Microfluïdische Acoustophorese voor flowthrough scheiding van gramnegatieve bacteriën met behulp van Aptamer Affinity Beads
17 oktober 2022
Dit artikel beschrijft de fabricage en werking van microfluïdische acoustophoretische chips met behulp van de microfluïdische acoustophoresis-techniek en aptamer-gemodificeerde microbeads die kunnen worden gebruikt voor snelle, efficiënte isolatie van Gram-negatieve bacteriën uit een medium.
Dit protocol beschrijft onze microfluïdische acoustophoresis-technologie die kan worden gebruikt voor de snelle, efficiënte scheiding van Gram-negatieve bacteriën uit een medium met behulp van aptamer-gemodificeerde microparels. Microfluïdische acoustophoresesystemen maken de Gram-negatieve bacteriescheiding mogelijk met een redelijke doorvoer en contactloze celisolatie. Microfluïdische acoustophorese kan worden geoptimaliseerd om bacteriën te isoleren uit medische en omgevingsmonsters.
Ontwerp om te beginnen een microfluïdische acoustophoresechip die PS-kralen verzamelt bij de doeluitlaat en de rest weggooit na het injecteren van een PS-monstermengsel in de monsterinlaat. Bereid een chip met de lagen boven en onder de siliciumlaag gebonden aan het borosilicaatglas. En een derde borosilicaatglaslaag, met behulp van anodisatie, voeg 1000 volt en 400 graden Celsius toe.
Bevestig een PZT aan de borosilicaatglaslaag langs het microfluïdische kanaal met behulp van minder dan 10 microliter cyanoacrylaatlijm. Ent de GN- en GP-bacteriën in Luria-Bertani-medium en incubeer deze bij 37 graden Celsius en 220 omwentelingen per minuut gedurende 16 uur. Centrifugeer de gekweekte bacteriën bij 9, 056 RCF gedurende één minuut bij kamertemperatuur.
Daarna twee keer wassen met 1X PBS buffer. Bereid de geselecteerde GN- en GP-bacteriën voor op analyse door ze in de bindingsbuffer te resuspenderen. Resuspendeer het 10 micrometer streptavidin gecoate micro kraalmengsel voor gebruik.
Vortex het mengsel gedurende 20 seconden. Bereid de aptamer voor door hem drie minuten op 95 graden Celsius te denatureren en vervolgens gedurende twee minuten opnieuw op nul graden Celsius te vouwen. Breng 250 microliter van het geresuspendeerde streptavidin gecoate microkraalmengsel over in een buis van 1,5 milliliter en voeg 100 microliter biotinyleerd DNA-aptamer toe aan de buis.
Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten terwijl het draait met 25 omwentelingen per minuut. Centrifugeer het reactiemengsel bij 9.056 RCF gedurende 40 seconden bij kamertemperatuur. Was de tube vervolgens twee keer met 200 microliter Tris-HCl buffer.
Voeg 10 microliter van 100 milligram per milliliter BSA toe aan de gewassen monsterbuis en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur terwijl u draait met 25 omwentelingen per minuut. Was ten slotte de aptamer gemodificeerde microparels tweemaal in Tris-HCl-buffer door centrifugatie op 9.056 RCF gedurende 40 seconden bij kamertemperatuur. Sluit PEEK-buizen aan op de twee inlaten voor het injecteren van twee monsters en buffer, en de twee uitgangen voor het verzamelen en lozen van afval.
Vul met een spuit van 10 milliliter het microfluïdische acoustophoresekanaal met bubbelvrij gedemineraliseerd water. Bereid een precisiedrukregelaar voor met twee of meer uitgangskanalen om de vloeistofstroom te regelen. Injecteer het monster en de buffer na het voorbereiden van het apparaat door een druk van twee kilopascal op de monsterinlaat en vier kilopascal op de bufferinlaat uit te oefenen met behulp van de precisiedrukregeling.
Stel met behulp van een microscoop scherp op een kraal en verplaats deze naar het midden van het microfluïdische kanaal met behulp van de PZT. Genereer een resonantiefrequentie van 3,66 megahertz met behulp van een eenkanaals functiegenerator en versterk een typisch signaal met 16 decibel met behulp van een eindversterker. Observeer de scheidings- en verrijkingsprocessen op de acoustofluidische chip met een fluorescentiemicroscoop en een hogesnelheidscamera met 1.200 beelden per seconde.
De acoustophoretische chip die in deze studie werd geïntroduceerd, bevestigde dat, naarmate de spanning van de PZT toenam, de centrale concentratie van de 10 micrometer grote kralen toenam. Bij vijf volt van de PZT-spanning waren de meeste kralen van 10 micrometer in het midden geconcentreerd. De verhouding tussen het aantal aan de uitlaat verzamelde kralen en het totale aantal geïnjecteerde kralen van 10 micrometer werd het herstelpercentage genoemd.
De verhouding tussen het aantal kralen van 10 micrometer en het totale aantal verzamelde kralen werd zuiverheid genoemd. De resultaten gaven aan dat het apparaat een hoge scheidingsefficiëntie had voor kralen met een grootte van 10 micrometer. De aantallen GN- en GP-bacteriën gebonden aan elke aptamer gemodificeerde microkraal werden gemeten met behulp van een microscoop met een hogesnelheidscamera.
Alle vijf GN-bacteriën waren gebonden aan de kralen, terwijl aanzienlijk minder GP-bacteriën werden gebonden aan de geteste stoffen. De signaalsterkte verschilde aanzienlijk tussen de GN- en GP-bacteriën. De lijm die wordt gebruikt om de PZT te bevestigen, moet zo min mogelijk worden gebruikt voor de nauwkeurigheid van het golfen en de PZT en het microkanaal moeten parallel zijn.
Dit apparaat kan worden gebruikt om levende bacteriën of van bacteriën afgeleide biomarkers te detecteren in de periode van vroege diagnose van bacteriële infectieziekten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een microfluidische acoustophoresis-technologie voor de snelle en efficiënte scheiding van Gram-negatieve bacteriën uit diverse media. De methode maakt gebruik van aptameer-gemodificeerde microbeads om het isolatieproces te verbeteren, waardoor contactloze cel-scheiding met een redelijke doorvoer mogelijk wordt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Microfluïdica
- Acoustoforese
- Microbiologie
Achtergrond
- Microfluïdische systemen maken een nauwkeurige manipulatie van vloeistoffen op microschaal mogelijk.
- Acoustophoresis is een techniek die akoestische golven gebruikt voor partikelmanipulatie.
- Gram-negatieve bacteriën vormen een aanzienlijke uitdaging bij isolatie vanwege hun structurele eigenschappen.
- Aptameren zijn korte, enkelstrengse oligonucleotiden die selectief kunnen binden aan specifieke doelwitten.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een microfluïdische acoustophoresischip voor efficiënte bacteriële scheiding.
- Het optimaliseren van het isolatieproces voor zowel medische als milieumonsters.
- Het demonstreren van de effectiviteit van aptameer-gemodificeerde microbeads bij het verhogen van de scheidingsefficiëntie.
Gebruikte methoden
- Het ontwerpen van een microfluïdische acoustophorese-chip.
- Het hechten van lagen silicium en borosilicaatglas voor de fabricage van de chip.
- Het injecteren van een PS-monstermengsel in de chip voor scheiding.
- Het toepassen van anodisatie onder specifieke voltage- en temperatuuromstandigheden.
Belangrijkste resultaten
- Het microfluïdische acoustophoresis-systeem isoleerde succesvol Gram-negatieve bacteriën.
- Er werd een hoge doorvoersnelheid en contactloze scheiding bereikt.
- Aptameer-gemodificeerde microbeads verbeterden de isolatie-efficiëntie aanzienlijk.
- De methode is toepasbaar op zowel medische als milieu-monsters.
Conclusies
- Microfluïdische acoustoporese is een veelbelovende techniek voor de isolatie van bacteriën.
- Aptamer-modificaties verbeteren de selectiviteit en efficiëntie van het proces.
- Deze technologie zou gunstig kunnen zijn voor diverse toepassingen in de microbiologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Deze microfluïdische acoustophoresis-methode maakt een snelle, hoogzuivere isolatie van Gram-negatieve bacteriën uit complexe matrices mogelijk, waarmee een kritieke bottleneck in de vroege diagnostiek van infectieziekten en milieumonitoring wordt aangepakt. Door labelvrije akoestische scheiding te combineren met aptameer-gebaseerde specificiteit, ondersteunt deze technologie het minimaliseren van risico's bij het targeten in workflows voor antimicrobial discovery en biomarker-validatie. De aangetoonde recovery van >98% en zuiverheid van 97,8% bij een 10x concentratie biedt een schaalbaar, contactloos alternatief voor centrifugatie of filtratie voor preconlinische monsterpreparatie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele validatie van Gram-negatieve bacteriële targets mogelijk door levende pathogenen te isoleren uit heterogene biologische of milieu-monsters.
- Operationele waarde: Vermindert de verwerkingstijd van monsters en minimaliseert biomoleculaire schade in vergelijking met traditionele scheidingstechnieken.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door gezuiverde bacteriële fracties te leveren voor studies naar target-engagement en werkingsmechanismen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gezuiverde bacteriële inputs voor fenotypische screeningsassays, waardoor fout-positieven door contaminerende Gram-positieve soorten worden verminderd.
- Operationele waarde: Standaardiseert de monstervoorbereiding via reproduceerbare acoustoforetische focussering en aptameer-gemedieerde captuur.
- Schaalbaarheid: Het vertakkte kanaalontwerp maakt gelijktijdige verwerking, zuivering en concentratie mogelijk voor een hogere doorvoer in screeningscascades.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen de ontdekkingsfase en de preklinische stadia door consistente isolatie van Gram-negatieve bacteriën uit kliniekachtige matrices, zoals bloed of urine, mogelijk te maken.
- Afstemming van biomarkers: Faciliteert de detectie van levende bacteriën of afgeleide biomarkers in vroege diagnostische toepassingen, wat de ontwikkeling van translationele biomarkers ondersteunt.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Hoge waarden voor herstel en zuiverheid vergroten het vertrouwen in downstream-assays die worden gebruikt voor de evaluatie van lead-verbindingen.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen het continuüm van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek, en ondersteunt specifiek de monstervoorbereiding voor targetvalidatie, assay-gereidheid en mechanistische studies waarbij de zuiverheid van Gram-negatieve bacteriën kritiek is.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door specifieke Gram-negatieve stammen te isoleren uit gemengde culturen of milieuproefmonsters voor het verminderen van risico's bij doelwitselectie.
- Screening: Maakt assay-klare bacteriële populaties mogelijk met minimale overdracht van interfererende componenten, waardoor de betrouwbaarheid van de screening wordt verbeterd.
- Analytics: Levert kwantitatieve output via fluorescentiemicroscopie en high-speed imaging, wat binding-ratio's tussen beads en bacteriën en vergelijkingen van signaalsterkte mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan op preklinische workflows door isolatie uit medisch relevante monsters mogelijk te maken, wat de continuïteit bij de ontwikkeling van modellen voor infectieziekten ondersteunt.
- Bedrijfbrede herbruikbaarheid: Het chipgebaseerde ontwerp en de drukgestuurde vloeistofdynamica maken standaardisatie tussen laboratoria en aanpassing aan diverse monstertypes mogelijk zonder dat herontwerp nodig is.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit als gevolg van onzuiverheden in monsters te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt de reproduceerbaarheid door nauwkeurige controle van de akoestische kracht en gestandaardiseerde preparatie van aptameer-beads.
- Strategische waarde: Verbetert de betrouwbaarheid van go/no-go-beslissingen in antimicrobiële programma's door het leveren van biologische inputs met een hoge getrouwheid.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van leads mogelijk op basis van zuiverdere mechanistische gegevens uit gezuiverde bacteriële fracties.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microfluïdisch ontwerp, optimalisatie van acoustoforetische parameters en protocollen voor aptameer-bead conjugatie.
- Afhankelijk van piëzo-elektrische transducers, functiegeneratoren, vermogensversterkers en fluorescentiemicroscopie met high-speed imaging-capaciteit.
- Necessiteert standaardisatie van buffercondities, stroomsnelheden (2 kPa monster, 4 kPa buffer) en PZT-spanningskalibratie tussen gebruikers.
- Aanpassing aan verschillende bacteriële soorten of monstermatrices kan re-optimalisatie van de aptameerselectie en de acoustische resonantiefrequentie vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten door adhesie veroorzaakte kanaalcorrugatie bij overmatig gebruik van cyanoacrylaat, wat de uniformiteit van het acoustische veld beïnvloedt.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Microuidic Acoustophoresis Chip Design and Fabrication
1:23
Bacterial Strains and Culture
1:56
Microbeads and Immobilization of Aptamer onto Microbeads
3:10
Acoustophoresis Setup and Operation
4:19
Results: Using Microfluidics to Capture GN Bacteria from Culture Samples at High Speed
5:26
Conclusion
