Modellering neonatale intraventriculaire bloeding door intraventriculaire injectie van hemoglobine

Dit protocol is belangrijk omdat we een klinisch relevant model van IVH-geïnduceerd hersenletsel en hydrocefalie ontwikkelen, waarbij gebruik wordt gemaakt van hemoglobine-injectie in de ventrikels, wat de daaropvolgende kwantificering van ventrikelvolumes in de toepassing mogelijk maakt, om nieuwe therapeutische strategieën te testen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de studie van de pathologie van IVH mogelijk maakt die specifiek wordt gemedieerd door hemoglobine en ijzerroute bloedafbraakproducten. Deze techniek is ook gemakkelijk te gebruiken en veelzijdig.

De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot het ontwikkelen van therapieën voor post-hemorragische hydrocephalus, omdat het een verder begrip van IVH-pathofysiologie en de waardering van klinisch relevante behandelingsstrategieën voor de preventie van neurologische gevolgen na IVH mogelijk maakt. De procedure wordt gedemonstreerd door Sruthi Ramagiri, een Associate Post-doc van het Australia Laboratory. Om te beginnen plaatst u de verdoofde rat in het stereotactische apparaat met zijn neus in de anesthesieadapter.

Zet vervolgens de kop vast door de niet-scheurende oorstangen op de externe auditieve meatus aan te spannen. Om het hoofd schoon te maken, raak je eerst een steriele katoenen applicator aan die in Betadine is gedrenkt in het midden van het hoofd en beweeg je naar buiten om de Betadine in cirkels te verspreiden. Herhaal vervolgens het proces met een applicator gedrenkt in 70% ethanol.

Maak vervolgens met behulp van een scalpel een incisie van 0,3 centimeter verticaal in het midden van het hoofd om de bregma van de schedel bloot te leggen. Droog vervolgens het gebied af met een applicator met katoenen punt. Om de stereotactische injector in te stellen, trekt u de eerder bereide hemoglobineoplossing in een spuit van 0,3 of 0,5 milliliter en plaatst u de spuit in het stereotactische injectorsysteem.

Schakel vervolgens de stereotactische injectorinterface in en klik op de configuratieknop om het injectievolume en de tariefinstellingen in te voeren. Klik op volume en stel het volume in op 20.000 nanoliter. Klik vervolgens op infusiesnelheid en stel de snelheid in op 8.000 nanoliter per minuut.

Klik op de resetpositieknop om de configuratie af te sluiten. Spoel de punt van de naald door op de infuse-knop te klikken totdat een kleine kraal van hemoglobine aan de naaldpunt verschijnt en gebruik vervolgens een applicator met katoenen punt om de kraal voorzichtig te verwijderen. Om de dierlijke injectie te starten, stelt u de bregma in op nul op het stereotactische injectiesysteem door de middellaterale en anteroposteriorposities van de spuit aan te passen.

Laat vervolgens de naald van de spuit zakken om de schedel bij de bregma voorzichtig aan te raken. Nadat u de coördinaten van uw keuze hebt geïdentificeerd, tilt u de naald van de spuit een centimeter boven de schedel op om de hoofdhuid vrij te maken. Stel de middellaterale en anteroposteriorcoördinaten in.

Laat vervolgens de spuit voor de naald zakken om de schedel voorzichtig aan te raken en stel de dorsoventrale coördinaat gedurende 30 seconden in. Zodra de coördinaten zijn ingesteld, begint u met injecteren door op de knop Uitvoeren op de stereotactische injectorinterface te klikken. Nadat de injectie is voltooid, laat u de naald twee minuten op zijn plaats om de terugstroom van de oplossing te minimaliseren.

Trek vervolgens de spuit langzaam op langs de dorsoventrale coördinaat gedurende twee minuten, totdat de naaldpunt twee centimeter boven de hoofdhuid ligt. Draai vervolgens de stereotactische injectorarm weg van het operatieveld en sluit de hoofdhuid met een 6-O monofilament hechting. Voer voor MRI T2-gewogen beeldvorming uit door een T2-gewogen snelle spin-echosequentie te selecteren.

Nadat u de MRI-parameters hebt ingesteld zoals beschreven in de tekst, klikt u op de knop Doorgaan om de reeks te starten. Voor beeldverwerking en hersenvolumeanalyse opent u de native T2-gewogen gegevens in de segmentatiesoftware. Als u de laterale ventrikels handmatig wilt afbakenen, klikt u op de penseelmodus en selecteert u de vierkante penseelstijl en past u de penseelgrootte aan op één.

Klik vervolgens op lay-outcontrole, selecteer axiale weergave en klik op zoomen om te passen. Plaats vervolgens de cursor op de afbeelding en traceer en vul de laterale ventrikelruimte. Klik ten slotte op segmentatie in de werkbalk, gevolgd door volume en statistieken om de gesegmenteerde volumes te bekijken.

Dieren die hemoglobine-injectie ondergingen, ontwikkelden matige ventriculomegalie wanneer ze via MRI werden beoordeeld. Met aanzienlijk grotere laterale ventrikels na 24 uur en 72 uur na hemoglobine-injectie, vergeleken met ACSF-geïnjecteerde dieren. Hoewel het verschil in lateraal ventriculaire volume tussen de twee groepen ratten na 38 dagen niet significant was, toonden MRI-scans aan dat 44% van de ratten die hemoglobine kregen nog steeds onopgeloste ventriculomegalie had.

Bovendien resulteerde injectie van hemoglobine in vergelijking met ACSF in een significante afname van het volume van de witte stof na 38 dagen. Hemoglobine bevorderde ook een ontstekingsreactie in vivo, zoals blijkt uit het significant hogere niveau van de pro-inflammatoire cytokinetumornecrosefactor alfa na het injecteren van hemoglobine, maar niet zoutoplossing of volbloed. Bovendien onthulde immunohistochemische kleuring van het gliale fibrillaire zure eiwit een significant hogere activering van astrocyten na hemoglobine-injectie dan na ACSF-injectie.

Het belangrijkste om te onthouden bij het proberen van deze procedure is om de juiste injectiecoördinaten in te stellen om de hemoglobineafgifte in de laterale ventrikels te garanderen. Volgens deze procedure kunnen CSF-tracers in de CSF-ruimte worden afgeleverd om veranderingen in de CSF-circulatie en effluxpatronen na IVH te evalueren. Deze aanvullende methode behandelt hoe de CSF-stroom wordt gewijzigd in IVH PHH.