Lichtgestuurde fermentaties voor microbiële chemische en eiwitproductie

Optogenetica is gebruikt om hogere titers van verschillende chemicaliën en eiwitten te bereiken in vergelijking met typische inductoren. Met behulp van dit protocol kunnen anderen hun eigen processen verbeteren met op licht gebaseerde controle. Optogenetica controle is niet-invasief, zeer afstembaar en omkeerbaar.

Deze kwaliteiten zorgen voor een gestroomlijnde optimalisatie van microbiële processen en openen zelfs unieke mogelijkheden, zoals driefasige fermentaties en multichromatische controle. Voor elke nieuwe chemische stof zullen de optimale lichtomstandigheden verschillen. Dus als een lage productie wordt waargenomen met behulp van de parameters in dit protocol, moeten verschillende lichtomstandigheden worden getest.

Begin met het verkrijgen van een Saccharomyces cerevisiae-stam met HIS3-oxytrofie, een marker die nodig is voor OptoINVRT-plasmiden. Als u een gen wilt beheersen dat eigen is aan Saccharomyces cerevisiae, zorg er dan voor dat de endogene kopie van het gen wordt verwijderd voordat u verder gaat. Om de spanningsconstructie te starten, lineariseert u het plasmide dat het OptoINVRT7-circuit bevat, zoals EZL439.

Als u EZL439 gebruikt, dat de componenten bevat om de PIGA één promotor in het licht te onderdrukken en in het donker te activeren, lineariseer dan op de Pme1-restrictieplaats. Met behulp van standaard lithiumacetaattransformatiemethoden integreert u het plasmide in een HIS3 auxotrofe stam. Centrifugeer na de transformatie de cellen gedurende één minuut bij 150 G.

Resuspend de cellen voorzichtig in 200 microliter vers SC-HIS medium. Leg het hele celvolume op een SC-HIS-agarplaat en incubeer bij 30 graden Celsius gedurende twee tot drie dagen totdat kolonies verschijnen. Bereid competente cellen voor met behulp van standaard lithiumacetaattransformatieprotocollen.

Transformeer de cellen met het plasmide dat de genen bevat die u optogenetisch wilt controleren stroomafwaarts van de PIGA1M- of PIGA1S-promotors. Centrifugeer na de transformatie de cultuur gedurende één minuut bij 150 G en resuspend de celkorrel voorzichtig in 200 microliter vers SC drop-out medium. Plaats het volledige celvolume op een gistextract pepton dextrose agarplaat, indien geïntegreerd in Delta-locaties of een SC-uitvalplaat als deze transformeert met een plasmide met een selectiemarker.

Incubeer de cellen bij 30 graden Celsius gedurende 16 uur onder constant blauw licht om het optogenetisch gecontroleerde gen onderdrukt te houden. Gebruik een lichtbron met een golflengte van 465 nanometer en plaats een LED-paneel ongeveer 40 centimeter boven de plaat, zodat de lichtintensiteit ongeveer 80 tot 110 micromol per vierkante meter per seconde is. Meet de intensiteit met behulp van een kwantummeter.

Als u integreert in Delta-locaties, repliceert u de plaat op gistextract pepton dextroseplaten met een reeks Zeocin-concentraties tussen 400 microgram per milliliter en 1.200 microgram per milliliter om te selecteren voor een verscheidenheid aan integratiekopienummers. Incubeer de replicaplaten bij 30 graden Celsius onder constant of gepulseerd blauw licht gedurende twee tot drie dagen totdat de kolonies verschijnen. Om de voorlopige screening uit te voeren, selecteert u acht kolonies uit elke plaat en gebruikt u ze om één milliliter SC-HIS-medium aangevuld met 2% glucose te enten in individuele putten van een 24-putplaat.

Laat de cellen 's nachts groeien bij 30 graden Celsius en schud met 200 omwentelingen per minuut onder constante verlichting met blauw licht. Verdun de volgende dag elke cultuur in een vers SC-HIS-medium met 2% glucose om de optische dichtheidswaarden te verkrijgen, variërend van 0,01 tot 0,3 bij 600 nanometer en laat de culturen in schuddende toestand 200 omwentelingen per minuut groeien onder constant of gepulseerd licht bij 30 graden Celsius totdat de optische dichtheid tussen twee en negen bereikt. Wikkel vervolgens de platen met aluminiumfolie, schakel het lichtpaneel uit en incubeer de platen in het donker gedurende vier uur bij 30 graden Celsius met 200 omwentelingen per minuut.

Centrifugeer de culturen in de 24 well plaat bij 234 G's gedurende vijf minuten en resuspend cellen in één milliliter vers synthetisch volledig drop-out medium met 2% glucose. Sluit de platen af om verdamping van het gewenste product te voorkomen met steriele microplaatafdichtingstape. Fermenteer de verzegelde platen in het donker gedurende 48 uur bij 30 graden Celsius en schud met 200 omwentelingen per minuut.

Om de fermentaties te oogsten, centrifugeer je de platen gedurende vijf minuten bij 234 G's en breng je 800 microliter van het supernatant over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Afhankelijk van de chemische stof van belang, analyseer met behulp van hoogwaardige vloeistofchromatografie, gaschromatografie massaspectrometrie of een andere analytische methode met behulp van de monstervoorbereidingstechniek die het meest geschikt is voor het gebruikte instrument. Selecteer acht kolonies uit elke plaat en gebruik ze om één milliliter SC-HIS-medium met 2% glucose te enten in individuele putten van een 24-putplaat.

Laat de cellen 's nachts in het donker groeien bij 30 graden Celsius met 200 omwentelingen per minuut schudden. Verdun de volgende ochtend elke cultuur in een vers SC-HIS-medium met 2% glucose tot 0,1 optische dichtheid. Wikkel de platen in aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen en laat de cultuur in het donker groeien bij 30 graden Celsius met 200 omwentelingen per minuut schudden totdat ze een optische dichtheid van drie bereiken.

Incubeer vervolgens de platen onder gepulseerd licht gedurende 12 uur bij 30 graden Celsius met 200 omwentelingen per minuut schudden. Centrifugeer de culturen gedurende vijf minuten bij 234 G en resuspend in vers SC-HIS medium met 2% glucose. Sluit de platen af om verdamping van het gewenste product te voorkomen met steriele microplaatafdichtingstape.

Fermenteer de verzegelde platen in licht gedurende 48 uur bij 30 graden Celsius en schud met 200 omwentelingen per minuut. Na het uitvoeren van optogenetische fermentaties werd de chemische productie getest bij een reeks celdichtheden op het moment van inductie met twee circuits. Het OptoINVRT7-circuit toonde hoge titers van melkzuur en isobutanol met een optimale celdichtheid van inductiewaarde van 7,0 en 8,75 in vergelijking met de OptoINVRT1- en 2-circuits.

Fermentaties met behulp van de OptoAMP-circuits werden bestudeerd in drie fasen die werden gedefinieerd door verschillende lichte bedrijfscycli. Melkzuurproductie kan worden geoptimaliseerd met behulp van een gepulseerde groeifase en volledig verlichte inductie- en productiefasen. De productie van isobutanol werd geoptimaliseerd met behulp van een gepulste groeifase, volledig verlichte inductiefase en gepulste productiefase.

Terwijl de biosynthese van naringenine het best werd geoptimaliseerd met behulp van een gepulseerde groei volledig verlichte inductie en donkere productiefase. Het OptoLAC-systeem is gebruikt in E.Coli om transcriptiefactor FDER te produceren bij titers die vergelijkbaar zijn met of hoger zijn dan die bereikt met chemische inductie met IPDG. OptoLAC-circuits zijn toegepast om mevalonaat te produceren en de productie overschrijdt titers die zijn bereikt met IPDG-inductie.

Mevalonaatproductie op bioreactorniveau toont de schaalbaarheid en tonijnbaarheid van optogenetische regulatie voor chemische en eiwitproductie in bacteriën voorbij microplaatniveaus. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de lichtintensiteit binnen het juiste bereik ligt voor de verlichte stappen en dat lichtverontreiniging wordt vermeden voor stappen die duisternis vereisen. Deze techniek maakte de weg vrij om recordtiters van isobutanol in gist te bereiken, consortiapopulaties met licht te stabiliseren en zelfs de metabole flux te regelen met behulp van synthetische lichtgestuurde organellen.