Kwantitatieve fractioneringstechniek voor microtubuli om stabiele microtubuli, labiele microtubuli en vrije tubuline in muizenweefsels te scheiden
17 november 2023
Microtubuli, die tubulinepolymeren zijn, spelen een cruciale rol als onderdeel van het cytoskelet in eukaryote cellen en staan bekend om hun dynamische instabiliteit. Deze studie ontwikkelde een methode voor het fractioneren van microtubuli om ze te scheiden in stabiele microtubuli, labiele microtubuli en vrije tubuline om de stabiliteit van microtubuli in verschillende muizenweefsels te evalueren.
Ons nieuwe protocol helpt bij het onderscheiden en kwantificeren van drie statussen van buisringen, zoals stabiele microtubuli, labiele microtubuli en vrije tubuli in dierlijke weefsels. Deze techniek bestaat uit eenvoudige stappen en kan de structurele stabiliteit van slangen evalueren, die niet kan worden gedetecteerd door kwantificering van slangen na translationele modificatie. Deze methode is essentieel voor het onderzoek naar en de ontwikkeling van therapeutische manieren voor ziekten waarbij de stabiliteit van microtubuli van cruciaal belang is, zoals de ziekte van Alzheimer en kanker.
Start de procedure door de laboratoriumkleding voor te bereiden op weefseldissectie. Vul een doos met crushed ice en plaats er twee petrischaaltjes op. Vul een schaal met ijskoude fosfaatbufferoplossing of PBS voor voorbijgaande wassing en opslag van ontlede weefsels.
Leg het met PBS bevochtigde filtreerpapier op de tweede schaal. Weeg vervolgens de microbuisjes van 1,5 milliliter gevuld met PBS voor de opslag van ontleed weefsel. Nadat u de weefsels uit een geëuthanaseerde muis hebt geëxtraheerd, brengt u ze over naar de buisjes en weegt u elke microbuis opnieuw.
Verplaats de weefsels in een glazen homogenisator met ijskoude microtubuli-stabiliserende buffer of MSB+medium, en homogeniseer het weefsel onmiddellijk met behulp van een gekoelde homogenisator. Breng nu het weefselhomogenaat over in een microbuis van twee milliliter met behulp van een pasteurpipet en centrifugeer gedurende drie minuten bij twee graden Celsius bij 2.400 G. Breng het supernatans over in een nieuwe microbuis van 1.5 milliliter om het vuil te verwijderen.
Vortex het supernatans of de S1-fractie in een nieuwe microbuis van 1,5 milliliter. Pipetteer onmiddellijk 200 microliter van de S1-fractie in een centrifugatiemicrobuisje en centrifugeer bij 100.000 G met behulp van een TLA-55-rotor gedurende 20 minuten bij twee graden Celsius. Scheid na de tweede centrifugatie het S2-supernatans van het P2-neerslag.
Breng onmiddellijk de volledige hoeveelheid van de S2-fractie over in een centrifugatiemicrobuis en gebruik een TLA-120.2-rotor om deze gedurende 60 minuten bij twee graden Celsius op 500.000 G te laten draaien. Scheid na de derde centrifugatie het S3-supernatans van het P3-neerslag. Los de volledige S3-fractie op in 200 microliter 2X natriumdodecylsulfaat of SDS-monsterbuffer.
Meng de resterende S1-fracties met een gelijk volume van 2X SDS-monsterbuffer voor gebruik als standaardcurve voor western blotting. Voeg vervolgens 400 microliter SDS-monsterbuffer toe aan de P2- en P3-fractiebuisjes. Sonificeer vervolgens kort de oplossing om het neerslag op te lossen voordat u de monsters overbrengt in nieuwe microbuisjes van 1.5 milliliter en ze in de koelbox plaatst.
Kook alle monsters gedurende drie minuten op 100 graden Celsius. Microtubuli in de P2-fractie waren goed voor 34,86% van de totale alfa-tubuline in een muizenbrein, terwijl die in de P3- en S3-fracties respectievelijk 56,13% en 9,01% voor hun rekening namen. Het percentage bèta-3-tubuline in de P2-, P3- en S3-fracties verschilde niet significant van dat van alfa-tubuline.
De S2-fractie vertoonde een beperkte doorgang van tubuline door een 300-kilodalton ultrafiltratie-spinkolom, terwijl de S3-fractie volledige doorgang van tubulinecomplexen mogelijk maakte. Chromatografische scheiding resulteerde in een 100-kilodalton elutie van S3-tubuline. In elke fractie werden gelijke hoeveelheden alfa- en bètatubuline teruggevonden.
P2-fracties waren significant verrijkt met geacetyleerde alfa-tubuline, terwijl tyrosinated alfa-tubuline dominant was in de P3-fractie. Het bevriezen van de hersenen voorafgaand aan homogenisatie resulteerde in een verlaagde alfa-tubulineconcentratie in de P2-fracties. Alfa-tubuline nam echter toe in de P3-fractie.
Bevriezing verlaagde ook de acetyleringsniveaus en verhoogde de tyrosinatieniveaus van alfa-tubuline in de P2-fractie. Behandeling met nocodazol verlaagde alfa-tubuline in de P2-fractie. In tegenstelling tot bevriezing had nocodazol geen invloed op de posttranslationele modificaties van P2-tubuline.
Het hersenweefsel vertoonde een significant hogere concentratie P2-tubulinen, terwijl P3-tubulines geconcentreerd waren in proliferatief weefsel. Western blotting toonde aan dat de P2-tubuline die specifiek in het zenuwstelsel wordt aangetroffen, afkomstig is van stabiele microtubuli en P3-tubuline afkomstig is van labiele microtubuli. De stabiliteit van microtubuli is zeer dynamisch.
Het is belangrijk om dit protocol snel, zonder onderbrekingen, te voltooien in een omgeving met koude temperaturen. Zorg er ook voor dat de weefsels en fracties niet zijn ingevroren totdat ze zijn opgelost in de SDS-monsterbuffer. Het combineren van immuunpresentatie met behulp van elke fractie met proteomics zal naar verwachting factoren identificeren die betrokken zijn bij de dynamiek van microtubuli.
Met behulp van deze methode hebben we onthuld hoe normaal tau bestaat op microtubuli. Het kan ook worden gebruikt om te bestuderen hoe het abnormaal wordt in verouderde hersenen om nieuwe medicijndoelen van dementie te identificeren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een nieuw protocol voor het onderscheiden en kwantificeren van stabiele microtubuli, labiele microtubuli en vrij tubuline in dierlijke weefsels. De methode evalueert de structurele stabiliteit van microtubuli, wat cruciaal is voor het begrijpen van ziekten zoals Alzheimer en kanker.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Microtubulusdynamiek
Achtergrond
- Microtubuli zijn essentiële componenten van het cytoskelet in eukaryote cellen.
- Ze vertonen dynamische instabiliteit, wat invloed heeft op cellulaire functies.
- Inzicht in de stabiliteit van microtubuli is cruciaal voor therapeutische ontwikkelingen.
- Ziekten zoals Alzheimer en bepaalde vormen van kanker zijn gekoppeld aan disfunctie van microtubuli.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het fractioneren van microtubuli in muizeweefsels.
- Om de stabiliteit van verschillende microtubuli-toestanden te evalueren.
- Om het begrip van microtubuli-gerelateerde ziekten te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van laboratoriumkleding voor weefseldissectie.
- Gebruik van ijskoude fosfaatbuffersolution voor de weefselverwerking.
- Fractionering van microtubuli in stabiele, labiele en vrije tubuline.
- Kwantificering van de stabiliteit van microtubuli via het nieuwe protocol.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol maakt effectief onderscheid tussen stabiele en labiele microtubuli.
- Kwantificering geeft inzicht in de stabiliteit van microtubuli in diverse weefsels.
- De methode is eenvoudig en reproduceerbaar voor gebruik in het laboratorium.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de dynamiek van microtubuli in de context van ziekten.
Conclusies
- Dit nieuwe protocol is een waardevol instrument voor onderzoekers die de stabiliteit van microtubuli bestuderen.
- Het heeft potentiële toepassingen bij het begrijpen en behandelen van ziekten die verband houden met microtubuli-dysfunctie.
- Verder onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om therapeutische wegen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Een nauwkeurige beoordeling van de stabiliteit van microtubuli is essentieel voor het evalueren van therapeutische mechanismen bij neurodegeneratieve ziekten en kankers waarbij cytoskeletdynamiek de respons op geneesmiddelen beïnvloedt. Deze fractioneringstechniek maakt directe kwantificering mogelijk van stabiele, labiele en vrije tubuline-pools in native weefsels, wat een biochemische read-out biedt die complementair is aan beeldvorming en assay's die specifiek zijn voor modificaties. Door functionele microtubuli-toestanden te onderscheiden, ondersteunt deze methode de validatie van targets en mechanistische risicoanalyse in vroege discovery-programma's die gericht zijn op microtubuli-modulerende middelen.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door verschuivingen in stabiele versus labiele microtubulipopulaties als reactie op behandeling met verbindingen te kwantificeren.
- Operationele waarde: Biedt een biochemische assay op basis van weefsel om de target-interactie van microtubulistabiliserende of -destabiliserende middelen te valideren.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door biochemische microtubulistabilisatie te correleren met functionele uitkomsten in ziekterelevante systemen.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert kwantitatieve data van tubuline-fractionering die geschikt zijn voor high-content screening van verbindingenbibliotheken die gericht zijn op microtubuli-dynamiek.
- Reproduceerbaarheid: Maakt gebruik van gestandaardiseerde ultracentrifugatiestappen om een consistente scheiding van microtubuli-fracties over verschillende experimenten te genereren.
- Schaalbaarheid: Compatibel met western blotting en proteomische follow-up om regulatoren van microtubuli-stabiliteit te identificeren vanuit gefractioneerde tubuline-pools.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Detecteert weefselspecifieke variaties in microtubulusstabiliteit die correleren met het proliferatievermogen, wat stratificatie van preklinische modellen mogelijk maakt.
- Translationele continuïteit: Verbindt biochemische microtubulustoestanden met signaturen van posttranslationele modificaties (bijv. acetylering in stabiele, tyrosinering in labiele pools) voor de afstemming van biomarkers.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door kwantitatieve stabiliteitsmetrieken te verschaffen die de therapeutische index voorspellen in programma's gericht op microtubuli.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot lead-optimalisatie, waarbij microtubuli-stabiliteit dient als farmacodynamische biomarker voor bevestiging van het werkingsmechanisme.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door het meten van door verbindingen geïnduceerde verschuivingen in microtubuli-polymerisatie-toestanden in lysaten van natuurlijk weefsel.
- Screening: Maakt standaardisatie van assays mogelijk via gedefinieerde sedimentatiedrempels (100.000 × g voor stabiele, 500.000 × g voor labiele microtubuli) om reproduceerbare fractionering te waarborgen.
- Analytiek: Genereert kwantitatieve tubuline-uitslagen via western blot van P2 (stabiel), P3 (labiel) en S3 (vrije tubuline) fracties om effecten van verbindingen te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Koppelt gegevens over microtubuli-fractionering aan weefselspecifieke expressiepatronen en modificatieprofielen voor preklinische validatie.
- Herbruikbaarheid op bedrijfsniveau: Vestigt een herbruikbaar biochemisch platform voor het beoordelen van microtubuli-doelwitverbindingen in meerdere ziektegebieden en weefseltypen.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door microtubuli-polymerisatietoestanden direct te meten in plaats van uitsluitend te vertrouwen op posttranslationele modificaties.
- Operationele waarde: Garandeert reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde centrifugatieparameters en temperatuurgecontroleerde verwerking om de integriteit van microtubuli te behouden.
- Strategische waarde: Verbetert het vertrouwen in go/no-go-beslissingen door orthogonale validatie van het mechanisme voor het targeten van microtubuli, voorbij cellulaire assays.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van de kwantitatieve stabilisatie-efficiëntie in ziekterelevante weefsels.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in weefselhomogenisatie en ultracentrifugatietechnieken om de stabiliteit van microtubuli tijdens de verwerking te behouden.
- Afhankelijk van toegang tot hogesnelheidsrotors (TLA-55 en TLA-120.2) die in staat zijn tot 100,000 × g en 500,000 × g voor fractiescheiding.
- Vereist standaardisatie van de timing en temperatuur van fractionering tussen teams om consistente resultaten tussen laboratoria te garanderen.
- Vereist aanpassing van de buffersamenstelling en centrifugeringsparameters bij toepassing van de methode op niet-neurale weefsels met verschillende microtubuli-dichtheden.
- Beperkt door de noodzaak van onmiddellijke verwerking om artefactuele depolymerisatie van microtubuli tijdens de monsterbehandeling te voorkomen.
