Name: Het verkennen van de Arginine Methylome door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Verken de kwantificering van arginine-methylatie met behulp van 1H-NMR-spectroscopie voor biologische monsters. Deze methode ondersteunt kankeronderzoek en patiëntstratificatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk werd ondersteund door de subsidies van het Austrian Science Fund (FWF) P28854, I3792, doc.funds BioMolStruct DOC 130, DK-MCD W1226 BioTechMed-Graz (vlaggenschipproject DYNIMO), austrian research promotion agency (FFG) subsidies 864690 en 870454, het Integrative Metabolism Research Center Graz; Oostenrijks infrastructuurprogramma 2016/2017, de regering van Stiermarken (Zukunftsfonds) en het startupfonds voor talenten op hoog niveau van de Fujian Medical University (XRCZX2021020). We danken het Center of Medical Research voor de toegang tot celkweekfaciliteiten. F.Z. is opgeleid in het kader van het PhD-programma Molecular Medicine, Medical University of Graz. Q.Z. is opgeleid in het kader van het PhD-programma Metabolic and Cardiovascular Diseases, Medical University of Graz.

Gisteiwithydrolysaten werden gebruikt als monsters voor de representatieve resultaten van dit werk. Het hele protocol is samengevat in figuur 1.
1. Bereiding van materialen en reagentia
<ol><li>Methanol/water: bereid een mengsel van twee delen 99% methanol (MeOH) en een deel van H2O, aangeduid als MeOH/H2O. Bewaar pure MeOH en MeOH/H2O bij -20 °C om de alcoholverdamping tot een minimum te beperken en de stabiliteit van het monster te verhogen.</li>
	<li>Zoutzuur (HCl): verdun 9 mol/L uit geconcentreerd HCl (12,0 mol/L of 37%) en 0,1 mol/L HCl. De hoger geconcentreerde (9 mol/L) oplossing wordt gebruikt voor eiwithydrolyse, terwijl de lager geconcentreerde (0,1 mol/L) oplossing wordt gebruikt voor vaste-fase extractie. LET OP: Werk in de zuurkast.</li>
	<li>Bereid een vervangingsoplossing voor SPE die 10% van een verzadigde ammoniakoplossing (voorraad: 30% m/m ammoniak), 50% methanol en 40% water (v/v) bevat.</li>
	<li>NMR-buffer: Los 5,56 g dinatriumwaterstoffosfaat (Na2HPO4, 0,08 mol/L), 0,4 g 3-(trimethylsilyl)propionzuur-2,2,3,3-d4 natriumzout (TSP, 5 mmol/l), 0,04 % (m/v) natriumazide (NaN3) op in 500 ml deuteriumdioxide (D2O) en stel aan tot pH 7,4 (met HCl of NaOH, respectievelijk) (zie materiaaltabel). Controleer de zuiverheid van elke nieuwe bufferbatch met NMR-spectroscopie. OPMERKING: De hoeveelheid verontreinigingen (bijv. ethanol) moet zo laag mogelijk zijn.</li>
	<li>Vul pulpbuizen met zirkoniumoxidekorrels (buizen van 2 ml en kralen van 1,4 mm zijn geschikt voor de meeste toepassingen, maar er zijn verschillende varianten beschikbaar) (zie materiaaltabel). Vul ongeveer 10-20 kralen met de hand of koop voorgevulde buizen, die ook beschikbaar zijn.</li>
	<li>Houd pipetten en de respectievelijke uiteinden klaar in het bereik van 10-1.000 μL. OPMERKING: Zeer zuiver water, aangeduid als H2O, gedefinieerd door een hoge weerstand van ≥18,2 MΩ·cm-1, werd tijdens het hele werk gebruikt. Het komt overeen met dubbel gedestilleerd water.</li>
</ol>2. Monsterverzameling en -opslag
<ol><li>Flash bevries de vloeibare monsters (serum/plasma, celkweek supernatant, enz.) met vloeibare stikstof en bewaar ze bij -80 °C tot gebruik.</li>
	<li>Bereid de vaste materialen zoals hieronder vermeld.<ol><li>Verzamel de cellen uit celculturen (3-5 miljoen cellen) door het verzamelen van aanhangende cellen, na het wassen met koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing, schrapen en centrifugatie, of directe centrifugatie van cellen gekweekt in suspensie.</li>
		<li>Verwijder de celsupernatanten (die kunnen worden verzameld voor verdere analyse, hetzij door opeenvolgende directe metingen, zie stap 6, of na precipitatie van oplosbare eiwitten, zie stap 3.1), en vries de pellets vervolgens in met vloeibare stikstof en bewaar ze bij -80 °C. Zie voor verdere verwerking stap 3.2.</li>
		<li>Bewaar en verzamel de weefsels volgens het doel van het onderzoek. Voor zeer homogene weefsels, zoals de lever of spier, analyseert u elk deel ervan. Bepaal bijvoorbeeld in het geval van een muizenbrein de globale argininemethylatie van de hele hersenen of hersensecties. OPMERKING: Het ideale gewicht van de te verwerken weefsels is 30-60 mg. Het is raadzaam om de hele hersenen in te vriezen en te verpulveren en daarvan aliquots te gebruiken. Als alternatief kunnen specifieke hersendelen (bijv. Frontale, cerebellum, occipitale regio's of één hemisfeer, met een gewicht van ~ 250 mg) worden gebruikt.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Voorlopige monstervoorbereiding
OPMERKING: Voer het werk uit op ijs en houd MeOH koud. De monsters moeten ook op ijs worden bewaard om eiwitafbraak te voorkomen.
<ol><li>Voeg voor vloeibare monsters 400 μL ijskoude methanol toe aan 200 μL van het monster. Ga verder met stap 3.3. OPMERKING: Als er minder monster beschikbaar is, pas dan de volumes dienovereenkomstig aan; De NMR-gevoeligheid is meestal hoog genoeg voor kleinere monsterhoeveelheden, maar moet individueel worden getest.</li>
	<li>Bereid in het geval van vaste materialen voldoende buizen van 1,5 ml voor de lysaten (gebruik voor centrifugatie na homogenisatie).<ol><li>Resuspenseer de celpellets voorzichtig, maar grondig, in 600 μL MeOH/H2O en breng de gehele vloeibare fase over in de pulpbuizen.</li>
		<li>Plaats weefsels in pulpbuizen (u kunt ze direct in de buizen wegen) en voeg 600 μL MeOH / H2O toe (voor 30-60 mg; pas aan als het gewicht aanzienlijk verschilt).</li>
		<li>Plaats de buisjes in de weefselhomogenisator (zie Materiaaltabel) en homogeniseer één keer gedurende 20 s met zwaar schudden (voor celpellets, zachte weefsels) of twee keer gedurende 20 s elk (of langer indien nodig) met een interval van 5 minuten ertussen (voor stijve weefsels).</li>
		<li>Na homogenisatie, onmiddellijk monsters op het ijs opnieuw en breng de hele lysaten over in nieuwe 1,5 ml buizen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bewaar monsters gedurende ten minste 30 minuten (tot enkele dagen) bij -20 °C voor verdere verwerking.</li>
	<li>Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Bereid in de tussentijd voldoende buizen van 1,5 ml om de supernatanten te verzamelen. OPMERKING: Dit supernatant (aangeduid als "(1)" in figuur 1) kan worden weggegooid, gelyofiliseerd en direct worden verwerkt voor NMR (stap 6) of anderszins worden geanalyseerd.</li>
	<li>In dit protocol wordt het MeOH-neerslag (= pellet verkregen na respectievelijk stap 3.1 of 3.2.2) gebruikt voor verdere analyse met onder andere componenten zoals nucleïnezuren en lipiden, arginine-gemethyleerde eiwitten. Ga verder met eiwithydrolyse of bewaar de pellets enkele dagen bij -20 °C.</li>
</ol>4. Eiwithydrolyse
<ol><li>Voeg 500 μL 9 mol/L HCl toe aan elk monster. Knip vervolgens de doppen van elke buis af met een schaar en plaats ze in de glazen kweekbuizen (figuur 2A). Sluit voorzichtig, maar goed, de rode doppen (controleer daarbij de afdichting). OPMERKING: Controleer voor gebruik altijd elke afdichting (grijze PTFE-folie in de rode schroefdoppen) op een goede aanscherping en reinig ze regelmatig met water.</li>
	<li>Als u klaar bent, plaatst u de buizen in een bekerglas dat gedeeltelijk is gevuld met zand (voor een betere warmteoverdracht) en hydrolyseer u monsters gedurende ongeveer 16 uur bij 110 °C in een droogkamer.</li>
	<li>Koel na hydrolyse de monsters af (~ 1 uur).</li>
	<li>Daarna 's nachts lyofieliseren met behulp van een centrifuge met een hoog vacuüm (minder dan 100 Pa).</li>
	<li>Los de pellets op - indien volledig droog (zo niet, ga door met lyofiliëren) - in 1 ml 0,1 mol / L HCl en voeg 50 μL chloroform (CHCl3) toe aan elke buis; los de pellet grondig op met een pipet van 1.000 μL, meng daarbij de vloeistoffen en breng vervolgens het volledige volume over in een nieuwe buis. LET OP: Werk altijd met kleine hoeveelheden om uitgebreide verdamping te minimaliseren</li>
	<li>Centrifugeer vervolgens op 8.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verzamel de bovenste fase van de bifasische vloeistof die de in water oplosbare fractie bevat (figuur 2B, de fractie met de onderste dichtheid) zorgvuldig met een pipet en vul deze in nieuwe buizen. Gebruik buizen van 1,5 ml voor handmatige SPE (punt 5.2) of glazen injectieflacons voor robotische SPE (punt 5.3 en figuur 2D). Vermijd morsen over CHCl3 en de inhoud ervan (figuur 2C).</li>
</ol>5. Vaste-fase extractie (SPE)
<ol><li>Reinig de SPE-cartridges vóór het eerste gebruik twee keer met 1 ml van de vervangende oplossing (stap 1.3), gevolgd door centrifugatie bij 800 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (geplaatst in buizen van 15 ml). Ze kunnen elk 10-20 keer worden gebruikt.</li>
	<li>Handleiding SPE<ol><li>Conditioneer de cartridges (zie materiaaltabel) in elke run met 1 ml zuivere methanol en 2 x 1 ml PBS, telkens gevolgd door centrifugatie bij 800 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (geplaatst in buizen van 15 ml).</li>
		<li>Laad daarna de monsters (uit stap 4.7) op de SPE-patronen en centrifugeer ze bij 600 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Breng vervolgens een wascyclus aan zoals hieronder vermeld.<ol><li>Voeg driemaal 1 ml H2O toe (elk gevolgd door centrifugeren gedurende 1 minuut bij 800 x g bij kamertemperatuur).</li>
			<li>Voeg vijf maal 1 ml 0,1 mol/l HCl toe (elk gevolgd door centrifugatie gedurende 1 minuut bij 800 x g bij kamertemperatuur).</li>
			<li>Voeg twee keer 1 ml MeOH toe (elk gevolgd door centrifugatie gedurende 1 minuut bij 800 x g bij kamertemperatuur).</li>
		</ol></li>
		<li>Eluate vervolgens arginine en zijn derivaten met 3 x 1 ml vervangende oplossing (gevolgd door centrifugatie 1 min bij 800 x g bij kamertemperatuur) in een enkele buis van 15 ml. OPMERKING: De vervangende oplossing dient als eluent voor arginine en derivaten en wordt ook gebruikt voor het reinigen van de patronen (alle stoffen worden ofwel vóór elutie uitgewassen of bij de basis pH-waarde van de vervangende oplossing). Om besmetting in de loop van de tijd te voorkomen, moet het hergebruik echter worden beperkt (zie stap 5.1).</li>
	</ol></li>
	<li>RobotISCHE SPE OPMERKING: Hier wordt een pipetteerrobot (het grootste deel bestaande uit een pipetteernaald, een wasstation voor de naald, een reagenstoevoer en posities voor monsters en eluaten, zie Materiaaltabel) geleverd met een patroonhouder voor de SPE-kolommen. Voor andere instrumenten, zorg ervoor dat u volledig uitgerust bent met alle genoemde dingen.<ol><li>Vul het supernatant (vanaf stap 4.7) rechtstreeks in glazen injectieflacons met PTFE-afdichting (figuur 2D), bereid voldoende reagentia (100 ml van elk, d.w.z. vervangende oplossing, 99% van MeOH, PBS, H2O en 0,1 van mol / L HCl), 5 ml buizen voor elutie en wasoplossing voor de naald van de robot (meestal H2O).</li>
		<li>Gebruik een applicatie of methode in de software van de robot op basis van de stappen die zijn beschreven voor handmatige SPE (stap 5.2). OPMERKING: De details kunnen sterk variëren tussen instrumentleveranciers, dus raadpleeg de softwarehandleiding van de betreffende robot voor het programmeren. Een pipetteerrobot werkt meestal door luchtdruk op de cartridges uit te oefenen in plaats van centrifugatie, wat het belangrijkste verschil is. Als het protocol wordt vastgesteld en voor de eerste keer wordt uitgevoerd, neem dan controles op (bijv. L-arginine van bekende concentratie) om een optimale workflow te verifiëren.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Laatste voorbereiding op NMR
<ol><li>Lyofiliseer monsters 's nachts om de droogheid te voltooien om ammoniak en H2O te verwijderen.</li>
	<li>Los elk monster op in 500 μL NMR-buffer (stap 1.4) en breng over in NMR-buizen. Belangrijk is dat het volume in alle buizen hetzelfde moet zijn en dat monsters homogeen moeten zijn (vrij van residuen en lipiden, die de neiging hebben om te aggregeren). OPMERKING: De details van NMR-spectroscopie gaan verder dan deze methodebeoordeling en worden elders in meer detail beschreven27. Hier worden alleen de belangrijkste vereisten en stappen uitgelegd. De kwantificering van arginine en zijn metabolieten worden uitgevoerd op een 600 MHz NMR-spectrometer (zie Materiaaltabel). In principe kunnen alle andere NMR-spectrometer/NMR-veldsterkten worden gebruikt, op voorwaarde dat de NMR-signalen van arginine en gemethyleerde arginineen met voldoende gevoeligheid en zonder signaaloverlapping kunnen worden gedetecteerd. Elke sondekop met z-asgradiënten die 1H-spectra kunnen registreren, kan worden gebruikt, op voorwaarde dat de pulssequenties dienovereenkomstig worden ingesteld.</li>
	<li>Neem een 1D-spectrum op met behulp van de CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill) pulssequentie 33,34 (cpmgpr1d, 512 scans, grootte van fid 73728, 11904,76 Hz spectrale breedte op een 600 MHz NMR, recyclevertraging 4 s) met watersignaalonderdrukking met behulp van voorverzadiging.</li>
	<li>Verwijder in deze experimenten de 1H scalaire koppelingen door virtuele ontkoppeling, waardoor de signaaloverlapping wordt verminderd. Noteer aanvullend voor specifieke vragen en/of complexe monsters of matrices, bijvoorbeeld 1 H-13C-heteronucleaire single quantum coherence (HSQC) spectra27. OPMERKING: Voor complexere matrices waarin 1H NMR-signalen van gemethyleerde arginineen gedeeltelijk kunnen worden overlapt met 1H NMR-signalen van andere metabolieten (bijv. lysine), zijn 1H homo-nucleaire J-opgeloste spectra (JRES)35 vereist.</li>
	<li>Voer absolute kwantificering uit door de respectieve piekintensiteiten van normen van een bekende concentratie te integreren, bijvoorbeeld 100 μmol / arginine. OPMERKING: Routinematig worden ADMA, SDMA en MMA (zie Tabel van materialen) gerapporteerd als een verhouding ten opzichte van arginine. Dit heeft een belangrijk voordeel dat er geen afzonderlijke normalisatie (bijv. Celnummer, weefselmassa, eiwitconcentraties) hoeft te worden uitgevoerd. In dat geval dient arginine als een interne standaard en is relatieve kwantificering voldoende om biologisch relevante informatie te verkrijgen.</li>
	<li>Voor differentiatie van SDMA en MMA, lyofiliseer de monsters opnieuw om D2O te verwijderen (als ze eerder in NMR-buffer zijn geresuspendeerd), dat vervolgens wordt vervangen door gedeutereerd dimethylsulfoxide (d6-DMSO), waardoor de resolutie van methylresonanties mogelijk wordt27. Zuig daarom de monsters uit de NMR-buizen op met Pasteur-pipetten, lyofieliseer en los ze op in 500 μL d 6-DMSO.</li>
</ol>

<ol><li>Guccione, E., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation%2C+functions+and+clinical+relevance+of+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The regulation, functions and clinical relevance of arginine methylation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).</li>
<li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+in+mammals%3A+who%2C+what%2C+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+immediate-early+TIS21+protein+and+the+leukemia-associated+BTG1+protein+interact+with+a+protein-arginine+N-methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (25), 15034-15044 (1996).</li>
<li>Bachand, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferases%3A+from+unicellular+eukaryotes+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferases: from unicellular eukaryotes to humans.</a> Eukaryotic Cell. 6 (6), 889-898 (2007).</li>
<li>Wang, Y. C., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionarily+conserved+protein+arginine+methyltransferases+in+non-mammalian+animal+systems%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Evolutionarily conserved protein arginine methyltransferases in non-mammalian animal systems.</a> FEBS Journal. 279 (6), 932-945 (2012).</li>
<li>Ahmad, A., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+PRMTs+broaden+the+scope+of+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Plant PRMTs broaden the scope of arginine methylation.</a> Journal of Genetics and Genomics. 39 (5), 195-208 (2012).</li>
<li>Fisk, J. C., Read, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+in+parasitic+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation in parasitic protozoa.</a> Eukaryotic Cell. 10 (8), 1013-1022 (2011).</li>
<li>Hofweber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+Separation+of+FUS+Is+Suppressed+by+Its+Nuclear+Import+Receptor+and+Arginine+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phase Separation of FUS Is Suppressed by Its Nuclear Import Receptor and Arginine Methylation.</a> Cell. 173 (3), 706-719 (2018).</li>
<li>Chong, P. A., Vernon, R. M., Forman-Kay, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGG%2FRG+Motif+Regions+in+RNA+Binding+and+Phase+Separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RGG/RG Motif Regions in RNA Binding and Phase Separation.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (23), 4650-4665 (2018).</li>
<li>Nott, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transition+of+a+disordered+nuage+protein+generates+environmentally+responsive+membraneless+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Phase transition of a disordered nuage protein generates environmentally responsive membraneless organelles.</a> Molecular Cell. 57 (5), 936-947 (2015).</li>
<li>Fong, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+targeting+of+RNA+splicing+catalysis+through+inhibition+of+protein+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Therapeutic targeting of RNA splicing catalysis through inhibition of protein arginine methylation.</a> Cancer Cell. 36 (2), 194-209 (2019).</li>
<li>Yang, Y., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferases and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).</li>
<li>Wang, S. M., Dowhan, D. H., Muscat, G. E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+arginine+methylation+in+breast+cancer%3A+emerging+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic arginine methylation in breast cancer: emerging therapeutic strategies.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 62 (3), 223-237 (2019).</li>
<li>Gulla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferase+5+has+prognostic+relevance+and+is+a+druggable+target+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferase 5 has prognostic relevance and is a druggable target in multiple myeloma.</a> Leukemia. 32 (4), 996-1002 (2018).</li>
<li>Wang, Z., Tang, W. H., Cho, L., Brennan, D. M., Hazen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+metabolomic+evaluation+of+arginine+methylation+and+cardiovascular+risks%3A+potential+mechanisms+beyond+nitric+oxide+synthase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeted metabolomic evaluation of arginine methylation and cardiovascular risks: potential mechanisms beyond nitric oxide synthase inhibition.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (9), 1383-1391 (2009).</li>
<li>Friesen, W. J., Massenet, S., Paushkin, S., Wyce, A., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMN%2C+the+product+of+the+spinal+muscular+atrophy+gene%2C+binds+preferentially+to+dimethylarginine-containing+protein+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">SMN, the product of the spinal muscular atrophy gene, binds preferentially to dimethylarginine-containing protein targets.</a> Molecular Cell. 7 (5), 1111-1117 (2001).</li>
<li>Lee, J. H., Park, G. H., Lee, Y. K., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+arginine+methylation+of+organ+proteins+during+the+development+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Changes in the arginine methylation of organ proteins during the development of diabetes mellitus.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 94 (1), 111-118 (2011).</li>
<li>Bulau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+methylarginine+metabolism+in+the+cardiovascular+system+identifies+the+lung+as+a+major+source+of+ADMA%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of methylarginine metabolism in the cardiovascular system identifies the lung as a major source of ADMA.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 292 (1), 18-24 (2007).</li>
<li>Zakrzewicz, D., Eickelberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+arginine+methylation+to+ADMA%3A+a+novel+mechanism+with+therapeutic+potential+in+chronic+lung+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pulmonary+Medicine%22%5BJournal%5D)">From arginine methylation to ADMA: a novel mechanism with therapeutic potential in chronic lung diseases.</a> BMC Pulmonary Medicine. 9, 5(2009).</li>
<li>Fulton, M. D., Brown, T., Zheng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+axis+of+protein+arginine+methylation+and+asymmetric+dimethylarginine%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The biological axis of protein arginine methylation and asymmetric dimethylarginine.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), (2019).</li>
<li>Aliferis, K. A., Chrysayi-Tokousbalides, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+in+pesticide+research+and+development%3A+review+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Metabolomics in pesticide research and development: review and future perspectives.</a> Metabolomics. 7 (1), 35-53 (2011).</li>
<li>Chiang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT5+Is+a+Critical+Regulator+of+Breast+Cancer+Stem+Cell+Function+via+Histone+Methylation+and+FOXP1+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">PRMT5 Is a Critical Regulator of Breast Cancer Stem Cell Function via Histone Methylation and FOXP1 Expression.</a> Cell Reports. 21 (12), 3498-3513 (2017).</li>
<li>Blanc, R. S., Vogel, G., Chen, T., Crist, C., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT7+preserves+satellite+cell+regenerative+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">PRMT7 preserves satellite cell regenerative capacity.</a> Cell Reports. 14 (6), 1528-1539 (2016).</li>
<li>Lim, Y., Lee, E., Lee, J., Oh, S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+asymmetric+arginine+methylation+during+replicative+and+H2O2-induced+premature+senescence+in+WI-38+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of asymmetric arginine methylation during replicative and H2O2-induced premature senescence in WI-38 human diploid fibroblasts.</a> Journal of Biochemistry. 144 (4), 523-529 (2008).</li>
<li>Bhatter, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation+augments+Sbp1+function+in+translation+repression+and+decapping%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation augments Sbp1 function in translation repression and decapping.</a> FEBS Journal. 286 (23), 4693-4708 (2019).</li>
<li>Lee, Y. H., Stallcup, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+protein+arginine+methylation+of+nonhistone+proteins+in+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation.</a> Molecular Endocrinology. 23 (4), 425-433 (2009).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Methods%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein arginine methylation.</a> Cell Reports Methods. 1 (2), (2021).</li>
<li>Zinellu, A., Sotgia, S., Scanu, B., Deiana, L., Carru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein-incorporated+methylated+arginine+reference+values+in+healthy+subjects+whole+blood+and+evaluation+of+factors+affecting+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of protein-incorporated methylated arginine reference values in healthy subjects whole blood and evaluation of factors affecting protein methylation.</a> Clinical Biochemistry. 41 (14-15), 1218-1223 (2008).</li>
<li>Weiss, M., Manneberg, M., Juranville, J. F., Lahm, H. W., Fountoulakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+hydrolysis+method+on+the+determination+of+the+amino+acid+composition+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Effect of the hydrolysis method on the determination of the amino acid composition of proteins.</a> Journal of Chromatography A. 795 (2), 263-275 (1998).</li>
<li>Davids, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+asymmetric+and+symmetric+dimethylarginine%2C+L-monomethylarginine%2C+L-arginine%2C+and+L-homoarginine+in+biological+samples+using+stable+isotope+dilution+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of asymmetric and symmetric dimethylarginine, L-monomethylarginine, L-arginine, and L-homoarginine in biological samples using stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 900, 38-47 (2012).</li>
<li>Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+metabolomics+as+emerging+tool+to+study+autophagy+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation.</a> Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).</li>
<li>Vignoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+metabolomics+by+1D+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">High-throughput metabolomics by 1D NMR.</a> Angewandte Chemie International Edition. 58 (4), 968-994 (2019).</li>
<li>Carr, H. Y., Purcell, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+diffusion+on+free+precession+in+nuclear+magnetic+resonance+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review%22%5BJournal%5D)">Effects of diffusion on free precession in nuclear magnetic resonance experiments.</a> Physical Review. 94 (3), 630-638 (1954).</li>
<li>Meiboom, S., Gill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+spin-echo+method+for+measuring+nuclear+relaxation+times%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation times.</a> Review of Scientific Instruments. 29 (8), 688-691 (1958).</li>
<li>Nagayama, K., Wuthrich, K., Bachmann, P., Ernst, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+J-resolved+1H+n.m.r.+spectroscopy+for+studies+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional J-resolved 1H n.m.r. spectroscopy for studies of biological macromolecules.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 78 (1), 99-105 (1977).</li>
<li>Stryeck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+concentrations+of+Citrate%2C+Tyrosine%2C+2-+and+3-+Hydroxybutyrate+are+associated+with+increased+3-month+mortality+in+acute+heart+failure+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Serum concentrations of Citrate, Tyrosine, 2- and 3- Hydroxybutyrate are associated with increased 3-month mortality in acute heart failure patients.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6743(2019).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+landscape+of+metabolic+dysregulation+during+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific landscape of metabolic dysregulation during ageing.</a> Biomolecules. 11 (2), (2021).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+human+hepatocellular+tumors+undergo+a+global+metabolic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Growing human hepatocellular tumors undergo a global metabolic reprogramming.</a> Cancers. 13 (8), (2021).</li>
<li>Pahlich, S., Zakaryan, R. P., Gehring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation%3A+Cellular+functions+and+methods+of+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation: Cellular functions and methods of analysis.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1764 (12), 1890-1903 (2006).</li>
<li>Habisch, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroectodermally+converted+human+mesenchymal+stromal+cells+provide+cytoprotective+effects+on+neural+stem+cells+and+inhibit+their+glial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Neuroectodermally converted human mesenchymal stromal cells provide cytoprotective effects on neural stem cells and inhibit their glial differentiation.</a> Cytotherapy. 12 (4), 491-504 (2010).</li>
<li>Ibanez, G., McBean, J. L., Astudillo, Y. M., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+ultrasensitive+luminescence+assay+for+protein+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled ultrasensitive luminescence assay for protein methyltransferases.</a> Analytical Biochemistry. 401 (2), 203-210 (2010).</li>
<li>Hevel, J. M., Price, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+direct+measurement+of+methyltransferase+activity+in+about+30min%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and direct measurement of methyltransferase activity in about 30min.</a> Methods. 175, 3-9 (2020).</li>
<li>Altincekic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+detection+of+arginine+methylation+in+highly+repetitive+protein+motifs+of+low+sequence+complexity+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Site-specific detection of arginine methylation in highly repetitive protein motifs of low sequence complexity by NMR.</a> Journal of the American Chemical Society. 142 (16), 7647-7654 (2020).</li>
<li>Kaneb, H. M., Dion, P. A., Rouleau, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FUS+about+arginine+methylation+in+ALS+and+FTLD%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The FUS about arginine methylation in ALS and FTLD.</a> The EMBO Journal. 31 (22), 4249-4251 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

In de volgende sectie ligt de primaire focus op de methode zelf; de biologische implicaties van arginine methylatie worden beschreven in de inleiding sectie.
Ten eerste kunnen weefsels van verschillende stijfheid aanpassing van de monsterlyse nodig hebben: cellen uit celkweek (inclusief bacteriën, gist, enz.) en weefsels zoals hersenen, jonge lever, gladde spieren, enz., Kunnen snel worden gehomogeniseerd. Voor weefsels met een hoge stijfheid (inclusief lever van oudere proefpersonen, slagader...

In de afgelopen twee decennia is methylering van arginineresiduen erkend als een essentiële posttranslationele modificatie van eiwitten. Het beïnvloedt fundamentele biologische processen zoals regulatie van transcriptie, signaaltransductie en nog veel meer1. De belangrijkste eiwitten die betrokken zijn bij de regulatie van arginine methylatie zijn eiwit arginine methyltransferasen (PRMTs)2. De belangrijkste derivaten van arginine zijn ω-(NG,N G)-asymmetrisch dimethylarginine (ADMA), ω-(N G,N'G)-symmetrisch dimethylarginine (SDMA) en ω-N G-monomethylarginine (MMA)2.
PRMT's gebruiken S-adenosyl-l-methionine om methylgroepen over te brengen naar de terminale guanidinogroep (met twee equivalente aminogroepen) van eiwitgebonden arginine1. Twee belangrijke enzymen kunnen worden onderscheiden: Zowel type I- als type II-enzymen katalyseren de eerste methylatiestap om MMA te vormen (dat daardoor zijn symmetrie verliest). Na deze stap gebruiken type I-enzymen (bijv. PRMT1, 2, 3, 4, 6, 8) MMA als substraat om ADMA te vormen, terwijl type II-enzymen (voornamelijk PRMT5 en PRMT9) SDMA produceren. PRMT1 was het eerste eiwit arginine methyltransferase dat werd geïsoleerd uit zoogdiercellen3. Toch zijn PRMT's evolutionair geconserveerd4 in andere dieren zoals niet-zoogdier gewervelde dieren, ongewervelde chordaten, stekelhuidigen, geleedpotigen en nematoden cnidarians5, planten6 en protozoa, inclusief schimmels zoals gist7. In veel gevallen leidt knock-out van een van de PRMT's tot verlies van levensvatbaarheid, wat de essentiële rol onthult van gemethyleerde argininesoorten die betrokken zijn bij fundamentele cellulaire processen zoals transcriptie, translatie, signaaltransductie, apoptose en vloeistof-vloeistoffasescheiding (wat de vorming van membraanloze organellen betekent, bijvoorbeeld nucleoli), waarbij regelmatig argininerijke domeinen 8,9,10 betrokken zijn . Dit beïnvloedt op zijn beurt de fysiologie en ziektetoestanden, waaronder kanker 11,12,13, multipel myeloom14, hart- en vaatziekten 15, virale pathogenese, spinale musculaire atrofie16, diabetes mellitus17 en veroudering 1. Verhoogde ADMA-niveaus in de bloedbaan, bijvoorbeeld afgeleid van long18 als gevolg van eiwitafbraak, worden verondersteld verband te houden met endotheeldisfunctie, chronische longziekte19 en andere syndromen van hart- en vaatziekten20. Overexpressie van PRMT's blijkt tumorigenese te versnellen en is geassocieerd met een slechte prognose21,22. Bovendien veroorzaakt ablatie van PRMT6 en PRMT7 een cellulair senescentiefenotype23. Significant verlaagde ADMA en PRMT1 zijn gevonden tijdens de veroudering van WI-38 fibroblasten24.
De uitdaging is om te begrijpen hoe methylatie werkt in (patho)fysiologische processen is het identificeren en kwantificeren van eiwit arginine methylatie. De meeste van de huidige benaderingen gebruiken antilichamen om gemethyleerde arginineen te detecteren. Deze antilichamen zijn echter nog steeds contextspecifiek en herkennen mogelijk geen verschillende motieven van arginine gemethyleerde eiwitten25,26. In het beschreven protocol kunnen alle hierboven genoemde argininederivaten betrouwbaar worden gekwantificeerd door kernspinresonantie (NMR) spectroscopie, d.w.z. alleen, in combinatie, of, zoals in de meeste gevallen, binnen complexe biologische matrices zoals eukaryote cellen (bijv. Van gist, muis of menselijke oorsprong) en weefsels27, evenals serum28. Voor eiwitten en die complexe matrices is eiwithydrolyse29 een voorwaarde om vrije (gemodificeerde) aminozuren te genereren, zoals arginine, MMA, SDMA en ADMA. Vaste-fase extractie (SPE)30 maakt de verrijking van de verbindingen van belang mogelijk. Ten slotte maakt 1H-NMR-spectroscopie de parallelle detectie van arginine en alle belangrijke methylderivaten van arginine mogelijk. NMR-spectroscopie heeft het voordeel dat het echt kwantitatief, zeer reproduceerbaar en een robuuste techniek is31,32. De definitieve NMR-metingen kunnen achteraf worden gedaan wanneer veel monsters zijn verzameld en voorbereid. Tot slot richt dit protocol zich vooral op monstervoorbereiding omdat hiervoor geen eigen NMR-spectrometer nodig is. Het kan worden uitgevoerd in de meeste biochemische laboratoria. Toch worden in dit werk enkele hints gegeven waarop NMR-spectroscopiemetingen moeten worden uitgevoerd.

<table><tbody><tr><td>15 mL tubes</td><td>Greiner Bio One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>3-(trimethylsilyl) propionic acid-2,2,3,3-d4 sodium salt (TSP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A1448</td><td></td></tr><tr><td>5 mL tubes, round bottom</td><td>Greiner Bio One</td><td>115101</td><td></td></tr><tr><td>Ammonia Solution 32%</td><td>Roth</td><td>A990.1</td><td></td></tr><tr><td>Bruker 600 MHz NMR spectrometer, equipped with a TXI probe head</td><td>Bruker</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge, refrigerated, e.g. 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td>5428000010</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform &ge;99% p.a.</td><td>Roth</td><td>3313.1</td><td></td></tr><tr><td>Cryocool</td><td>Thermo Scientific</td><td>SCC1</td><td>heat transfer fluid for SpeedVac System</td></tr><tr><td>Deuterium Oxide (D2O)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-10-PK</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide-d6 (d6-DMSO)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-6-1000</td><td></td></tr><tr><td>Drying Chamber</td><td>Binder</td><td>9090-0018</td><td></td></tr><tr><td>DURAN culture tubes, 13 x 100mm, GL 14, 9 mL</td><td>VWR International</td><td>212-0375</td><td></td></tr><tr><td>Edwards Deep vacuum oil pump RV5</td><td>Thermo Scientific</td><td>16234611</td><td>part of the SpeedVac System</td></tr><tr><td>Eppendorf 1.5 mL tubes</td><td>Greiner Bio One</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>Gilson pipetting robot GX-241 Aspec</td><td>Gilson Inc.</td><td>26150008</td><td></td></tr><tr><td>L-arginine</td><td>AppliChem</td><td>A3675</td><td></td></tr><tr><td>Methanol &ge;99%</td><td>Roth</td><td>8388.4</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water aparatus</td><td>Millipore</td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>Oasis MCX 1cc/30 mg, 1 mL cartridges</td><td>Waters</td><td>186000252</td><td>https://www.waters.com/waters/en_US/Waters-Oasis-Sample-Extraction-SPE-Products/</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Lonza</td><td>LONBE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 tissue homogenizer</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000669-PR240-A</td><td>https://www.bertin-instruments.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys24-tissue-homogenizer/</td></tr><tr><td>Precellys tubes (pulping tubes)</td><td>VWR International</td><td>432-0351</td><td></td></tr><tr><td>Precellyse 1.4 mm zirconium oxide beads</td><td>VWR International</td><td>432-0356</td><td></td></tr><tr><td>Reacti-Therm/ReactiVap Heating, Stirring, and Evaporation Modules</td><td>Thermo Scientific</td><td>TS-18820</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/TS-18820</td></tr><tr><td>Rotor for 1.5 mL tubes, FA-45-30-11</td><td>Eppendorf</td><td>5427753001</td><td></td></tr><tr><td>Savant Refrigerated Cooling Trap</td><td>Thermo Scientific</td><td>15996161</td><td>part of the SpeedVac System</td></tr><tr><td>Savant SpeedVac vacuum concentrator SPD210</td><td>Thermo Scientific</td><td>15906181</td><td>part of the SpeedVac System; equipped with rotor for 1.5 ml tubes</td></tr><tr><td>Screw caps for glas vials with PTFE sealing, DN9</td><td>Dr. R. Forche Chromatographie</td><td>CT11B3011</td><td></td></tr><tr><td>Seasand</td><td>Roth</td><td>8441.3</td><td></td></tr><tr><td>Short thread glas vials 1.5 mL, ND9</td><td>Dr. R. Forche Chromatographie</td><td>VT1100309</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide (NaN3)</td><td>Roth</td><td>K305.1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>VWR</td><td>BDH7363-4</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>80731-078</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 4.0 (Software)</td><td>Bruker</td><td>-</td><td>https://www.bruker.com</td></tr><tr><td>&omega;-NG-asymmetric dimethylarginine (ADMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-208093</td><td></td></tr><tr><td>&omega;-NG-monomethylarginine (MMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200739A</td><td></td></tr><tr><td>&omega;-NG-NG'-symmetric dimethylarginine (SDMA)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202235A</td><td></td></tr></tbody></table>

het verkennen van de arginine methylome door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Exploring the Arginine Methylome by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Eiwitgebonden arginine wordt vaak gemethyleerd in veel eiwitten en reguleert hun functie door de fysisch-chemische eigenschappen te veranderen, hun interactie met andere moleculen, waaronder andere eiwitten of nucleïnezuren. Dit werk presenteert een gemakkelijk implementeerbaar protocol voor het kwantificeren van arginine en zijn derivaten, waaronder asymmetrisch en symmetrisch dimethylarginine (respectievelijk ADMA en SDMA) en monomethyl arginine (MMA). Na eiwitisolatie van biologische lichaamsvloeistoffen, weefsels of cellysaten wordt een eenvoudige methode voor homogenisatie, precipitatie van eiwitten en eiwithydrolyse beschreven. Omdat de hydrolysaten veel andere componenten bevatten, zoals andere aminozuren, lipiden en nucleïnezuren, is een zuiveringsstap met behulp van vastefase-extractie (SPE) essentieel. SPE kan handmatig worden uitgevoerd met behulp van centrifuges of een pipetteerrobot. De gevoeligheid voor ADMA met behulp van het huidige protocol is ongeveer 100 nmol / L. De bovengrens van detectie voor arginine is 3 mmol / L als gevolg van SPE-verzadiging. Samenvattend beschrijft dit protocol een robuuste methode, die zich uitstrekt van biologische monstervoorbereiding tot NMR-gebaseerde detectie, en waardevolle hints en valkuilen biedt voor succesvol werk bij het bestuderen van het argininemethyloom.

Routinematig worden 1H 1D-projecties van 2D J-opgeloste (JRES), vrijwel ontkoppelde NMR-spectra gebruikt voor piektoewijzingen en kwantificeringen in ons laboratorium36. Figuur 3 toont representatieve JRES-spectra van gisteiwithydrolysaten gezuiverd met behulp van het huidige SPE-protocol. Hoewel in zeer verschillende concentraties, kunnen beide stoffen worden gescheiden en gekwantificeerd in een cellulaire matrix. Op basis van het aantal protonen van de sp...

Het huidige protocol beschrijft de bereiding en kwantitatieve meting van vrije en eiwitgebonden arginine en methyl-arginineen door 1H-NMR spectroscopie.

Het verkennen van de Arginine Methylome door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Protein-bound arginine is commonly methylated in many proteins and regulates their function by altering the physicochemical properties, their interaction ...

Dit protocol maakt het mogelijk om niveaus en dynamiek van arginine methylatie te kwantificeren. Deze modificatie speelt een belangrijke regulerende rol en kan dienen als een biomarker voor ziekte. Het voordeel van deze methode is dat het een eenvoudige workflow biedt voor een bijna onbeperkt aantal matrices, variërend van cellen, media tot weefsels en biovloeistoffen.Arginine methylatie is verhoogd in veel menselijke kankers en de eerste remmers van arginine methode transferasen worden getest in klinische proeven. Deze methode kan helpen bij de stratificatie van patiënten en risicobeoordeling. Hansjorg Habisch, een onderzoekstechnicus uit mijn laboratorium, demonstreert de procedure.Voeg voor vloeibare monsters 400 microliter ijskoude methanol toe aan 200 microliter van het monster, gevolgd door incubatie gedurende 30 minuten bij min 20 graden Celsius. Centrifugeer dit monster bij 10.000 G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Verplaats het supernatant en verzamel de pellet in buizen van 1,5 milliliter.Voeg voor vaste materialen 600 microliter 66% methanolwater toe aan pulpbuizen met 30 tot 60 milligram weefsel of celpellets. Homogeniseer het zachte weefsel één keer gedurende 20 seconden en het stijve weefsel twee keer gedurende 20 seconden met een interval van vijf minuten ertussen. Plaats het monster onmiddellijk op ijs en breng al het lysaat over in een nieuwe buis van 1,5 milliliter, gevolgd door incubatie.Centrifugeer het monster vervolgens gedurende 30 minuten op 10.000 G. Selecteer bij vier graden Celsius het supernatant in buisjes van 1,5 milliliter en ga verder met eiwithydrolyse met behulp van dit supernatant. Kort de doppen van elke buis af.Voeg vervolgens 500 microliter van negen molaire zoutzuur toe aan elk monster. Tot slot, doe de buizen in glazen buizen. Sluit ze goed af met doppen, zorg voor een goede afdichting, en plaats deze buizen in een glazen bekerglas dat gedeeltelijk gevuld is met zand.Hydrolyseer de monsters gedurende 16 uur bij 110 graden Celsius in een droogkamer. Koel de monsters af en lyofiel ze een nacht met behulp van een hoogvacuümcentrifuge. Los de volgende dag volledig gedroogde pellets op in één milliliter zoutzuur van 0,1 molair zoutzuur.Voeg 50 microliter chloroform toe aan elke buis en los de pellet grondig op met een pipet van 1.000 microliter. Breng het volledige volume over in een nieuwe buis en centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten. Verzamel zorgvuldig de bovenste fase van de bifasische vloeistof in een nieuwe buis.Gebruik plastic buizen voor handmatige of glazen buizen voor robotische vaste fase extractie. Voor handmatige extractie van vaste fasen moet u de cartridges in elke run vooraf conditioneren, gevolgd door een centrifugatie van één minuut. Laad daarna het monster op SPE-patronen en centrifugeer ze gedurende twee minuten bij kamertemperatuur op 600 G.Was de patronen drie keer met één milliliter water, elke wasbeurt gevolgd door centrifugeren gedurende één minuut. Was vervolgens vijf keer met één milliliter 0,1 molair zoutzuur, gevolgd door centrifugatie gedurende één minuut bij 800 G bij kamertemperatuur. Was de patronen twee keer met één milliliter methanol, gevolgd door centrifugatie gedurende één minuut.Elute arginine en zijn derivaten in een enkele buis van 15 milliliter door een milliliter van drie X-vervangingsoplossing toe te voegen en twee keer gedurende één minuut te centrifugeren. Voor robotextractie van vaste fasen plaatst u buizen voor het verzamelen van eluaten en de glazen buizen die de bovenste fase van de bifasische vloeistof bevatten in de respectieve positie van de robot. Gebruik een toepassing of methode in de software op basis van de stappen die worden beschreven voor handmatige SPE.Lyofiliseer de monsters 's nachts om volledig te drogen om ammoniak en water kwijt te raken. Los elk monster op in 500 microliter NMR-buffer totdat het homogeen wordt. Breng vervolgens een gelijke hoeveelheid homogeen monster over naar elke NMR-buis.J-RES spectra van gisteiwithydrolysaten gezuiverd met behulp van het SPE-protocol worden hier weergegeven. Verschillende karakteristieke chemische verschuivingen kunnen L-arginine en ADMA onderscheiden op 3,25 en 3,02 delen per miljoen. Beide stoffen kunnen worden gescheiden en gekwantificeerd in een cellulaire matrix.Op basis van het aantal protonen van de specifieke methyl- of methyleengroep bij de respectieve chemische verschuiving, maakt één H-kernspinresonantiespectroscopie nauwkeurige kwantificering mogelijk. Met behulp van deze benadering kunnen de ene H nucleaire magnetische resonantie chemische verschuivingen van SDMA en MMA worden gescheiden en gekwantificeerd door karakteristieke chemische verschuivingen op 2,76 delen per miljoen SDMA en 2,74 delen per miljoen MMA. Verzamel bij het uitvoeren van dit protocol zorgvuldig de bovenste fase van de bifasische vloeistof die de in water oplosbare fractie bevat met een pipet en breng deze over naar nieuwe buizen.Gebruik buizen van 1,5 milliliter voor handmatige SPE of klasseglas voor robotische SPE. Vermijd morsen over chloroform en de inhoud ervan. De eluaten die arginine bevatten en de gemethyleerde arginine soorten worden geanalyseerd met behulp van NMR-spectroscopie.Dit levert absolute hoeveelheden van deze soorten op. Onze technologie wordt momenteel gebruikt in een overvloed aan fundamentele onderzoeksprojecten gericht op het ontleden van de pathofysiologische rol van argininemethylatie. Bovendien evalueren we eiwit arginine methylatie als een biomarker kandidaat in verschillende menselijke ziekten.

exploring-arginine-methylome-nuclear-magnetic-resonance

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Twee methoden voor het toewijzen van de α- en ε-dimethylamine nucleaire magnetische resonantiesignalen van een reductief 13C-gemethyleerd N-terminaal lysine worden beschreven. De ene methode maakt gebruik van de pH-geïnduceerde selectiviteit van de reductieve methyleringsreactie, en de andere maakt gebruik van aminopeptidase om selectief het N-terminale lysine te verwijderen.

Methoden om de NMR-resonanties van de 13C-Dimethyl N-terminale amine op reductief gemethyleerde eiwitten te identificeren

Protein arginine methylatie, gekatalyseerd door een klasse van enzymen nl. Proteïne arginine methyl transferase (PRMTs), het proces van enzymatische additie van methylgroep (en) arginines in eiwitten. De in-vitro-methylatie test is de meest betrouwbare instrument voor de beoordeling van de methylatie status van bekende of nieuwe PRMT substraten.

In vitro Methylatietest Assay om Protein Arginine methylatie Bestudeer

Peptidarrays gesynthetiseerd door de SPOT-methode kunnen worden gebruikt om de substraatspecificiteit van proteïne lysine methyltransferases (PKMTs) te analyseren en om het substraatspectrum van PKMTs te definiëren om hun biologische rol te begrijpen. Dit protocol beschrijft hoe peptidearrays te synthetiseren, ze te methyleren met PKMTs en de resultaten te analyseren.

Specificiteit analyse van eiwit-lysine methyltransferases Met behulp van SPOT Peptide Arrays

DNA-methylatie is in staat om stabiele niveaus van genregulatie te handhaven, evenals dynamische veranderingen in genregulatie mogelijk te maken als reactie op verschillende stimuli. We beschrijven technieken die het mogelijk maken om gen-specifieke veranderingen in DNA-methylatie en de invloed van deze veranderingen op genregulatie te bestuderen.

Correleren Gen-specifieke DNA-methylatie Wijzigingen met Expression en transcriptionele activiteit van de astrocyten<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

Dit protocol beschrijft de reconstructie van nucleosomen die differentieel-isotoop gemerkte zus histonen. Tegelijkertijd asymmetrisch post-translationeel gemodificeerde nucleosomen worden gegenereerd na het gebruik van een histon premodified kopie. Deze preparaten kunnen gemakkelijk worden gebruikt om wijzigingen crosstalk mechanismen bestuderen, gelijktijdig op beide zus histonen, met behulp van hoge-resolutie NMR-spectroscopie.

Reconstructie van Nucleosomen met Differentieel Isotopen-gelabelde Sister Histon

Protein Arginine (R)-methylatie is een wijdverspreide posttranslationele modificatie die meerdere biologische routes reguleert. Massaspectrometrie is de beste technologie om het R-methylproteoom wereldwijd te profileren, wanneer gekoppeld aan biochemische benaderingen voor gemodificeerde peptideverrijking. De workflow die is ontworpen voor de identificatie met hoge betrouwbaarheid van globale R-methylatie in menselijke cellen wordt hier beschreven.

Een op massaspectrometrie gebaseerde proteomics-benadering voor wereldwijde en betrouwbare eiwit-R-methylatieanalyse

Deze protocollen bieden de methodologie die wordt gebruikt om de enzymatische activiteit van individuele leden van de eiwit arginine methyltransferase (PRMT) familie in cellen te beoordelen. Gedetailleerde richtlijnen voor het beoordelen van PRMT-activiteit met behulp van endogene en exogene biomarkers, methyl-arginine-herkennende antilichamen en remmertoolverbindingen worden beschreven.

Kwantitatieve methoden voor het bestuderen van eiwit Arginine Methyltransferase 1-9 activiteit in cellen

Hier presenteren we een protocol waarin de verwerving, verwerking en analyse van een reeks NMR-experimenten wordt beschreven die gericht zijn op het karakteriseren van eiwit-glycaaninteracties in oplossing. De meest voorkomende op liganden gebaseerde en op eiwitten gebaseerde methodologieën worden geschetst, die ongetwijfeld bijdragen aan de gebieden van structurele glycobiologie en moleculaire herkenningsstudies.

Ontwarren van glycaan-eiwitinteracties: nucleaire magnetische resonantie (NMR) om te redden

Hier presenteren we een protocol om globale m⁶A-niveaus semi-kwantitatief te beoordelen met behulp van dot blot. Totaal RNA wordt geëxtraheerd, gedenatureerd, op een nylonmembraan gespoten, onderzocht met anti-m⁶A-antilichaam en visualiseerd door chemiluminescentie. Signaalintensiteit, gekwantificeerd met ImageJ grijswaardenanalyse, weerspiegelt de relatieve methylatie-abundantie en biedt een reproduceerbare workflow voor onderzoek.

Dot Blot-assay voor het detecteren van globale N 6-methyladenosine RNA-modificatieniveaus

Dynamische nucleaire polarisatie met daaropvolgende oplossing van het monster heeft real-time studies van metabolisme in biologische systemen mogelijk gemaakt. Gehyperpolariseerd [1-13C]pyruvaat werd gebruikt om lactate dehydrogenase-activiteit te bestuderen in een prostaatcarcinoom-cellijn in vitro.

hypergepolariseerde 13 C Metabolic magnetische resonantie spectroscopie en beeldvorming

Verken de kwantificering van arginine-methylatie met behulp van 1H-NMR-spectroscopie voor biologische monsters. Deze methode ondersteunt kankeronderzoek en patiëntstratificatie.

Het verkennen van de Arginine Methylome door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Meer video's verkennen