Name: Chemische cartografie benaderingen om trypanosomatide infectie te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Verken chemische cartografie om 3D-modellen van metaboliet- en parasietverdeling bij trypanosomatide-infectie te bouwen. Deze methode maakt live mapping van metabole verstoringen en ziektepathogenese mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laura-Isobel McCall, PhD, heeft een Investigators in the Pathogenesis of Infectious Disease Award van het Burroughs Wellcome Fund. De auteurs willen verder de steun erkennen van NIH-awardnummer R21AI148886, een pilotbeurs van het Oklahoma Center for Respiratory and Infectious Diseases (OCRID) onder NIH-awardnummer P20GM103648, en start-upfondsen van de Universiteit van Oklahoma (naar LIM). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de financiers. De auteurs willen ook de ontwikkelaars van de tools bedanken die in dit protocol worden gebruikt. Alle relevante publicaties zijn geciteerd, indien van toepassing.

Geen belangenconflicten te melden.

Het begrijpen van trypanosomatide-infecties is essentieel om nieuwe medicijnontwikkelings- en behandelingsbenaderingen te begeleiden. Deze chemische cartografiemethode is uniek klaar om bruikbare inzichten te bieden in de relatie tussen metabolisme en pathogenese van trypanosomatideziekte, waardoor deze translationele behoefte wordt aangepakt.
Alleen oplosmiddelen van LC-MS-kwaliteit worden aanbevolen tijdens metabolietextractie en MS-analyses om achtergrondverontreiniging te verminderen. Polymere verontreiniging35, gewoonlijk afkomstig van paraffinefilm en/of andere kunststoffen36,37,38, moet waar mogelijk worden vermeden. Met name parafilm mag nooit worden gebruikt. Deze aspecten zijn cruciaal omdat de kwaliteit van de LC-MS-gegevens afhankelijk is van de materialen die worden gebruikt tijdens de monstervoorbereiding en metabolietextractie. De kwaliteit van de gegevens moet worden gewaarborgd voordat ili-plots worden gegenereerd. Bovendien vereist het genereren van deze uitgebreide ruimtelijke metabolomics-kaarten de verzameling van alle aangrenzende weefselmonsters en metabolietextractie uit alle verzamelde monsters om hiaten in deze kaarten te voorkomen. Verzamelprocedures, logistiek van metabolietextractie en LC-MS-analyse, en kosten moeten daarom worden overwogen en dienovereenkomstig worden gepland.
Dit protocol kan op meerdere manieren worden aangepast om aan de behoeften van de gebruiker te voldoen. De polariteit en oplosbaarheid van oplosmiddelen die tijdens de extractie van metabolieten worden gebruikt, zullen bijvoorbeeld van invloed zijn op welke metabolieten worden gedetecteerd39. Om de diversiteit van gedetecteerde metabolietkenmerken voor ongerichte chemische cartografie-analyses te maximaliseren, wordt het combineren van meerdere extractiestappen en oplosmiddelen aanbevolen. Deze methode maakt bijvoorbeeld gebruik van dichloormethaan, methanol en water als extractiemiddelen omdat ze een nauwkeurige detectie van niet-polaire en polaire moleculen mogelijk maken20,40. Deze oplosmiddelen zijn echter niet universeel geschikt voor elk MS-experiment en onderzoekers moeten extractiemiddelen selecteren op basis van de doelen van hun project. Evenzo kunnen verschillende LC-MS / MS-omstandigheden worden gebruikt, zoals het vervangen van omgekeerde fasechromatografie door normale fasechromatografie. Alternatieve kolommen kunnen ook worden gebruikt voor het verzamelen van gegevens in omgekeerde fasen in plaats van C8-chromatografie, hoewel C8-chromatografie empirisch gezien robuuster is voor weefsellipiden en een lagere verstoppingsfrequentie heeft. Conceptueel kunnen deze protocollen ook worden toegepast op andere massaspectrometriemethoden zoals gaschromatografie-massaspectrometrie, enz.
Een alternatieve benadering is massaspectrometrie beeldvorming. Inderdaad, in tegenstelling tot massaspectrometrie beeldvormingsbenaderingen, bewaart vloeistofchromatografie-massaspectrometrie niet inherent ruimtelijke informatie10. Chemische cartografiebenaderingen overbruggen deze kloof door de bemonsteringslocatie op te nemen op het moment van projectconceptualisatie, in de voorbeeldmetagegevens en bij gegevensverwerkingsstappen. Een kracht van deze chemische cartografiebenadering, in tegenstelling tot massaspectrometriebeeldvorming, is de mogelijkheid om zelfverzekerde annotaties te bieden (Metabolomics Standards Initiative niveau 1 of niveau 2 annotatievertrouwen41), in tegenstelling tot massaspectrometriebeeldvorming waarbij het grootste deel van de toepassingen alleen voor annotatie afhankelijk is van nauwkeurige massa. Massaspectrometrie beeldvorming zal fijnmazige ruimtelijke kartering mogelijk maken, soms tot op het niveau van eencellige, bijvoorbeeld,42,43. Chemische cartografiebenaderingen maken daarentegen grootschalige kruisorgaankartering van metabolietverdeling mogelijk zonder dat zeer gespecialiseerde cryosectievaardigheden voor hele dieren nodig zijn. Chemische cartografie levert aanvullend bewijs voor de vele ruimtelijke transcriptomische benaderingen die worden ontwikkeld, bijvoorbeeld,44, met het voordeel dat de focus ligt op de 'omics-laag die het dichtst bij het fenotype ligt'45. Alternatieve methoden voor het kwantificeren van de parasietbelasting omvatten het meten van bioluminescentie op het moment van monsterverzameling6. Fijne segmenten kunnen ook worden verzameld om confocale of elektronenmicroscopie mogelijk te maken om gelokaliseerde parasietbelasting en weefselschade te beoordelen. Het waterhomogenaat, dat wordt gebruikt voor cytokinekwantificering in dit protocol en eerdere publicaties13, kan ook worden gebruikt om op eiwitten gebaseerde markers van weefselschade te kwantificeren.
Er zijn ook meerdere manieren om 3D-modellen te verkrijgen die geschikt zijn om de resulterende LC-MS-gegevens te plotten. Naast de hier voorgestelde methode, kunnen modellen vooraf worden gekocht bij verschillende online leveranciers. Zorg ervoor dat de gebruiksvoorwaarden overeenkomen met het beoogde gebruik, met name met betrekking tot publicatie. Modellen voor grote organen kunnen de novo worden gegenereerd met behulp van 3D-scanners volgens scannerinstructies. Alternatieven zoals MATLAB bestaan voor het genereren en visualiseren van 3D-modellen voor chemische cartografie46, maar ze werden voornamelijk geïmplementeerd vóór de ontwikkeling van 'ili16. MATLAB is een data-analyse en programmeertool suite die een breed scala aan toepassingen biedt op vele gebieden. MATLAB is echter noch gratis noch open-source en vereist bekendheid met MATLAB-interfaces, vooral gezien het feit dat MATLAB niet is ontwikkeld voor het verwerken van massaspectrometriegegevens. De alternatieven van deze voorgestelde methode, namelijk SketchUp, Meshlab en 'ili, zijn vrij toegankelijk, gebruiksvriendelijk en bieden vergelijkbare functies als MATLAB voor chemische cartografiedoeleinden.
Deze methode is robuust met betrekking tot monstervoorbereiding en metabolietextractie. Probleemoplossing is meestal nodig bij de LC-MS-gegevensverzamelingsstap. Dit valt buiten het bestek van dit artikel. Lezers worden doorverwezen naar uitstekende publicaties over het oplossen van problemen met LC-MS-gegevensverzameling, waaronder 20,47. Evenzo vallen de complexiteiten van metabolietannotatie buiten het bereik van de focus van deze methode op het genereren van 3D-modellen. Nuttige referenties over dit onderwerp zijn 24,25,48,49.
Hoewel deze methode effectief de pathogenese van ziekten onderzoekt, zijn er beperkingen aan deze aanpak, waarvan sommige gebruikelijk zijn in elk metabolomics-experiment. Een van die beperkingen is de lage annotatiesnelheid van LC-MS-functies50, die afhankelijk is van de beschikbaarheid en kwaliteit van referentiespectrale bibliotheken. Een andere beperking is dat dit protocol mRNA niet bewaart vanwege de incompatibiliteit van RNA-conserveringsreagentia zoals RNAlater met LC-MS/MS-analyse. De eiwitkwaliteit is echter voldoende voor downstream-analyses en kan dus op mRNA gebaseerde analyses vervangen.
Een chemische cartografie benadering van infectie pathogenese weerspiegelt direct hoe bacteriële, virale of parasitaire infecties zich ontwikkelen in orgaansystemen en gelokaliseerde ziekten veroorzaken. Het analyseren van deze regionale subsamples en het genereren van 3D-modellen brengt uiteindelijk over hoe metabolieten functioneren in de driedimensionale ruimte, waardoor licht wordt geworpen op deze voorheen niet-herkende ruimtelijke dimensies van de moleculaire biologie. Met behulp van dit protocol werd bijvoorbeeld de lokalisatie van metabolieten vergeleken met de parasietbelasting van Trypanosoma cruzi. De resultaten verduidelijkten de relatie tussen het pathogeen en het gastheerweefsel en toonden ook de metabole dynamiek van symptoomprogressie van de ziekte van Chagas6. Chemische cartografiemethoden zijn ook toegepast op verschillende onderwerpen, zoals interactie tussen mens en gebouwde omgeving51,52,53, de chemische samenstelling van orgaansystemen zoals menselijke huid46 en longen54, en plantenmetabolisme en omgevingsinteracties55. Toekomstige toepassingen kunnen betrekking hebben op het beoordelen van gelokaliseerde ziektetolerantie en veerkracht, of de relatie tussen lokale metabolietniveaus, pathogeen tropisme en ziektetropisme in modellen die verder gaan dan trypanosomatide-infectie. Deze aanpak zou ook breed toepasbaar moeten zijn om de huidige farmacokinetische protocollen uit te breiden, om de relatie tussen lokale weefselgeneesmiddelniveaus en medicijnmetabolisme versus de algehele metabole context, weefselschade en pathogeenklaring te beoordelen. Over het algemeen maakt chemische cartografie unieke verkenningen van metabolietverdelingen in verschillende monstertypen mogelijk, met toepassingen zoals ziektepathogenese, menselijke gezondheid, interacties tussen mens en omgeving en microbiële dynamiek.

Trypanosomatide parasieten bestaan uit Leishmania-soorten, Afrikaanse trypanosomen (Trypanosoma brucei) en Amerikaanse trypanosomen (Trypanosoma cruzi). Leishmania protozoa veroorzaken leishmaniasis, waaronder zelfgenezende en zelfbeperkte gelokaliseerde cutane leishmaniasis, mucocutane leishmaniasis waarbij de mucosale weefsels van de mond, neus en keel beschadigd raken, en viscerale leishmaniasis met parasiettropisme naar de viscerale organen die koorts en hepatosplenomegalie veroorzaken1,2. T. brucei veroorzaakt Human African trypanosomiasis (HAT), ook bekend als slaapziekte, voornamelijk gemeld in Afrikaanse landen3. De klinische tekenen en symptomen omvatten hepatosplenomegalie, koorts, hoofdpijn, musculoskeletale pijnen, lymfadenopathieën en bloedarmoede in het hemo-lymfestadium wanneer parasieten zich in de bloedbaan en lymfevaten lokaliseren. Dit wordt gevolgd door de meningo-encefalitische fase, waar parasieten zich lokaliseren naar het centrale zenuwstelsel en slaapstoornissen, gedragsverandering en uiteindelijk fatale comas4 veroorzaken. T. cruzi veroorzaakt de ziekte van Chagas, endemisch in Amerika. Geïnfecteerde personen ervaren een eerste acute fase, meestal asymptomatisch, met breed parasiettropisme. Ongeveer 10% -30% van de geïnfecteerde personen ervaart symptomen in een chronisch stadium na tientallen jaren van infectie, gekenmerkt door megaoesophagus, megacolon en cardiovasculaire complicaties5,6.
Metabolomics bestudeert kleine moleculaire soorten (50-1.500 Da), waaronder biologische verbindingen uit het primaire of secundaire metabolisme en extern afgeleide verbindingen zoals geneesmiddelen of van voedsel afgeleide moleculen. In de context van gastheer-pathogeeninteracties kunnen metabolomica de impact van infectie op gastheermetabolietomgevingen onderzoeken, cruciaal bij het verkrijgen van toegang tot het effect van het pathogeen op de gastheer. Het kan ook pathogene aanpassingen aan de voedings- en immunologische omgeving van de gastheer beoordelen7,8,9. Massaspectrometrie (MS) en nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie zijn veelgebruikte metabolomics-instrumenten die worden gebruikt om metabolieten te identificeren, kwantificeren en karakteriseren. Deze "omics"-benadering kan ook worden toegepast op de ontdekking van biomarkers en de ontwikkeling van geneesmiddelen10,11.
Gezien het specifieke weefseltropisme van trypanosomatide parasieten, kunnen ruimtelijke metabolomics-analyses een significant inzicht geven in de pathogenese van de ziekten die ze veroorzaken. Het in kaart brengen van de ruimtelijke verdeling van metabolieten onthulde metabolieten die lokaal worden beïnvloed door chronische Trypanosoma cruzi-infectie in het hartweefsel van muizen en acute en langdurige Trypanosoma cruzi-infectie in het maagdarmkanaal van de muis6,12,13. Specifiek toonde 3D chemische cartografie een ontkoppeling aan tussen parasietpersistentie en metabole veranderingen in het hartweefsel van chronisch Trypanosoma cruzi-geïnfecteerde muizen. Het metabolisme was het meest verstoord in lagere en apicale segmenten van het hart, overeenkomend met plaatsen van symptomen van de ziekte van Chagas (cardiale apicale aneurysmata). Metabolietfamilies verstoord door infectie op specifieke cardiale plaatsen en gecorreleerd aan de ernst van de ziekte omvatten acylcarnitines en glycerofosfocholines12,13,14. In het maagdarmkanaal kwamen aanhoudende metabole veranderingen overeen met plaatsen van symptomen van de ziekte van Chagas: slokdarm en dikke darm. Daarentegen wordt het metabolisme opnieuw genormaliseerd op plaatsen die niet geassocieerd zijn met symptomen van de ziekte van Chagas, zoals de dunne darm. Metabolieten die lokaal worden verstoord door infectie in het maagdarmkanaal omvatten acylcarnitines, glycerofosfocholines, kynurenine, tryptofaan en cholzuur. Bovendien maakten deze analyses de identificatie mogelijk van een nieuw metabolisch mechanisme van tolerantie voor de ziekte van Chagas6. Het toepassen van deze methoden op de studie van cutane leishmaniasis onthulde significante metabole verstoringen op de plaats van de laesie, maar ook specifieke metabole veranderingen in laesie-aangrenzend, macroscopisch gezond weefsel. Glutamine was bijvoorbeeld uitgeput op de plaats van de laesie, terwijl glycerofosfocholines in de m / z (massa-ladingsverhouding) 200-299, 400-499, 500-599 en 600-699 significant verhoogd waren op de laesieplaats. PC (O-34:1) was alleen verhoogd op laesie-aangrenzende plaatsen15.
Het doel van dit manuscript is om de stappen aan te tonen die nodig zijn om 3D-modellen van metabolietverdeling ("chemische cartografie") te genereren zoals toegepast op trypanosomatide parasietinfectiemodellen (figuur 1). Deze aanpak bouwt voort op verschillende kritische ontwikkelingen in de context van metabolomics en metabolomics dataverwerking, met name de ontwikkeling van 'ili software om metabolomics data eenvoudig uit te zetten op 3D modellen16.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Eppendorf buisjes</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar</td></tr><tr><td>1 L fles, pyrex</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar</td></tr><tr><td>1 L graduaalcilinder, pyrex</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar</td></tr><tr><td>2 mL SafeLock Eppendorf buisjes</td><td>VWR</td><td>20901-540</td><td>gebruik het geschikte buismodel voor de beschikbare weefselhomogenisator</td></tr><tr><td>3D-model (de-novo gegenereerd volgens protocolstappen, of gekocht)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>zoals passend voor het onderzochte systeem</td></tr><tr><td>5 mm roestvrijstalen kraal</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>96-wells plaat</td><td>Fisher</td><td>3252449</td><td></td></tr><tr><td>AATTCCTCCAAGCAGCGGATA primer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar; gepubliceerd in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195&ndash;200 (2007).</td></tr><tr><td>analyseweegschaal</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar</td></tr><tr><td>ASTCGGCTGATCGTTTTCGA primer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar; gepubliceerd in Piron, M. et al. Development of a real-time PCR assay for Trypanosoma cruzi detection in blood samples. Acta tropica. 103 (3), 195&ndash;200 (2007).</td></tr><tr><td>centrifuge met microcentrifuge, falconbuis en 96-wells-plaat capaciteit</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar</td></tr><tr><td>biosfeerkast</td><td>NA</td><td>NA</td><td>klasse II, type A2; elke merk, indien beschikbaar</td></tr><tr><td>CAGCAAGCATCTATGCACTTAG ACCCC primer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar; gepubliceerd in Cummings, K.L., Tarleton, R.L. Rapid quantitation of Trypanosoma cruzi in host tissue by real-time PCR. Molecular and biochemical parasitology. 129 (1), 53&ndash;59 (2003).</td></tr><tr><td>camera</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar. Een mobiele telefooncamera is voldoende voor dit protocol</td></tr><tr><td>chemiluminescente beeldvormingssysteem</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elk systeem, indien beschikbaar</td></tr><tr><td>katoenen bolletjes</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar</td></tr><tr><td>cryohandschoenen</td><td>VWR</td><td>97008-208</td><td>vervang met elke merk, indien beschikbaar</td></tr><tr><td>dissectie schaar</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar</td></tr><tr><td>droog ijs</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar</td></tr><tr><td>extra-lange pincetten</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar</td></tr><tr><td>brandbare koelkast</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar</td></tr><tr><td>vriesboxen voor microcentrifugebuisjes</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar</td></tr><tr><td>afzuigkap</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar</td></tr><tr><td>hoge resolutie massaspectrometer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar, zoals ThermoFisher Q-Exactive Plus (catalogusnummer 0726030)</td></tr><tr><td>ijsemmer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar</td></tr><tr><td>ili software</td><td>ili.embl.de</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>isofluraan</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>grote tupperware</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar; groot genoeg om comfortabel een muis, katoenen bolletje te bevatten</td></tr><tr><td>LC-MS-kwaliteit acetonitril</td><td>Fisher Optima</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS-kwaliteit dichloormethaan</td><td>Fisher Optima</td><td>D151-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS-kwaliteit mierenzuur</td><td>Fisher Optima</td><td>A11750</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS-kwaliteit methanol</td><td>Fisher Optima</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS-kwaliteit water</td><td>Fisher Optima</td><td>W64</td><td></td></tr><tr><td>vloeistofchromatografie kolom</td><td>Phenomenex</td><td>00B-4499-AN</td><td>kan worden gewijzigd in andere merken en modellen, afhankelijk van de metabolieten van belang</td></tr><tr><td>vloeistofchromatografie kolombewakingscartridge</td><td>Phenomenex</td><td>AJ0-8784</td><td>kan worden gewijzigd in andere merken en modellen, afhankelijk van de metabolieten van belang</td></tr><tr><td>vloeistofchromatografie kolombewakingscartridge houder</td><td>Phenomenex</td><td>AJ0-9000</td><td>kan worden gewijzigd in andere merken en modellen, afhankelijk van de metabolieten van belang</td></tr><tr><td>vloeibare stikstof</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar</td></tr><tr><td>luciferine</td><td>Goldbio</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>MeshLab software</td><td>https://www.meshlab.net/</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Meshmixer software</td><td>https://www.meshmixer.com/</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MS ijkstof</td><td>NA</td><td>NA</td><td>passend voor beschikbaar instrument</td></tr><tr><td>MS dataverwerkingssoftware</td><td>NA</td><td>NA</td><td>meerdere opties beschikbaar; auteurs bevelen MZmine aan</td></tr><tr><td>MSConvert software</td><td>http://proteowizard.sourceforge.net/</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-ONE-W</td><td>andere nanodrop modellen zijn ook geschikt</td></tr><tr><td>p1000 pipetpunten</td><td>NA</td><td>NA</td><td>gebruik de geschikte merk om beschikbare pipetten te passen</td></tr><tr><td>p1000 pipettor</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar</td></tr><tr><td>p20 pipette punten</td><td>NA</td><td>NA</td><td>gebruik de geschikte merk om beschikbare pipetten te passen</td></tr><tr><td>p20 pipettor</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar</td></tr><tr><td>p200 pipette punten</td><td>NA</td><td>NA</td><td>gebruik de geschikte merk om beschikbare pipetten te passen</td></tr><tr><td>p200 pipettor</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar</td></tr><tr><td>persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, labjassen, veiligheidsbrillen/bril; gezichtsscherm)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>elke merk, indien beschikbaar</td></tr><tr><td>Q-Plex Muis Cytokine - Screen (16-Plex)</td><td>Quansys biosciences</td><td>110949MS</td><td>kan worden vervangen

chemische cartografie benaderingen om trypanosomatide infectie te bestuderen

Chemical Cartography Approaches to Study Trypanosomatid Infection

Pathogeen tropisme en ziektetropisme verwijzen naar de weefsellocaties die selectief gekoloniseerd of beschadigd zijn door pathogenen, wat leidt tot gelokaliseerde ziektesymptomen. Mens-infectieuze trypanosomatide parasieten omvatten Trypanosoma cruzi, de veroorzaker van de ziekte van Chagas; Trypanosoma brucei, de veroorzaker van slaapziekte; en Leishmania-soorten , veroorzakers van leishmaniasis. Samen treffen ze 20 miljoen mensen over de hele wereld. Deze parasieten vertonen specifiek tropisme: hart, slokdarm, dikke darm voor T. cruzi, vetweefsel, pancreas, huid, bloedsomloop en centraal zenuwstelsel voor T. brucei, huid voor dermotrope Leishmania-stammen en lever, milt en beenmerg voor viscerotrope Leishmania-stammen . Een ruimtelijk perspectief is daarom essentieel om de pathogenese van trypanosomatide te begrijpen. Chemische cartografie genereert 3D-visualisaties van de overvloed aan kleine moleculen gegenereerd via vloeistofchromatografie-massaspectrometrie, in vergelijking met microbiologische en immunologische parameters. Dit protocol laat zien hoe chemische cartografie kan worden toegepast om pathogene processen tijdens trypanosomatide-infectie te bestuderen, te beginnen met systematische weefselbemonstering en metabolietextractie, gevolgd door vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometriegegevensverzameling en eindigend met het genereren van 3D-kaarten van metabolietverdeling. Deze methode kan worden gebruikt voor meerdere onderzoeksvragen, zoals voedingsbehoeften voor weefselkolonisatie door T. cruzi, T. brucei of Leishmania, immunometabolisme op plaatsen van infectie en de relatie tussen lokale weefselstofwisseling en klinische ziektesymptomen, wat leidt tot uitgebreid inzicht in de pathogenese van trypanosomatide.

Het aantal verkregen metabolietkenmerken hangt af van het geanalyseerde weefseltype en de parameters voor gegevensverwerking. Dit protocol is bijvoorbeeld gebruikt om de ruimtelijke impact van T. cruzi-infectie op het metaboloom van het maagdarmkanaal te analyseren in een muismodel van T. cruzi-infectie. In eerder werk werden mannelijke C3H/HeJ intraperitoneaal geïnjecteerd met 1.000 CL + luc T. cruzi parasieten32,6. Dieren werden 12 of 89 dagen na infectie geëuthanaseerd en een chemische cartografie-analyse van 13 aaneengesloten segmenten van het maagdarmkanaal werd uitgevoerd zoals beschreven in dit protocol. Deze analyse leidde tot een functietabel van 5.502 functies, die vervolgens in 3D werden gevisualiseerd met behulp van de stappen die in dit protocol worden beschreven. Deze benadering maakt de visualisatie mogelijk van metabolietkenmerken bij individuele dieren die hoog zijn op de plaats van hoge parasietbelasting (kynurenine, figuur 2B vs. parasietbelasting, figuur 2A), van metabolieten met differentiële verdeling over weefselgebieden (glutamine, figuur 2C) en metabolietkenmerken die op vergelijkbare niveaus worden aangetroffen in dunne en dikke darm (LPE 16:0 Figuur 2D ). Kynurenine werd geselecteerd voor visualisatie vanwege de bekende relatie met ontsteking en eerdere publicaties over het vermogen van kynurenine-afgeleide metabolieten om T. cruzi load33 te reguleren. Random forest-based machine learning-modellen hadden eerder een verband onthuld tussen kynurenineniveaus en infectiestatus6. Glutamine werd geselecteerd voor een visualisatie op basis van eerdere publicaties die een verband aantonen tussen de beschikbaarheid van in vitro glutamine en de gevoeligheid van T. cruzi-geneesmiddelen34. Differentiële verdeling werd bevestigd met behulp van logistische regressie, p < 0,05. LPE 16:0 werd geselecteerd na visuele inspectie van de gegevens om metabolietkenmerken te ontdekken die op vergelijkbare niveaus op verschillende weefsellocaties werden aangetroffen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63255/63255fig01.jpg"> Figuur 1: Protocoloverzicht. De illustratie is gemaakt met BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63255/63255fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63255/63255fig02.jpg"> Figuur 2: Chemische cartografie analyse. Mannelijke C3H/HeJ muizen werden intraperitoneaal geïnjecteerd met 1.000 CL+luc T. cruzi parasieten32. Dieren werden 12 of 89 dagen na infectie geëuthanaseerd en het maagdarmkanaal werd systematisch verzameld en gesneden (stap 1)6. Metabolieten werden geëxtraheerd zoals in stap 2 en geanalyseerd door LC-MS /MS.3D modelgeneratie werd uitgevoerd met behulp van de SketchUp-software (stap 5) en gegevens werden uitgezet in 3D zoals in stap 6. (A) Parasiet distributie in een specifieke muis, 12 dagen na infectie. (B) Kynurenine metaboliet distributie in dezelfde muis, 12 dagen na infectie. (C) Gemiddelde glutamineverdeling over geïnfecteerde muizen, 89 dagen na infectie. (D) Vergelijkbare niveaus van m/z 454.292 retentietijd 2.929 min, geannoteerd als 2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine (LPE 16:0), in dezelfde muis als in A en B in de dunne darm en dikke darm. Monsters en gegevens werden gegenereerd in6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63255/63255fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol beschrijft de stappen om een 3D-model van metabolietverdeling tijdens trypanosomatide-infectie te genereren, inclusief monsterverzameling, metabolietextractie, een overzicht van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometriegegevensverzameling, 3D-modelgeneratie en ten slotte gegevensvisualisatie.

Chemische cartografie benaderingen om trypanosomatide infectie te bestuderen

Pathogen tropism and disease tropism refer to the tissue locations selectively colonized or damaged by pathogens, leading to localized disease symptoms. ...

Dit protocol kan worden gebruikt om 3D-modellen van metaboliet- en parasietverdeling te bouwen. Dit kan helpen bij het begrijpen van de relatie tussen lokale weefsel metabole verstoring, parasiet distributie, en klinische ziekte symptomen. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het live schaal cross-organ mapping van metabolietverdeling versus pathogene distributie en de statistische analyse ervan mogelijk maakt.Theoretisch kan chemische cartografie de ontwikkeling en impact van de ziekte op de gastheer onderzoeken door rechtstreeks de metabolieten te onderzoeken die verantwoordelijk zijn voor de pathogenese en de effecten van de behandeling. Begin met het wegen en labelen van de buizen. Snijd de weefsels systematisch met één sectie per buis.Weeg de buizen met weefselmonsters om het monstergewicht te bepalen en het gewicht te registreren. Om de weefselmonsters op waterbasis te homogeniseren, voegt u een roestvrijstalen kraal van vijf millimeter toe aan de twee milliliter microcentrifugebuizen met weefselmonsters. Maak één lege buis met water van LCMS-kwaliteit.Vul het volume aan tot 500 microliter per 50 milligram van het monster door gekoeld water van LCMS-kwaliteit toe te voegen en homogeniseer monsters vervolgens gedurende drie minuten bij 25 hertz. Monsters moeten grondig worden gehomogeniseerd. Verzamel 1/10e van het homogenisatievolume voor DNA-extractie en andere analyses.Voeg ijskoude Methanol van LCMS-kwaliteit met vier micromolair sulfachloropyridazine toe aan het homogenaat. Homogeniseer monsters in een weefselhomogenisator bij 25 hertz gedurende drie minuten, gevolgd door centrifugeren gedurende 10 minuten. Verzamel een gelijk volume supernatant in een 96-putplaat en bewaar vaste resten op ijs terwijl je de supernatanten verzamelt.Droog het waterige extractiesupernatant volledig met maximale snelheid en zonder verwarming. Voer organische extractie uit door 1.000 microliter voorgekoelde dichloormethaanmethanol toe te voegen, geprikt met twee micromolaire sulfachloropyridazine per 50 milligram vast residumonster. Homogeniseer monsters bij 25 hertz gedurende vijf minuten, gevolgd door centrifugeren gedurende 10 minuten.Verzamel een gelijk volume supernatant in een 96 putplaat. Maak een foto van het orgel van belang. Klik op Bestand en vervolgens op Importeren in de SketchUp-software om een afbeelding van de interessante organen te importeren.Klik op de lijnentool en selecteer de optie uit de vrije hand. Gebruik het potloodgereedschap om de contouren van de interessante organen te traceren en te tekenen. Selecteer het duw-/trekgereedschap en trek omhoog op het gearceerde gebied om de tekening van 2D naar 3D te converteren.Exporteer het bestand in dae-indeling door op Bestand exporteren en vervolgens op 3D-model te klikken. Om het realisme van het model te verbeteren, importeert u het model in MeshLab-software door Bestand te selecteren en vervolgens op Mesh importeren te klikken. Selecteer Wireframe in het bovenste menu, selecteer vervolgens Filters, klik op Remeshing Simplification and Reconstruction en vervolgens op Subdivision Surfaces Midpoint.Laat alle waarden als standaard staan en selecteer Tweemaal toepassen. Exporteer het model in sdl-indeling door te klikken op Bestand, vervolgens op Mesh exporteren als en vervolgens SDL-bestandsindeling te selecteren in het vervolgkeuzemenu bestandstype. Sla dit op en selecteer OK in het volgende pop-upmenu.Open de Meshmixer-software en importeer het sdl-bestand dat bij de vorige stap is gegenereerd. Gebruik de sculptuur, penselen, drakensculptuur, penselen, opblaasgereedschappen om de modeloppervlakken eruit te trekken die moeten worden afgerond. Sla het op in sdl-formaat zodra het model het gewenste uiterlijk heeft door op Bestand en exporteren te klikken.Geef het bestand de gewenste naam, selecteer de binaire SDL-indeling en sla het op. Open het 3D-model in de MeshLab-software. Klik op OK in het pop-upvenster voor het openen van de verwerking.Verkrijg X-, Y- en Z-coördinaten voor elke bemonsteringsplek door het gereedschap keuzepunten te selecteren en klik vervolgens met de rechtermuisknop op regelmatig verdeelde intervallen over het oppervlak van het 3D-model. Zodra alle gewenste coördinaten zijn geselecteerd, klikt u op de bovenste knop Opslaan in het pop-upvenster van het formulier. Open in spreadsheetsoftware het pp-bestand dat in de vorige stap is gegenereerd.Pas de gegevensweergave aan door te klikken op Gegevenstekst naar kolommen en vervolgens op Gescheiden. Klik op Volgende en selecteer vervolgens Spatiebalk en klik op Voltooien. Formatteer opnieuw zodat alleen numerieke waarden in de spreadsheetcellen blijven staan door Home Zoeken en Vervangen selecteren te selecteren.Voer in het vak Zoeken naar wat Y gelijke laag in en laat het vervangen vak leeg. Klik op Alles vervangen en vervolgens op OK. Herhaal voor X gelijke vacht en voor Z gelijke laag en voor vacht schuine snede groter dan. In de spreadsheetsoftwaretabel komen rijen overeen met elke positie en kolommen met gegevens.Plak de juiste metagegevens en overvloed aan metabolietfuncties in de volgende spreadsheetkolommen. Voer in de kolom straal de gewenste grootte in van de bemonsteringspunten die op het model moeten worden gevisualiseerd. Bepaal de waarden voor de straal empirisch en sla het bestand op in CSV-indeling.Navigeer naar ELI Plot-software, selecteer Surface en sleep het gemaakte 3D-model naar het browservenster. Sleep de gemaakte functietabel naar hetzelfde browservenster. Gebruik de legenda in de rechterbenedenhoek om de gewenste gegevenskolom op het 3D-model te projecteren.Selecteer achtereenvolgens elke gegevenskolom om de verdeling van dit metabolietkenmerk op het 3D-model te beoordelen. Deze analyse leidde tot een tabel met 5.502 functies en hun visualisatie in 3D. Deze aanpak maakt de visualisatie mogelijk van metabolietkenmerken bij individuele dieren die hoog zijn op de plaats van hoge parasietbelasting, metabolieten met differentiële verdeling over weefselgebieden en metabolietkenmerken die op vergelijkbare niveaus in dunne en dikke darm worden aangetroffen.Het is belangrijk om te onthouden om alleen LCMS-oplosmiddelen te gebruiken en al het aangrenzende weefsel te verzamelen en de metabolieten voor alle verzamelde monsters te extraheren om hiaten in ruimtelijke kaarten te voorkomen. Deze techniek kan worden gebruikt om de voedingsbehoeften voor weefselkolonisatie door Trypanosomatid-parasieten te onderzoeken om de pathogenese van ziekten te begrijpen door 3D-metabolietdistributiekaarten bij infectie te vergelijken.

chemical-cartography-approaches-to-study-trypanosomatid-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit manuscript beschrijft het gebruik van een bioluminescente stam van Afrikaanse trypanosomen om de tracking van een late infectiefase mogelijk te maken en demonstreert hoe in vivo live beeldvorming kan worden gebruikt om infecties binnen het centrale zenuwstelsel in real-time te visualiseren.

Bioluminescentie Imaging te laat stadium Infectie van Afrikaanse trypanosomiasis Detect

Afrikaanse trypanosomen die in vitro gekweekt worden, ondergaan antigeenvariatie met een lage snelheid, zodat populaties bestaan uit parasieten die een dominante variant van het oppervlakteglycoproteïne (VSG) en een kleine populatie van 'geschakelde' varianten tot expressie brengen. Dit protocol beschrijft een snelle methode voor het detecteren en kwantificeren van deze populaties.

detectie van<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant oppervlakte glycoproteïne Schakelen van Magnetic Activated Cell Sorting en flowcytometrie

In dit protocol, fluorescently geëtiketteerde T. cruzi werden ingespoten in transparante zebrafish larven en de beweeglijkheid van de parasiet werd waargenomen in vivo met licht blad fluorescentie microscopie.

Oprichting van larvale zebravis als Model van een dier te onderzoeken Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

De Trypanosoma cruzi agent van de ziekte van Chagas produceert langdurig asymptomatische infecties die abrupt tot klinisch erkende pathologie uitgroeien. Het volgende onderzoeksprotocol beschrijft een short-run programma gezinsgerichte epidemiologische studie om te ontrafelen de T. cruzi infectie van bovenliggende seksueel overgedragen aan nakomelingen.

Seksuele transmissie van Amerikaanse trypanosomen van mannetjes en vrouwtjes te naïeve Mates

Deze methode van trypanosoom afscheiding van bloed is afhankelijk van hun oppervlakte lading minder negatief dan bloed zoogdiercellen. Geïnfecteerd bloed is geplaatst en worden behandeld op een anionenwisselaar kolom. Deze methode, de meest passende diagnose voor slaapziekte, biedt gezuiverde parasieten voor immunologische, biologische, biochemische, farmaceutische en moleculaire biologie onderzoek.

Zuivering van extracellulaire trypanosomen, met inbegrip van Staten in Afrika, van bloed door Anion-wisselaars (Diethylaminoethyl-gemengd met cellulose kolommen)

Het huidige protocol beschrijft lichtblad fluorescerende microscopie en geautomatiseerde software-ondersteunde methoden om prolifererende en slapende Trypanosoma cruzi-parasieten en T-cellen in intacte, gewiste organen en weefsels te visualiseren en nauwkeurig te kwantificeren. Deze technieken bieden een betrouwbare manier om behandelingsresultaten te evalueren en bieden nieuwe inzichten in interacties tussen parasieten en gastheer.

Kwantitatieve 3D-beeldvorming van trypanosoma cruzi-geïnfecteerde cellen, slapende amastigoten en T-cellen in intacte geklaarde organen

Deze studie toont een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van ultrastructuurexpansiemicroscopie in drie in vitro levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi, de ziekteverwekker die verantwoordelijk is voor de ziekte van Chagas. We nemen de geoptimaliseerde techniek voor cytoskeletale eiwitten en pan-proteoomlabeling op.

Ultrastructurele expansiemicroscopie in drie in vitro levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi

Wereldwijd werden medische bloedparasieten automatisch gescreend met behulp van eenvoudige stappen op een low-code AI-platform. De prospectieve diagnose van bloedfilms werd verbeterd door gebruik te maken van een objectdetectie- en classificatiemethode in een hybride deep learning-model. De samenwerking van actieve monitoring en goed getrainde modellen helpt bij het identificeren van hotspots van trypanosoomtransmissie.

Superieure automatische identificatie van trypanosoomparasieten door gebruik te maken van een hybride deep-learning-model

We beschrijven een methode om te bestuderen hoe pH reageert op omgevingssignalen in de glycosomen van de bloedbaanvorm van Afrikaanse trypanosomen. Deze aanpak omvat een pH-gevoelige erfelijke eiwitsensor in combinatie met flowcytometrie om de pH-dynamiek te meten, zowel als een tijdverlooptest als in een high-throughput screen-formaat.

Meten van dynamische glycosomale pH-veranderingen bij levende Trypanosoma brucei

Het hier verstrekte protocol beschrijft de gedetailleerde stappen om onderzoeken naar de werkzaamheid van geneesmiddelen uit te voeren in een bioluminescent model van Trypanosoma cruzi-infectie , met een focus op gegevensverzameling, -analyse en -interpretatie. Er zijn ook procedures voor probleemoplossing en kwaliteitscontrole om technische problemen tot een minimum te beperken.

Demystificerende in vivo bioluminescentiebeeldvorming van een muismodel van de ziekte van Chagas voor onderzoeken naar de werkzaamheid van geneesmiddelen

Verken chemische cartografie om 3D-modellen van metaboliet- en parasietverdeling bij trypanosomatide-infectie te bouwen. Deze methode maakt live mapping van metabole verstoringen en ziektepathogenese mogelijk.

Chemische cartografie benaderingen om trypanosomatide infectie te bestuderen

Meer video's verkennen