Kwantificering van subcellulaire glycogeenverdeling in skeletspiervezels met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie
7 februari 2022
Een aangepaste postfixatieprocedure verhoogt het contrast van glycogeendeeltjes in weefsel. Dit artikel biedt een stapsgewijs protocol dat beschrijft hoe het weefsel moet worden behandeld, de beeldvorming moet worden uitgevoerd en stereologische methoden moeten worden gebruikt om onbevooroordeelde en kwantitatieve gegevens te verkrijgen over vezeltypespecifieke subcellulaire glycogeenverdeling in skeletspieren.
De meting van het glycogeengehalte in afzonderlijke cellen en subcellulaire organisaties is belangrijk omdat in de meeste celtypen afzonderlijke cellen zich anders aanpassen aan veranderende fysiologische omstandigheden en ziekten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dus de zeer hoge resolutie in de transmissie-elektronenmicroscoop. Dit verbetert de mogelijkheid om gelokaliseerde subcellulaire structuren te hebben en ook in deze inhoud in deze techniek hier, is het belangrijk dat de glycogeenkleuring antilichaamvrij is.
We hebben dus geen specificiteit om ons zorgen over te maken. Om een beter contrast op glycogeen te krijgen, gebruikt u gewoon kaliumferrocyanide 1,5% in plaats van kaliumferrocyanide. Bereid 1,6 milliliter van de primaire fixatieve oplossing door 2,5% glutaaraldehyde toe te voegen aan 0,1 molaire natriumcacodylaatbuffer in een microcentrificatiebuis van twee milliliter.
Bewaar het bij vijf graden Celsius gedurende maximaal 14 dagen. Isoleer een klein monster uit de spierbiopsie of hele spier met een maximale diameter van één millimeter in elke richting en is langer in de lengterichting dan dwarsdoorsnede. Plaats het monster in de buis met de koude primaire fixatieoplossing.
Bewaar het bij vijf graden Celsius gedurende 24 uur. Was het monster vervolgens vier keer in een natriumkactodocytenbuffer van 0,1 kies. Verwijder met behulp van transferpipeten de gebruikte buffer uit de buis en laat het monster onaangeroerd en voeg de verse buffer toe.
Fixeer het monster na met 1%osmiumtetroxide en 1,5% kaliumferrocyanide in 0,1 molaire natriumkactrodinebuffer gedurende 120 minuten bij vier graden Celsius. Spoel het monster tweemaal in dubbel gedestilleerd water bij kamertemperatuur. Droog uit door onderdompeling in een gesorteerde reeks ethanol bij kamertemperatuur.
Infiltreer het monster met mengsels van propyleenoxide en epossidische harskwaliteit bij kamertemperatuur met behulp van de genoemde volumeverhoudingen. De volgende dag, integreer monsters in 100% verse epossidische hars in mallen en polymeriseer bij 60 graden Celsius gedurende 48 uur. Monteer het blok van een monster op de ultramicrotomehouder.
Snijd het blok op het oppervlak af met een scheermesje om het weefselniveau te bereiken. Monteer een diamantmes voor het monster en lijn het monsteroppervlak parallel aan het mes uit. Produceer een halfdunne sectie van één micrometer dikte met het diamantmes om de oriëntatie van het monster te controleren.
Kleur het halfdunne gedeelte met toluidineblauw voor observatie met lichtmicroscopie. Snijd vervolgens het blok verder bij om het interessegebied te verkleinen om de juiste ultradunne secties te krijgen. Snijd ultradunne secties van 60 tot 70 nanometer dikte met een tweede diamantmes.
Verzamel één tot twee secties op een heel koperen rooster met behulp van een perfecte lus. Om de secties te contrasteren, dompelt u de roosters gedurende 20 minuten onder in uranylacetaatoplossing en wast u de roosters in dubbel gedestilleerd water en dompelt u de roosters vervolgens gedurende 15 minuten onder in loodcitraat en wast u de roosters opnieuw in dubbel gedestilleerd water. Schakel de transmissie-elektronenmicroscoopcomputer en beeldopnamesoftware in, neem digitale beelden op met een digitale Slow Scan CCD-camera en de bijbehorende beeldbewerkingssoftware.
Na het invoegen van het raster met meerdere secties in de microscoopfase, screent u het raster aanvankelijk bij lage vergroting om de secties van de beste kwaliteit te kiezen en de richting van de spiervezels te bepalen. Stel vervolgens het beeld scherp bij een vergroting boven 30.000 met de straal gecentreerd op een perifere vezel in de sectie en neem beelden op met een seconde belichtingstijd bij de gewenste vergroting. Zorg ervoor dat de afbeeldingen worden verdeeld over de lengte en breedte van de vezel in een gerandomiseerde bot systematische volgorde om onbevooroordeelde resultaten te verkrijgen en herhaal de beeldvorming totdat zes tot 10 vezels in beeld zijn gebracht.
Importeer afbeeldingen naar afbeelding J door op bestand te klikken gevolgd door openen. Stel de globale schaal in op de oorspronkelijke grootte van de afbeelding door op analyseren te klikken en vervolgens schaal in te stellen. Om 100% in te zoomen klik je op afbeelding, ga je naar zoomen en klik je in.
Meet de dikte van één Z-schijf per afbeelding van de myofibrillaire ruimte met behulp van het rechte lijngereedschap uit het gereedschapsmenu en bereken de gemiddelde Z-schijfdikte van elk van de zes tot 10 vezels. Gebruik het gereedschap Gesegmenteerde lijn om de lengte van de buitenste myofibril te meten die net onder het subsarcolemmale gebied zichtbaar is. Als u een raster wilt invoegen, klikt u op analyseren, selecteert u gereedschappen en selecteert u vervolgens raster.
Stel nu het gebied per punt in op 32.400 vierkante nanometer. Tel het aantal treffers binnen de beschikbare lengte in de 12 subsarcolemmale afbeeldingen waar een kruis het subsarcolemmale glycogeen raakt. Voeg een raster in door op analyseren te klikken, selecteer vervolgens gereedschappen, gevolgd door raster en stel het gebied per punt in op 160.000 vierkante nanometer.
Tel het aantal treffers in de 12e myofibrillaire beelden waarbij een kruis de intramyofibrillaire ruimte raakt. Aan de andere kant, om een raster in te voegen, klikt u op analyseren, selecteert u gereedschappen en selecteert u vervolgens raster. Stel nu het gebied per punt in op 3.600 vierkante nanometer.
Tel het aantal treffers in de 12e myofibrillaire beelden waarbij een kruis het intramyofibrillaire glycogeen raakt. Voeg een raster in door op analyseren te klikken, selecteer vervolgens gereedschappen, gevolgd door raster en stel het gebied per punt in op 32.400 vierkante nanometer. Tel het aantal treffers in de 12e myofibrillaire beelden waarbij een kruising het intermyofibrilllar glycogeen raakt.
Gebruik het raster van 32, 400 vierkante nanometer om willekeurig de glycogeendeeltjes te kiezen, begin met het vierkant linksboven en beweeg indien nodig naar links. Meet met behulp van een rechtlijnig gereedschap de diameter van vijf willekeurig gekozen glycogeendeeltjes van elk zwembad voor elk van de 12 afbeeldingen om een gemiddelde van 60 deeltjes per pool per vezel te verkrijgen. Deze figuur toont de normale waarden van de drie glycogeenpools.
Er kan worden waargenomen dat intermyofibrillaire glycogeenwaarden dicht bij normaal worden verdeeld, terwijl zowel intramyofibrillair als subsarcospecletaal glycogeen een scheve verdeling vertonen waarbij vezels soms een overmatige hoeveelheid glycogeen hebben. Onder alle stappen is het erg belangrijk om kaliumferrocyanide te gebruiken. De analyse van glycogeen kan worden gecombineerd met analyse van mitochondrion en lipidedruppels die ons begrip van hoe andere belangrijke metabole componenten correleren met glycogeen en spiergezondheid kunnen verbeteren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een gewijzigde post-fixatieprocedure die het contrast van glycogeendeeltjes in weefsel verbetert. Het protocol beschrijft de behandeling van weefsel, beeldvormingstechnieken en stereologische methoden voor het kwantificeren van glycogeenverdeling in skeletspier.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Histologie
Achtergrond
- Glycogeengehaltemeting is cruciaal voor het begrijpen van cellulaire reacties op fysiologische veranderingen.
- Enkelvoudige cellen vertonen verschillende aanpassingen aan omstandigheden en ziekten.
- Beeldvorming met hoge resolutie is essentieel voor het observeren van subcellulaire structuren.
- De techniek vermijdt specificiteitsproblemen door gebruik te maken van antilichaam-vrije glycogeenkleuring.
Doel van de studie
- Om het contrast van glycogeendeeltjes in weefselmonsters te verbeteren.
- Om een gedetailleerd protocol voor beeldvorming en analyse te bieden.
- Om onbevooroordeelde gegevens over glycogeenverdeling in skeletspier te verkrijgen.
Gebruikte methoden
- Gewijzigde post-fixatieprocedure met kaliumferrocyanide.
- Bereiding van fixeeroplossing met glutaaraldehyde en natriumcacodylaatbuffer.
- Transmissie-elektronenmicroscopie voor beeldvorming met hoge resolutie.
- Stereologische methoden voor kwantitatieve analyse.
Belangrijkste resultaten
- Verbeterd contrast van glycogeendeeltjes werd bereikt.
- Protocol maakt nauwkeurige beeldvorming van subcellulaire structuren mogelijk.
- Onbevooroordeelde kwantificering van glycogeenverdeling werd aangetoond.
- Technique is toepasbaar op verschillende weefseltypes.
Conclusies
- De gewijzigde procedure verbetert de glycogeenvisualisatie aanzienlijk.
- Biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van glycogeen in skeletspier.
- Faciliteert een beter begrip van cellulaire aanpassingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This TEM-based glycogen quantification method enables high-resolution subcellular analysis critical for de-risking metabolic target hypotheses in skeletal muscle. By resolving glycogen distribution across distinct subcellular compartments, it provides mechanistic insights that improve predictive confidence in preclinical models of metabolic disease. The approach supports early discovery workflows requiring subcellular phenotyping and biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glycogen storage patterns to clarify metabolic pathway involvement in disease models.
- Operational Value: Provides subcellular resolution to distinguish artifactual from biologically relevant glycogen accumulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative ultrastructural data (volume fraction, particle diameter) for assay standardization across subcellular glycogen pools.
- Operational Value: Supports development of reproducible, antibody-free staining protocols compatible with high-throughput EM imaging.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links subcellular glycogen distribution to mitochondrial and lipid droplet morphology for integrated metabolic phenotyping.
- Operational Value: Enables cross-comparison of glycogen dynamics in disease-relevant skeletal muscle models prior to preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows where subcellular metabolic phenotyping informs target validation and lead identification decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing non-uniform glycogen storage that challenges homogeneous assumptions in metabolic modeling.
- Screening: Delivers quantitative glycogen readouts (volume fraction, particle size) enabling comparison across genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Employs stereological grid-based counting to generate unbiased, statistically robust estimates of glycogen distribution.
- Translational Research: Connects glycogen ultrastructure to organelle morphology, supporting biomarker alignment in metabolic disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized TEM workflow for subcellular glycogen quantification applicable across multiple skeletal muscle studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving glycogen heterogeneity at the subcellular level.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, staining, and stereological analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing subcellular metabolic context that complements bulk biochemical assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on subcellular glycogen phenotypes in disease models.
Implementation Considerations
- Expertise in TEM sample preparation, ultramicrotomy, and stereological analysis is required.
- Access to transmission electron microscopy with digital imaging capabilities and image analysis software (e.g., ImageJ) is essential.
- Standardization across teams requires adherence to fixed staining concentrations (e.g., potassium ferrocyanide 1.5%) and grid-based counting parameters.
- Adaptation to other muscle fiber types or tissue systems may require optimization of sectioning and staining protocols.
- Methodological limitations include sampling bias if fiber orientation or section distribution is not randomized, as noted in the protocol.
