Verschuivingen op neuron-glia-circuit visualiseren met de calciumbeeldvormingstechniek

Het algemene doel van deze procedure is om veranderingen in cytosolische calciumconcentraties in levende cellen te volgen om neuronale of gliaresponsen te differentiëren op basis van kaliumchloride of ATP-stimuli. Calcium is een belangrijke tweede boodschapper die betrokken is bij verschillende cellulaire processen, waaronder neurotransmissie, plasticiteit en apoptose. De komst van hoogselectieve fluorescerende calciumkleurstof, zoals Fura-2 AM, geassocieerd met de ontwikkeling van betere fluorescerende microscopen en berekeningsmethoden, leverde optische gegevens met een hoge resolutie op met een hoge mate van ruimtelijke en temporele resolutie om calciumsignalering op levende cellen en organismen in beeld te brengen.

Dit protocol is aanpasbaar aan verrijkte neuron, gezuiverde glia of gemengde populatieculturen. Het houdt bij welke celtypen reageerden op bepaalde stimuli op basis van de differentiële respons op kaliumchloride en ATP. Kaliumchloride verandert het membraanpotentiaal van cellen.

En dit opent spanningsafhankelijke calciumkanalen, in wezen uitgedrukt door neuronen. Aan de andere kant activeert ATP P2X7 groot deel kanaal, voornamelijk aanwezig in gliacellen. Door kaliumchloride- en ATP-stimuli te koppelen aan andere geneesmiddelen, is het mogelijk om te zien welk compartiment van het zenuwstelsel erop reageert, op basis van de toename van de intracellulaire calciumconcentratie.

Voor deze procedure hebt u enkele chirurgische instrumenten of pincetten nodig. Gebruik een bioveiligheidskast en voer de beste praktijken uit om besmetting te voorkomen. Om de netvlieskweek van de kip te starten, opent u voorzichtig een bevruchte eicel aan de onderkant, waar de luchtcel zich bevindt.

Verwijder de inhoud in een petrischaaltje en ga verder met de embryodonatie door onthoofding met een pincet. Zodra de kop is verwijderd, breng je het naar een schone petrischaal en voeg je er wat calcium- en magnesiumvrije oplossing aan toe. Verwijder vervolgens de ogen en zorg ervoor dat ze tijdens het proces niet worden beschadigd.

Breng het oog naar een andere petrischaal met CMF-oplossing. Begin met een pincet het oog te ontleden door de lens te verwijderen. Doe vervolgens, beginnend bij het gat dat de lens achterlaat, drie of vier longitudinale sneden in het oog.

Verwijder de transparante glasachtige behuizing met de nodige voorzichtigheid. Zorg ervoor dat het netvlies er niet aan vastzit. Maak vervolgens het netvlies voorzichtig los van het gepigmenteerde epitheel.

Verwijder eventueel achtergebleven epitheelweefsel. Wanneer het netvlies helemaal helder is, knip het dan in kleine stukjes. Neem al het netvliesweefsel met behulp van een geautomatiseerde pipet.

Centrifugeer kort het netvlies om alle CMF te verwijderen. Voeg 1 ml 0,25% trypsine toe. En incubeer het weefsel bij 37 C gedurende 10 minuten.

Stop de trypsinereactie door toevoeging van 1 ml medium met 10% foetaal kalfsserum. Centrifugeer het netvlies om alle trypsine te verwijderen. Was de cellen twee of drie keer met medium dat 10% FCS bevat.

Voeg vervolgens 2 ml medium per netvlies toe en dissociëer het voorzichtig mechanisch. Verdun de cellen zodat je ze goed kunt tellen met een hemocytometer. Gebruik 15 mm coverslips beschermd met poly-L-lysine en laminine om de hechting van de cel te bevorderen.

Pipetteer 50 L van uw verdunde cellen op elke coverslip. Incubateer de cellen bij 37 C in 5% CO2-atmosfeer. En koel ze om het glas te bevestigen.

Dit duurt ongeveer één tot twee uur. Voeg 1 ml medium toe en breng het terug naar de incubator tot de dag van het experiment. Vervang indien nodig de helft van het medium om de twee tot drie dagen.

Reconstitueer een injectieflacon van 50 g Fura-2 AM met 50 L DMSO. Krebs-oplossing is een goede optie om cellen over te dragen tijdens het experiment, omdat het de fluorescentiemeting niet verstoort. Verwarm de oplossing voor op 37 voordat u begint.

Voeg Poloxamer 407 toe. Voeg Fura-2 AM en DMSO toe. Soniceer het gedurende zeven minuten in een waterbad.

Bereid een 6-well plaat toe door Krebs-oplossing toe te voegen aan drie putten en de werkende Fura-2-oplossing op een andere. Was de coverslip bevat uw cellen drie keer voordat u ze goed aan de Fura-2 toevoegt. Incubeer de cellen bij 37 C en 5% CO2-atmosfeer gedurende 30 minuten in een donkere incubator.

Was het na incubatie nog drie keer. Breng het over naar een andere ontvanger met Krebs en bescherm het tegen het licht. Het is mogelijk om de voorbereide Fura-2 te hergebruiken om meer coverslips met cellen te incuberen.

Voeg voor elke run silicium toe aan de afdekplaatsteun en -kamer om lekkage van de oplossing te voorkomen. Haal de hoeslip uit de Krebs-oplossing en was de bodem voorzichtig met gedestilleerd water om zoutkristallisatie op de microscooplens te voorkomen. Leg de coverslip op de steun en druk voorzichtig op de randen.

Bevestig de coverslip-ondersteuning en -kamer aan de microscoop en begin de cellen te doordrenken met Krebs-oplossing. Selecteer de juiste cellen en kies een goed veld. Bepaal handmatig de gebieden van belang door cellichamen te selecteren op basis van hun verschillende morfologie.

De variaties van de calciumconcentratie werden geëvalueerd door de verhouding van de uitgestoten fluorescentie bij 510 nm na alternatieve excitatie bij 340 en 380 nm te kwantificeren. Na het toevoegen van kaliumchloride is het mogelijk om veel cellen te zien gloeien en de fluorescentierespons op de grafiek te zien stijgen. Kaliumchloride opent spanningsafhankelijke calciumkanalen, presenteert zich voornamelijk in neuronen.

Elke afzonderlijke lijn in de grafiek vertegenwoordigt het unieke interessegebied. Daarom is het mogelijk om individuele celreacties tijdens het experiment te volgen. ATP-stimuli openen de P2X7-receptor, in wezen uitgedrukt door gliacellen.

Dit is een verrijkte neuroncultuur. Daarom zijn er hier weinig gliacellen. Dit is de reden waarom zo weinig cellen reageren op de ATP-stimuli.

Verworven waarden werden verwerkt met behulp van de Metafluor-software. Experimentele resultaten worden uitgedrukt in een Excel-tabel, waarbij elke rij een afzonderlijke cel vertegenwoordigt en elke regel een tijdspunt. Met behulp van Excel-software is het mogelijk om calciumvariaties van individuele cellen afzonderlijk of van allemaal in dezelfde grafiek te plotten.

Om de hoeveelheid reactieve cellen op een stimulus te kwantificeren, stelt u een cutoff in van 30% die de calciumbasislijnniveaus verhoogt. Hier gebruiken we netvliescellen in kweek van embryonale dag 8-kuikens om te onderzoeken hoe neuronen en glia signaleren in termen van calciumverschuivingen, na ontvangst van 50 mm kaliumchloride en 1 mm ATP-stimuli. In elk experiment werden ongeveer 100 cellen gemakkelijk geanalyseerd.

Figuur A vertegenwoordigt een gemengde cultuur met zowel neuronen als glia, die gedurende een week werd gehandhaafd. Wanneer we de reacties kwantificeren, is het mogelijk om te zien dat ongeveer de helft van de geanalyseerde cellen kaliumchloride beantwoordt en de andere helft reageerde op ATP. Figuur B verwijst naar een met neuronen verrijkte cultuur.

Het werd slechts drie dagen geïncubeerd, daarom hebben de meeste gliacellen nog niet gedifferentieerd. In dit geval beantwoordt 89% van de cellen kaliumchloride, waardoor de prevalentie van neuronen wordt versterkt. Figuur C toont een gezuiverde gliacultuur.

Deze cellen werden gedurende 10 dagen onderhouden met gemiddelde veranderingen om de drie dagen. Na die tijd sterft het meeste neuron, waardoor alleen glia overblijven. Inderdaad, deze cultuur werd uitsluitend geactiveerd door ATP.

Deze methodologie is breed gebruikt vanwege de universele eigenschappen van calcium als tweede boodschapper. De fenotypische analyse kan worden verbeterd door deze methodologie aan te vullen met immunochemie van vaste cellen na calciumbeeldvorming. Dit protocol kan ook worden aangepast aan andere gemengde celsystemen die andere calciumkanalen tot expressie brengen.

De belangrijke tip is om selectieve reacties van verschillende soorten cellen te vinden die gecorreleerd zijn met hun fenotypische expressie.