schimmelbronnen van houtborende insectenplagen in natuurlijke bossen.

Isolatie, gedragsidentificatie en pathogeniteitsbeoordeling van entomopathogene schimmels van een boshoutboorder

Hier presenteren we een methode voor het bestuderen van de winterslaap van coloradokever onder de natuurlijke omstandigheden van de gematigde zone, evenals een techniek voor het verzamelen van kevers in de winter. Deze methode maakt het mogelijk om in elk stadium van de winterslaap een gewenst aantal overwinterende individuen te verkrijgen voor verschillende analyses.

Een experimenteel onderzoek naar de winterslaap van coloradokever onder natuurlijke omstandigheden

Er wordt een eenvoudige procedure beschreven voor het kweken van axenische Delia antiqua met halfgefermenteerde steriele diëten. Met behulp van PCR werd slechts één Wolbachia-stam gedetecteerd in elke instar van axenische D. antiqua .

Kweek van Axenic Delia antiqua met halfgefermenteerde steriele diëten

Leer axenische insecten fokken met weefselgekweekte bladeren voor darmmicrobiota-onderzoek bij bladkevers. Deze methode vermijdt antibiotica en kunstmatige diëten.

Het voorbereiden en fokken van axeeninsecten met weefsel gekweekte zaailingen voor gastheer-darmmicrobiota-interactiestudies van de bladkever (Video) | JoVE Journal

Het voorbereiden en fokken van axeeninsecten met weefsel gekweekte zaailingen voor gastheer-darmmicrobiota-interactiestudies van de bladkever

Meer video's verkennen