De novo Identificatie van actief vertaalde open leesframes met ribosoomprofileringsgegevens

Interpretatie van de sequencinggegevens gegenereerd door het ribosoomprofileringsexperiment is van cruciaal belang voor het kwantitatief meten van de translationele activiteiten van ribosomen op mRNA en voor het bestuderen van de mechanismen van translationele regulatie. In dit protocol beschrijven we de computationele procedure voor het gebruik van de ribosoomprofileringsgegevens en RiboCode, een opdrachtregelprogramma om mRNA-translatie op genoombrede schaal en enkele nucleotideresolutie te decoderen. Deze methode maakt het mogelijk om te zoeken naar de nieuwe peptiden die voortkomen uit de genomische regio's buiten de geannoteerde eiwitcoderende genen, en biedt de mogelijkheid om de snelheid van mRNA-translatie te kwantificeren.

Open om te beginnen een Linux-terminalvenster en maak een conda-omgeving door de opdracht uit te voeren. Schakel over naar de gemaakte omgeving en installeer RiboCode en afhankelijkheden door de opdracht uit te voeren. Om de genoomreferentiebestanden voor de referentiesequentie te krijgen, gaat u naar de Ensembl-website en klikt u op downloaden, gevolgd door FTP-download.

Klik op de fasta optie in de kolom DNA FASTA en selecteer de rij waar de soort mens is, weergegeven in de tabel op de website pagina. Kopieer op de ensembl-websitepagina de link zoals vermeld in de tekst en download en pak de bestanden in de terminal uit door de opdracht uit te voeren. Voor referentieannotatie klikt u met de rechtermuisknop op GTF in de kolom genensets op de laatst geopende webpagina.

Kopieer de koppeling en download deze met de opdracht. Om rRNA-sequenties te krijgen, opent u UCSC-genoombrowser, klikt u op Gereedschappen en selecteert u tabelbrowser in de vervolgkeuzelijst. Geef op de UCSC-genoombrowserpagina zoogdier op voor clade, mens voor genoom, alle tabellen voor groep, R-masker voor tabel en genoom voor regio.

Klik voor filter op maken om naar een nieuwe pagina te gaan en stel de rep-klasse in zoals overeenkomt met rRNA. Klik op verzenden en stel vervolgens de uitvoerindeling in op volgorde en de naam van het uitvoerbestand als HG38_rRNA. FA. Klik ten slotte op uitvoer ophalen en selecteer vervolgens sequentie ophalen om de rRNA-sequentie op te halen.

Als u ribosoomprofileringsgegevenssets wilt ophalen uit het sequentieleesarchief, downloadt u de replicaatmonsters van de si-eIFe-behandelingsgroep en wijzigt u de naam ervan door de opdracht uit te voeren. Download vervolgens de replicatievoorbeelden van de controlegroep en wijzig de naam ervan door de opdracht uit te voeren. Als u rRNA-verontreiniging wilt verwijderen, begint u met het indexeren van rRNA-referentiesequenties door de opdracht uit te voeren.

Lijn na het indexeren de reads uit op rRNA-referentie om de reads afkomstig van rRNA uit te sluiten door de opdracht uit te voeren. Begin met het maken van een genoomindex door het commando uit te voeren. Lijn vervolgens de clean reads zonder rRNA-besmetting uit op de gemaakte verwijzing door de opdracht uit te voeren en sorteer en indexeer vervolgens uitlijningsbestanden door de opdracht uit te voeren.

Bereid de transcriptannotaties voor door de opdracht uit te voeren. Selecteer ribosoombeschermde fragmenten van specifieke lengtes en identificeer hun P-siteposities door de opdracht uit te voeren. Bewerk de configuratiebestanden voor elk voorbeeld en voeg ze samen.

Voer vervolgens RiboCode uit door de opdracht uit te voeren. De frequentieverdeling van de lengtes van de metingen toonde aan dat de meeste ribosoom beschermde fragmenten overeenkomen met 25 tot 35 nucleotiden. De P-site locaties voor verschillende lengtes van ribosoom beschermde fragmenten werden bepaald door de afstanden van hun vijf priemeinden tot de geannoteerde start- en stopcodons te onderzoeken.

De mappingresultaten laten zien dat 10.394 genen coderen voor geannoteerde open leesframes. Verder coderen 509 en 168 genen voor upstream en downstream open leesframes, terwijl 939 genen coderen voor upstream of downstream open leesframes, overlapt met bekende geannoteerde open leesframes. Verder coderen 68 eiwitcoderende genen en 2.601 niet-coderende genen voor nieuwe open leesframes.

Lengteverdeling toonde aan dat stroomopwaarts, stroomafwaarts, nieuwe en overlappende open leesframes korter waren dan de geannoteerde open leesframes. Relatieve ribosoom beschermde fragmenttellingen werden berekend voor elk open leesframe, waaruit bleek dat de ribosoomdichtheden van upstream open leesframes significant hoger waren in eIF3e-deficiënte cellen dan in controlecellen. De metagenanalyse onthulde dat een massa ribosomen vastliep tussen codons 25 en 75 stroomafwaarts van het startcodon, wat suggereert dat de translatie-elongatie vroeg kan worden geblokkeerd in eIF3e-deficiënte cellen.

De P-sites dichtheidsprofielen voor upstream open leesframes van PSMA6 en downstream open leesframes van gen SENP3-EIF4A1 werden onderzocht, waarbij de periodiciteitspatronen en dichtheden van ribosoom beschermde fragmenten werden aangetoond. Het controleren van de locaties van reads rond de start- en stopcodons van bekende eiwitcoderende regio's is noodzakelijk voor het evalueren van de periodieke eigenschappen van reads voor elke lengte. RiboCode, samen met een andere opdrachtregeltool, kan RiboMiner ook kwaliteitscontrole en meerdere analyses uitvoeren, zoals het kwantificeren en visualiseren van de bezetting van de ribosomen op de voorspelde open leesframes.

Deze computationele tool biedt een high throughput manier om uncanonische translatiegebeurtenissen te identificeren met ribosoomprofileringsgegevens in specifieke fysiologische contexten, en hoe de translatie moduleert als reactie op de stimulus.