Name: Meting van het zuurstofverbruik in acute striatale plakjes van volwassen muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Leer zuurstofverbruik meten in acute striatale plakjes van volwassen muizen met een Seahorse XF-analyzer. Deze methode biedt een fysiologisch relevantere beoordeling van mitochondriale functie voor onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Wangchen Tsering en Pamela Walter voor hun kritische lezing en redactie van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS054773 tot C.J. L. en NS098393 tot H.Z.) en de afdeling Neurowetenschappen aan de Thomas Jefferson University (Startup Funds to H.Z.).

Alle procedures, inclusief dierwerk, werden uitgevoerd volgens nationale en internationale richtlijnen en werden goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van de Thomas Jefferson University. Mannelijke FVB/NTac muizen op de leeftijd van 3 tot 14 maanden werden gebruikt. De volgende stappen werden uitgevoerd in een niet-steriele omgeving, maar voorzichtigheid is geboden om alles zo schoon mogelijk te houden.
OPMERKING: De hier gepresenteerde methode werd vastgesteld en gebruikt in het onderzoek gerapporteerd door Zhi et al.24. De hier beschreven experimenten gebruikten een Seahorse XF24 extracellulaire fluxanalysator (zie Materiaaltabel). Deze methoden kunnen worden aangepast voor de XFe24-analyzer en sommige resultaten werden bevestigd met behulp van deze analyzer.
1. Hydraatpatroonsensoren (1 dag voor de test)
<ol><li>Open de extracellulaire fluxtestkit (zie Materiaaltabel) en verwijder zowel de sensorcartridge (groen) als de gebruiksplaat (helder; Figuur 1A). Plaats de sensorcartridge opzij (sensoren omhoog) en raak de sensoren niet aan.</li>
	<li>Voeg 600 μL kalibrantoplossing (pH 7,4) toe aan elk putje van de gebruiksplaat. Plaats de sensorcartridge bovenop de gebruiksplaat en dompel de sensoren onder in de kalibrantoplossing. Zorg ervoor dat de driehoekige inkeping van het hulpprogramma en de sensorcartridgeplaat correct zijn uitgelijnd (figuur 1B).</li>
	<li>Sluit de extracellulaire fluxtestkit af met afdichtingsfolie om verdamping van de kalibrantoplossing te voorkomen en plaats deze vervolgens in een incubator van 37 °C die niet 's nachts is aangevuld met CO2 of zuurstof.</li>
</ol>2. Bereid de weefselplaat voor (op de dag van de test)
<ol><li>Open de eilandjesopvang microplaat en haal de eilandplaat eruit voor weefselzitting.</li>
	<li>Verwarm een geschikt volume (625 μL per put) voorgeoxygeneerde gemodificeerde kunstmatige hersenvocht (ACSF, samenstelling 140 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,4 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 25 mM glucose, 10 mM HEPES, pH 7,2) buffer tot 37 °C in een buis van 50 ml. Voeg vervolgens BSA toe aan een eindconcentratie van 4 mg /ml om de ademhalingsbuffer voor te bereiden. Over het algemeen is 50 ml voldoende voor één plaat.</li>
	<li>Voeg 625 μL ademhalingsbuffer (voorgeoxygeneerde ACSF-buffer met 25 mM glucose en 4 mg/ml BSA) voorzichtig toe aan elk putje van de eilandplaat en vermijd het schudden van de plaat. Zorg ervoor dat er geen restdruppels bovenop de sensorcartridge zitten en dat er geen luchtbellen aanwezig zijn in de buffer van elke put.</li>
</ol>3. Acute striatale plakbereiding en weggesneden plakplaatsing
<ol><li>Onthoofd de muis na cervicale dislocatie en ontleed de hersenen onmiddellijk in 10 ml ijskoude voorgeoxygeneerde snijoplossing (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 3,7 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 10 mM glucose, pH 7,4).</li>
	<li>Sectie coronale striatale plakjes met een vibratoom volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel) met een dikte van 150 μm in ijskoude, voorgeoxygeneerde snijoplossing.</li>
	<li>Herstel de plakjes in 50 ml zuurstofrijke ACSF (125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,4 mM CaCl2, 1,3 mM MgSO4, 0,3 mM KH2PO4, 10 mM glucose, 2 mM HEPES, pH 7,4) en houd in oplossing gedurende maximaal 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Breng na herstel de plakjes over naar een petrischaaltje van 35 mm x 10 mm met 5 ml ademhalingsbuffer.</li>
	<li>Gebruik een roestvrijstalen biopsiepunch (bijv. 1,5 mm diameter) om een cirkelvormig stuk weefsel te maken in het gewenste gebied van de gesneden hersenen. Houd het plakje in de buffer terwijl je zachtjes met de stoot naar beneden drukt. Zorg ervoor dat de pons hard genoeg naar beneden wordt geduwd om het weefsel te snijden. Verwijder de rest van het weefsel, til de pons weg en verwijder het cirkelvormige stukje weefsel in de buffer.</li>
	<li>Snijd het uiteinde van een pipetpunt van 1 ml om een gat te maken met een diameter van 1,5-2,0 mm en gebruik het om het geponste plak vast te houden en over te brengen naar de bovenkant van het opnamescherm. Zuig een stuk geponst hersenweefsel op en plaats het weefsel voorzichtig op de mesh-kant van het opnamescherm (figuur 2A). Het opnamescherm is een cirkelvormig stuk plastic met het gaas aan één kant bevestigd. OPMERKING: De opnameschermen zijn opgenomen in het microplaatpakket (zie Materiaaltabel) en zijn vergelijkbaar met het pakket dat wordt gebruikt in Schuh et al.23.</li>
	<li>Gebruik voorzichtig een papieren zakdoekje om het opnamescherm kort te drogen. Met het vocht verwijderd, wordt het weefsel plakkerig, waardoor het plakje zich aan het midden van het gaas kan hechten. Droog de plak niet te veel, want anders raakt deze beschadigd.</li>
	<li>Houd het plakje van het opnamescherm met een pincet naar beneden en plaats het in een van de putjes van de broedplaat (figuur 2B). Pas op dat je de plak niet laat vallen; zo ja, haal het scherm eruit en plaats er een nieuw segment op. OPMERKING: Plaats geen hersensegmenten in de twee achtergrondcorrectieputten (A1 en D6) in de eilandplaat.</li>
	<li>Incubeer de eilandplaat bij 37 °C in een incubator gedurende ten minste 30 minuten om temperatuur- en pH-evenwicht mogelijk te maken voordat de test wordt uitgevoerd.</li>
</ol>4. Laden van cartridges met de gewenste verbindingen
<ol><li>Verdun de gewenste verbindingen in gemodificeerde ACSF (37 °C) tot de uiteindelijke voorraadconcentratie van respectievelijk 10x, 11x, 12x en 13x van de werkconcentratie voor de poorten A tot en met D en pas aan pH 7,4. De test zal de verbindingen toedienen in volgorde van poort A tot D. Voor dit experiment werden de volgende oplossingen gebruikt, waarvan de respectieve werkconcentratie eerder is vermeld: 10 mM pyruvaat (poort A), 20 μM oligomycine (poort B), 10 μM of andere concentraties FCCP (poort C) en 20 μM antimycine A (poort D).</li>
	<li>Plaats 75 μL van de verdunde verbindingen voorzichtig voor in de juiste injectiepoorten van de sensorcartridge. Plaats de uiteinden halverwege in de injectiepoorten in een hoek van 45° met de punt tegen de wand van de injectiepoort. Tips mogen niet volledig op de bodem van de injectiepoorten worden ingebracht, omdat dit samengestelde lekkage door de poort kan veroorzaken.</li>
	<li>Trek de uiteinden voorzichtig uit de poorten om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan. Tik niet op een deel van de cartridge om luchtbellen te voorkomen.</li>
	<li>Inspecteer de injectiepoorten visueel voor gelijkmatig laden. Zorg ervoor dat alle vloeistof in de poort zit en dat er geen restdruppels bovenop de cartridge aanwezig zijn.</li>
	<li>Plaats de sensorcartridge op de gebruiksplaat en plaats deze gedurende 30 minuten in een incubator (niet-CO2) om deze weer tot 37 °C te laten opwarmen. Behandel voorzichtig door alleen de nutsplaat vast te houden. Beweeg zo min mogelijk.</li>
</ol>5. Kalibratie en het uitvoeren van de test
<ol><li>Laad de testsjabloon in de software. Druk op de groene START-knop .</li>
	<li>Zorg ervoor dat u het juiste protocol laadt. Het protocol bevat een combinatie van 3 minuten mix, 3 minuten wachten en 2 minuten meten sequenties (deze drie stappen vormen één meting). Wijzig de afstand van de sondekop van 26.600 naar 27.800 in de hardware-instellingen onder instrumentinstellingen25. Het is niet nodig om de sondekop voor de XFe24-analyzer te vervangen. Druk op START.</li>
	<li>Plaats de sensorcartridge op de gebruiksplaat in de instrumentenlade. De inkeping gaat in de voorste, linkerhoek. Zorg ervoor dat de plaat goed zit en plat is. Plaats de met geneesmiddelen gevulde sensorcartridge in de analysator voor kalibratie.</li>
	<li>Volg de instructies op het scherm om de sensoren te kalibreren en in evenwicht te brengen. Dit duurt ongeveer 30 minuten.</li>
	<li>Zodra de kalibratiestap is voltooid, verwijdert u de kalibratieplaat en vervangt u deze door de eilandplaat (met het gaas en de weefselplakken).</li>
	<li>Meet het zuurstofverbruik in elke put van de plaat met behulp van de testprotocollen. Het protocol bevat een combinatie van 3 minuten mix, 3 minuten wachten en 2 minuten metingssequenties (deze drie stappen vormen één meting), waarna de OCR wordt berekend.</li>
	<li>Neem voor het hele experiment 4x OCR-metingen op om een uitgangswaarde te creëren, gevolgd door de injectie van poort A (pyruvaat) met 4x-metingen, vervolgens de injectie van poort B (oligomycine) met 8x-metingen, vervolgens de injectie van poort C (FCCP) met 5x-metingen en ten slotte de injectie van poort D (antimycine A) met 6x-metingen. OPMERKING: Dit aantal metingen na elke samengestelde injectie wordt bepaald afhankelijk van wanneer de meting het plateau bereikt.</li>
	<li>Analyseer de OCR-meetgegevens en de koppelingsefficiëntiegegevens.</li>
</ol>

<ol><li>Hauser, D. N., Hastings, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+Parkinson%27s+disease+and+monogenic+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in Parkinson's disease and monogenic parkinsonism.</a> Neurobiology of Disease. 51, 35-42 (2013).</li>
<li>Swerdlow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+mitochondrial+cascades+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and mitochondrial cascades in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 62 (3), 1403-1416 (2018).</li>
<li>Lou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+consumption+deficit+in+Huntington+disease+mouse+brain+under+metabolic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Oxygen consumption deficit in Huntington disease mouse brain under metabolic stress.</a> Human Molecular Genetics. 25 (13), 2813-2826 (2016).</li>
<li>Amo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+decrease+caused+by+loss+of+PINK1+is+not+due+to+proton+leak%2C+but+to+respiratory+chain+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential decrease caused by loss of PINK1 is not due to proton leak, but to respiratory chain defects.</a> Neurobiology of Disease. 41 (1), 111-118 (2011).</li>
<li>Clark, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+pink1+is+required+for+mitochondrial+function+and+interacts+genetically+with+parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin.</a> Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).</li>
<li>Cooper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+rescue+of+mitochondrial+deficits+in+iPSC-derived+neural+cells+from+patients+with+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease.</a> Science Translational Medicine. 4 (141), (2012).</li>
<li>Gautier, C. A., Kitada, T., Shen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+PINK1+causes+mitochondrial+functional+defects+and+increased+sensitivity+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Loss of PINK1 causes mitochondrial functional defects and increased sensitivity to oxidative stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (32), 11364-11369 (2008).</li>
<li>Gispert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson+phenotype+in+aged+PINK1-deficient+mice+is+accompanied+by+progressive+mitochondrial+dysfunction+in+absence+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Parkinson phenotype in aged PINK1-deficient mice is accompanied by progressive mitochondrial dysfunction in absence of neurodegeneration.</a> PLoS One. 4 (6), 5777(2009).</li>
<li>Heeman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+PINK1+affects+mitochondrial+metabolism%2C+calcium+homeostasis+and+energy+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Depletion of PINK1 affects mitochondrial metabolism, calcium homeostasis and energy maintenance.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 7 1115-1125 (2011).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pink1+regulates+the+oxidative+phosphorylation+machinery+via+mitochondrial+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Pink1 regulates the oxidative phosphorylation machinery via mitochondrial fission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12920-12924 (2011).</li>
<li>Villeneuve, L. M., Purnell, P. R., Boska, M. D., Fox, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+expression+of+Parkinson%27s+disease-related+mitochondrial+abnormalities+in+PINK1+knockout+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Early expression of Parkinson's disease-related mitochondrial abnormalities in PINK1 knockout rats.</a> Molecular Neurobiology. 53 (1), 171-186 (2016).</li>
<li>Morais, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1+loss-of-function+mutations+affect+mitochondrial+complex+I+activity+via+NdufA10+ubiquinone+uncoupling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">PINK1 loss-of-function mutations affect mitochondrial complex I activity via NdufA10 ubiquinone uncoupling.</a> Science. 344 (6180), 203-207 (2014).</li>
<li>Morais, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+mutations+in+PINK1+result+in+decreased+Complex+I+activity+and+deficient+synaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease mutations in PINK1 result in decreased Complex I activity and deficient synaptic function.</a> EMBO Molecular Medicine. 1 (2), 99-111 (2009).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+intracellular+rates+of+glycolytic+and+oxidative+ATP+production+and+consumption+using+extracellular+flux+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).</li>
<li>Ferrick, D. A., Neilson, A., Beeson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+measuring+cellular+bioenergetics+using+extracellular+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Advances in measuring cellular bioenergetics using extracellular flux.</a> Drug Discovery Today. 13 (5-6), 268-274 (2008).</li>
<li>Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+respiration+and+bioenergetic+status+of+mitochondria+in+primary+cerebellar+granule+neuronal+cultures+exposed+continuously+to+glutamate%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In situ respiration and bioenergetic status of mitochondria in primary cerebellar granule neuronal cultures exposed continuously to glutamate.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32989-33000 (2004).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+energy+metabolism+in+cultured+cells%2C+including+human+pluripotent+stem+cells+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring energy metabolism in cultured cells, including human pluripotent stem cells and differentiated cells.</a> Nature Protocols. 7 (6), 1068-1085 (2012).</li>
<li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li>
<li>Land, S. C., Porterfield, D. M., Sanger, R. H., Smith, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+self-referencing+oxygen-selective+microelectrode%3A+detection+of+transmembrane+oxygen+flux+from+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22TheJournal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The self-referencing oxygen-selective microelectrode: detection of transmembrane oxygen flux from single cells.</a> TheJournal of Experimental Biology. 202, Pt 2 211-218 (1999).</li>
<li>Sure, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+high-throughput+assay+for+respiration+in+isolated+brain+microvessels+reveals+impaired+mitochondrial+function+in+the+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Geroscience%22%5BJournal%5D)">A novel high-throughput assay for respiration in isolated brain microvessels reveals impaired mitochondrial function in the aged mice.</a> Geroscience. 40 (4), 365-375 (2018).</li>
<li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria%3A+implications+for+mechanistic+stroke+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromolecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li>
<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PLoS One. 6 (3), 18317(2011).</li>
<li>Schuh, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+microplate-based+respirometry+for+hippocampal+slices+and+analysis+of+respiratory+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Adaptation of microplate-based respirometry for hippocampal slices and analysis of respiratory capacity.</a> Journal of Neuroscience Research. 89 (12), 1979-1988 (2011).</li>
<li>Zhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+PINK1+causes+age-dependent+decrease+of+dopamine+release+and+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Loss of PINK1 causes age-dependent decrease of dopamine release and mitochondrial dysfunction.</a> Neurobiology of Aging. 75, 1-10 (2019).</li>
<li>Fried, N. T., Moffat, C., Seifert, E. L., Oshinsky, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+mitochondrial+analysis+in+acute+brain+sections+from+adult+rats+reveals+mitochondrial+dysfunction+in+a+rat+model+of+migraine%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional mitochondrial analysis in acute brain sections from adult rats reveals mitochondrial dysfunction in a rat model of migraine.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 307 (11), 1017-1030 (2014).</li>
<li>Qi, G., Mi, Y., Yin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+brain+metabolic+function+ex+vivo+with+acute+mouse+slice+punches%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Characterizing brain metabolic function ex vivo with acute mouse slice punches.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100559(2021).</li>
<li>Underwood, E., Redell, J. B., Zhao, J., Moore, A. N., Dash, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+assessing+tissue+respiration+in+anatomically+defined+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A method for assessing tissue respiration in anatomically defined brain regions.</a> Scientific Reports. 10 (1), 13179(2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Met de door ons ontwikkelde methode kon een XF-analyzer worden gebruikt voor het meten van OCR in striatale plakjes van volwassen muizen over een tijdspanne van 4 uur. Deze methode biedt een nieuwe manier om cellulaire bio-energetica te meten in stoten die zijn weggesneden uit anatomisch gedefinieerde hersenstructuren. Omdat de weefselmonsters die worden geanalyseerd vrij klein zijn, kunnen de metabole parameters van specifieke hersengebieden die betrokken zijn bij een ziekte worden onderzocht. Bovendien bootst het gebru...

Mitochondriale disfunctie is betrokken bij verschillende neurologische ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington en de ziekte van Alzheimer 1,2,3. PD-modellen zoals PINK1 knockout (KO) muizen en ratten vertonen een verminderde mitochondriale functie 4,5,6,7,8,9,10,11. Mitochondriën geïsoleerd uit het striatum (STR) of de hele hersenen van de oude PINK1 KO-muis vertonen defecten in complex I 7,10,12,13. Het direct meten van het zuurstofverbruik (OCR) is een van de meest voorkomende methoden om de mitochondriale functie te evalueren, aangezien OCR is gekoppeld aan ATP-productie, de belangrijkste functie van mitochondriën14. Daarom kan het meten van OCR in ziektemodellen of van patiënten afgeleide monsters / weefsel helpen onderzoeken hoe mitochondriale disfunctie tot ziekte leidt.
Momenteel zijn er verschillende manieren om mitochondriale OCR te meten, waaronder de Clark-elektrode en andere O2-elektroden, O2 fluorescerende kleurstof en de extracellulaire fluxanalysator 15,16,17,18,19. Als voordeel maken O2 elektrode-gebaseerde methoden het mogelijk om verschillende substraten eenvoudig toe te voegen. Ze zijn echter onvoldoende om meerdere monsters tegelijkertijd te meten. Vergeleken met traditionele O 2-elektrode-gebaseerde methoden biedt de extracellulaire fluxanalysator, een veelgebruikt hulpmiddel voor OCR in celculturen of gezuiverde mitochondriën, een verbeterdedoorvoersnelheid van 15,18,20. Niettemin worden al deze methoden meestal toegepast om OCR te meten in geïsoleerde mitochondriën of celculturen 6,16,17,19,20,21. De isolatie van mitochondriën veroorzaakt onbedoelde schade en geëxtraheerde mitochondriën of celculturen zijn minder fysiologisch relevant dan intacte hersenplakken22. Zelfs wanneer micro-elektroden in plakjes worden gebruikt, zijn ze minder gevoelig en moeilijker te bedienen dan in gekweekte cellen23.
Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, hebben we een methode ontwikkeld met behulp van de XF24 extracellulaire fluxanalysator, die de analyse mogelijk maakt van meerdere metabole parameters van acute striatale hersenplakken van muizen24. Deze techniek zorgt voor continue directe kwantificering van mitochondriale ademhaling via de OCR. Kortom, kleine delen van striatale hersenplakken worden in putten van de eilandplaat geplaatst en de analysator gebruikt zuurstof- en protonfluorescente biosensoren om de OCR- en extracellulaire verzuringssnelheid te meten, respectievelijk 17,21,25.
Een van de unieke kenmerken van de analysator zijn de vier injectieputten, die de voortdurende meting van OCR mogelijk maken terwijl achtereenvolgens maximaal vier verbindingen of reagentia worden geïnjecteerd; dit maakt het mogelijk om verschillende cellulaire ademhalingsparameters te meten, zoals basale mitochondriale OCR, ATP-gebonden OCR en maximale mitochondriale OCR. De verbindingen die tijdens de metingen voor het hier getoonde protocol werden geïnjecteerd, waren werkconcentraties van 10 mM pyruvaat in de eerste oplossingsput (poort A), 20 μM oligomycine in de tweede oplossingsput (poort B), 10 μM carbonylcyanide 4-(trifluoromethoxy) fenylhydrazon (FCCP) in de derde put (poort C) en 20 μM antimycine A in de vierde put (poort D), gebaseerd op Fried et al.25. Opgemerkt moet worden dat deze concentraties werkconcentraties waren en dat voorraadoplossingen van respectievelijk 10x, 11x, 12x en 13x in de oplossingspoorten A tot en met D werden geïnjecteerd. Het doel van het gebruik van elke oplossing was als volgt: 1) Pyruvaat was noodzakelijk omdat, zonder dit, de toevoeging van FCCP een verminderde OCR-respons zou hebben veroorzaakt door een beperking van beschikbare substraten; 2) Oligomycine remt ATP-synthase en maakt de meting van ATP-gekoppelde ademhaling mogelijk; 3) FCCP ontkoppelt oxidatie van fosforylering en maakt het mogelijk om de maximale mitochondriale capaciteit te meten; 4) Antimycine A remt complex III in de elektronentransportketen en maakt daarom de meting van OCR mogelijk die niet aan de mitochondriën is gekoppeld.
De gebruikte concentratie oligomycine werd bepaald op basis van de volgende redenen: 1) De aanbevolen dosis oligomycine voor de meeste celtypen (geïsoleerde mitochondriën of celculturen) is 1,5 μM. Uit ervaring blijkt dat meestal 3x-10x van de dosis gedissocieerde cellen wordt gebruikt voor de plakexperimenten, omdat er een gradiënt kan zijn en de penetratie van oplossing in de plakjes tijd kost. Daarom moet de concentratie in het bereik van 5 μM tot 25 μM liggen. 2) Een 20 μM-concentratie werd geselecteerd op basis van Fried et al.25. Hogere concentraties werden niet geprobeerd vanwege de niet-specifieke toxiciteit van oligomycine. 3) In het rapport van Underwood et al.26 deden de auteurs een titratie-experiment voor oligomycine en ontdekten dat doses bij 6,25, 12,5, 25 en 50 μg / ml resulteerden in vergelijkbare remming. De hogere concentratie oligomycine (50 μg/ml) remde niet meer maar had een grotere variantie. 4) In onze waarneming lijkt de bepalende factor het penetrerende vermogen van oligomycine te zijn. Het is moeilijk voor oligomycine om het weefsel binnen te dringen, en daarom duurt het minstens 7 tot 8 cycli om het plateau te bereiken, de maximale respons. Zolang het het plateau bereikt, wordt aangenomen dat de remming maximaal is.
Een belangrijke technische uitdaging bij het aanpassen van de extracellulaire fluxanalysator voor het meten van OCR in striatale plakjes is het voorkomen van weefselhypoxie. Aangezien de buffer gedurende de gehele duur van de metingen (ongeveer 4 uur) niet van zuurstof was voorzien, was hypoxie een centraal probleem. Dit geldt vooral voor dikkere weefselmonsters, waar zuurstof niet door de monsters kan diffunderen. Om dit probleem op te lossen, werden plakjes gesneden op een dikte van 150 μm, zodat omgevingszuurstof het midden van de hersenplakken kon binnendringen. Bovendien werd 4 mg/ml runderserumalbumine (BSA) toegevoegd aan de buffer voorgeoxygeneerde kunstmatige hersenvocht (ACSF), wat de bepaling van maximale OCR vergemakkelijkte, zoals eerder gesuggereerd23. We onderzochten of cellen nog leefden. Eerst werden Hoechst 33258 (10 μM) en propidiumjodide (10 μM) gebruikt om te onderzoeken of cellen gezond waren onder deze omstandigheden. Vervolgens onderzochten we of medium stekelige neuronen functioneel gezond waren met behulp van patch-clamp-opname. We evalueerden verder of dopamine (DA) terminals in de striatale plakjes functioneel gezond waren door DA-afgifte te meten met behulp van snelle voltammetrie. De resultaten toonden aan dat striatale plakjes die niet van zuurstof waren voorzien (ACSF /BSA-groep) net zo gezond waren als de zuurstofrijke controlegroep24.
Vervolgens hebben we verschillende combinaties van plakdikte en ponsgrootte getest om optimale striatale plakcondities voor de fluxademhalingstest te bepalen. Dorsale striatale plakjes met verschillende diktes (150 μm en 200 μm) en ponsgroottes (1,0 mm, 1,5 mm en 2,0 mm in diameter) werden gebruikt voor OCR-analyse met behulp van de analysator. Striatale plakjes van 150 μm dik met een ponsgrootte van 1,5 mm in diameter hadden de hoogste koppelingsefficiëntie en OCR's binnen een optimaal bereik voor de analyzer24.

<table><tbody><tr><td>Accumet AB150 pH benchtop meter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-636-AB150</td><td>Om pH te meten</td></tr><tr><td>Antimycin A van streptomyces sp.</td><td>SIGMA</td><td>A8674</td><td>Om complex III van de mitochondriën te remmen</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td><td>SIGMA</td><td>A6003</td><td>Om gemodificeerd kunstmatig hersenvocht te maken (BSA-ACSF)</td></tr><tr><td>Carbonyl cyanide 4-(trifluormethoxy) fenylhydrazone (FCCP)</td><td>SIGMA</td><td>C2920</td><td>Om mitochondriale ademhaling te ontkoppelen</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>SIGMA</td><td>G8270</td><td>Om kunstmatig hersenvocht te maken (ACSF)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIGMA</td><td>D8418</td><td>Om verbindingen op te lossen</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA</td><td>H3375</td><td>Om kunstmatig hersenvocht te maken (ACSF)</td></tr><tr><td>Bevochtigde non-CO2 incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-683-230D</td><td>Om platen te hydrateren bij 37 &deg;C</td></tr><tr><td>Oligomycine van Streptomyces diastatochromogenes</td><td>SIGMA</td><td>O4876</td><td>Om mitochondriale ATP synthase te remmen</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>sealing film</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Tocris</td><td>3616</td><td>Om complex I van de mitochondriën te remmen</td></tr><tr><td>Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>103681-100</td><td>Oplossing voor Seahorse kalibratie</td></tr><tr><td>Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td>Apparatuur gebruikt om de zuurstofconsumptiesnelheid te analyseren, oude generatie</td></tr><tr><td>Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td>Apparatuur gebruikt om de zuurstofconsumptiesnelheid te analyseren, nieuwe generatie</td></tr><tr><td>Seahorse XF24 FluxPaks</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>101174-100</td><td>Pakket met sensor cartridges voor flux analyzer, weefselkweekplaten, opvangschermen,&nbsp; calibratieoplossing en kalibratieplaten; assaykit.</td></tr><tr><td>Natriumpyrovacinaat</td><td>SIGMA</td><td>P2256</td><td>Om eventuele substraat-beperkende beperkingen van substraattoevoer te voorkomen</td></tr><tr><td>Roestvrijstalen biopsie-punches</td><td>Miltex</td><td></td><td>Apparaat gebruikt om plakjes te boren</td></tr><tr><td>Steriele celcultuurschaal, 35 x 10 mm</td><td>Eppendrof</td><td>0030700102</td><td>Gebruikt voor het boren van plakjes</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>Om hersenweefsel te snijden</td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Thermo Scientific Precision</td><td>282-115</td><td>Om buffer en oplossingen te verwarmen</td></tr></tbody></table>

meting van het zuurstofverbruik in acute striatale plakjes van volwassen muizen

Measurement of Oxygen Consumption Rate in Acute Striatal Slices from Adult Mice

Mitochondriën spelen een belangrijke rol bij cellulaire ATP-productie, regulering van reactieve zuurstofsoorten en Ca2+ concentratiecontrole. Mitochondriale disfunctie is betrokken bij de pathogenese van meerdere neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington en de ziekte van Alzheimer. Om de rol van mitochondriën in modellen van deze ziekten te bestuderen, kunnen we mitochondriale ademhaling meten via zuurstofverbruik (OCR) als een proxy voor mitochondriale functie. OCR is al met succes gemeten in celculturen, evenals geïsoleerde mitochondriën. Deze technieken zijn echter minder fysiologisch relevant dan het meten van OCR in acute hersensegmenten. Om deze beperking te overwinnen, ontwikkelden de auteurs een nieuwe methode met behulp van een Seahorse XF-analyzer om de OCR direct te meten in acute striatale plakjes van volwassen muizen. De techniek is geoptimaliseerd met een focus op het striatum, een hersengebied dat betrokken is bij PD en de ziekte van Huntington. De analysator voert een live celtest uit met behulp van een 24-well plaat, die de gelijktijdige kinetische meting van 24 monsters mogelijk maakt. De methode maakt gebruik van cirkelvormig geponste stukjes striatale hersenplakken als monsters. We tonen de effectiviteit van deze techniek aan door een lagere basale OCR te identificeren in striatale plakjes van een muismodel van PD. Deze methode zal van breed belang zijn voor onderzoekers die werkzaam zijn op het gebied van PD en de ziekte van Huntington.

De eerste stap van deze studie was het optimaliseren van de plakdikte en ponsgrootte die wordt gebruikt om een deel van het striatum uit de plak te snijden (figuur 3A). Een plak met een dikte van 150 μm en een ponsgrootte van 1,5 mm gaven de beste resultaten, bepaald door de efficiëntie van de koppeling (figuur 3B-C). Zoals te zien is in figuur 3B, is OCR relatief stabiel gedurende 5 uur met minder ...

Zuurstofverbruik (OCR) is een veel voorkomende proxy voor mitochondriale functie en kan worden gebruikt om verschillende ziektemodellen te bestuderen. We hebben een nieuwe methode ontwikkeld met behulp van een Seahorse XF-analyzer om de OCR direct te meten in acute striatale plakjes van volwassen muizen die fysiologisch relevanter is dan andere methoden.

Meting van het zuurstofverbruik in acute striatale plakjes van volwassen muizen

Mitochondria play an important role in cellular ATP production, reactive oxygen species regulation, and Ca2+ concentration control. Mitochondrial ...

We ontwikkelden een nieuwe methode met behulp van een seahorse XF-analyzer om het zuurstofverbruik direct te meten. Maar gemeenschappelijke proxy voor mitochondriale functie in acute slide slice van volwassen muizen. Deze methode meet een cel door energetica in puncties van anatomisch gedefinieerde hersenstructuren.Het gebruik van acute plakjes bootst de fysiologische cellulaire omgeving na die niet kan worden bereikt op de manieren waarop geïsoleerde mitochondriale of kweekcellen worden geïsoleerd. Deze methode zal van breed belang zijn voor onderzoekers die werkzaam zijn op het gebied van de ziekte van Parkinson en de ziekte van Huntington. Open om te beginnen de extracellulaire fluxtestkit en verwijder zowel de sensorcartridge als de gebruiksplaat.Plaats vervolgens de sensorcartridge opzij en raak de sensoren niet aan. Voeg vervolgens 600 microliter kalibreeroplossing toe aan elke wand van de nutsplaat. Plaats de sensorcartridge bovenop de nutsplaat en dompel de sensoren onder in de kalibreeroplossing, zodat de driehoekige inkeping van het hulpprogramma en de sensorcartridgeplaat correct zijn uitgelijnd.Sluit daarna de extracellulaire fluxtestkit af met afdichtingsfilm om verdam

measurement-oxygen-consumption-rate-acute-striatal-slices-from-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Zhi, L. et al., Measurement of Oxygen Consumption Rate in Acute Striatal Slices from Adult Mice. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates how to measure mitochondrial oxygen consumption rate (OCR) in mouse striatal brain slices. It details the steps for preparing the tissue plate and sensor cartridge, loading them into the flux analyzer, and explains the cellular processes underlying OCR patterns.

Measurement of Oxygen Consumption Rate in Acute Mouse Brain Slices

Het huidige protocol beschrijft een methode waarmee gebruikers levensvatbaarheid van acute hippocampal en corticale segment preparaten tijdens het verzamelen van magnetische resonantie microscopie gegevens handhaven kunnen.

Metabole steun van weggesneden, levende hersenen weefsels tijdens magnetische resonantie microscopie overname

In dit document wordt een methode voor het meten van zuurstofverbruik met behulp van hoge-resolutie respirometrie in permeabel thoraxes van Drosophila beschreven. Deze techniek vereist een minimale hoeveelheid weefsel in vergelijking met de klassieke mitochondriale isolatie-techniek en de verkregen resultaten meer fysiologisch relevant zijn.

Meting van mitochondriale zuurstofverbruik in permeabel vezels van Drosophila met minimale hoeveelheden weefsel

Presenteren we een protocol voor het meten van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring in Drosophila melanogaster larvale en volwassen hersenen. Een metabole analyzer wordt gebruikt met een aangepast en geoptimaliseerd protocol. Micro-weefsel beperkingen werden zijn een essentieel onderdeel van dit protocol en ontworpen en gemaakt speciaal voor hun gebruik in deze analyse.

Metabole analyse van Drosophila melanogaster Larval en volwassen hersenen

Het meten van veranderingen in de stofwisseling staat centraal in het begrijpen van de progressie van verschillende ziektes en veroudering. Hier presenteren we een nieuwe techniek voor het meten van de hele hoofd zuurstofverbruik dat nauwer lijkt op de fysiologische toestand en kan steun bij het openbaren van nieuwe medicijnen die mitochondriale activiteit wijzigen.

Meten en interpreteren van zuurstof verbruik geheel vliegen hoofd segmenten

Het doel van dit protocol is te illustreren hoe gebruik van muis neonatale cardiomyocytes als een modelsysteem om te onderzoeken hoe de verschillende factoren kunnen wijzigen zuurstofverbruik in het hart.

Analyseren van zuurstof verbruik tarief in neonatale Cardiomyocytes primaire gekweekte muis met behulp van een extracellulaire Flux-Analyzer

Mitochondriale ademhaling is van cruciaal belang voor de overleving van het organisch; Daarom is zuurstof verbruik tarief is een uitstekende indicator voor mitochondriale gezondheid. In dit protocol, beschrijven we het gebruik van een commercieel beschikbare respirometer voor het meten van basale en maximale zuurstof verbruik in leven, intact, en vrij-sporenvormende Caenorhabditis elegans.

Meting van zuurstof verbruik in Intact Caenorhabditis elegans

Het beoordelen van oxidatieve fosforylering met behulp van respirometers met hoge resolutie is een integraal onderdeel geworden van de functionele analyse van mitochondriën en cellulair energiemetabolisme. Hier presenteren we protocollen voor de analyse van cellulair energiemetabolisme met behulp van kamer- en microplaatgebaseerde respirometers met hoge resolutie en bespreken we de belangrijkste voordelen van elk apparaat.

Respirometrie met hoge resolutie om bio-energetica in cellen en weefsels te beoordelen met behulp van respirometers op basis van kamer en platen

Hoge resolutie respirometrie gekoppeld aan fluorescentiesensoren bepaalt mitochondriaal zuurstofverbruik en reactieve zuurstofsoorten (ROS) generatie. Het huidige protocol beschrijft een techniek om mitochondriale ademhalingssnelheden en ROS-productie in de gepermeabiliseerde heupzenuw te beoordelen.

Beoordeling van mitochondriale functie in heupzenuw door middel van hoge resolutie respirometrie

Coulometrische respirometrie is ideaal voor het meten van de stofwisseling van kleine organismen. Bij correctie voor Drosophila melanogaster in de huidige studie lag de gemeten O2-consumptie binnen het bereik dat in eerdere studies werd gerapporteerd voor wildtype D. melanogaster.  Het verbruik van O2 per vlieg door vatmutanten , die kleiner en minder actief zijn, was significant lager dan bij het wildtype.

Meting van O2-verbruik in Drosophila melanogaster met behulp van coulometrische microrespirometrie

Hier beschrijven we een uitgebreide methode voor het meten van mitochondriale oxidatieve fosforylering in verse gepermeabiliseerde skeletspiervezels van menselijke of muizenspieren. Deze methode maakt de real-time kwantificering van de mitochondriale ademhaling en de beoordeling van brandstofvoorkeur en metabole flexibiliteit mogelijk, met behoud van bestaande mitochondriale netwerken en membraanintegriteit.

Meting van mitochondriale ademhaling in skeletspiervezels van mens en muis door middel van respirometrie met hoge resolutie

Leer zuurstofverbruik meten in acute striatale plakjes van volwassen muizen met een Seahorse XF-analyzer. Deze methode biedt een fysiologisch relevantere beoordeling van mitochondriale functie voor onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten.

Meting van het zuurstofverbruik in acute striatale plakjes van volwassen muizen

Meer video's verkennen