Gepoolde shRNA-bibliotheekscreening om factoren te identificeren die een fenotype van medicijnresistentie moduleren

Het algemene doel van de volgende video is om het gebruik van de gepoolde shRNA epigenetische bibliotheek aan te tonen om een negatieve selectiescreening uit te voeren. Deze screening maakt het mogelijk om specifieke epigenetische doelen te identificeren door middel van sequencing. Deze procedure kan helpen bij het identificeren van de epigenetische factoren die verantwoordelijk zijn voor het bemiddelen van verworven cytarabineresistentie in AML De stappen zijn als volgt.

Selectie van de krachtigste promotor om persistente en langdurige expressie van de shRNA's te verkrijgen. Het huidige protocol richt zich op RNAi-screening met behulp van epigenetische factor shRNA-bibliotheek in cytarabine-resistente MV4-11-cellijn. De promotors die voor dit doel worden gebruikt, zijn menselijke EF-1 alfa, menselijke CMV en SFFV, promotors die groene fluorescentie-eiwitten tot expressie brengen.

Neem het celgetal met de trypan blue-uitsluitingsmethode. Suspensie van de cellen in een 10%RPMI-medium met 8 microgram per ml polybreen. Zaai 1 miljoen cellen in 1,5 ml medium per put van een zes-well plaat in drievoud.

Voeg verschillende volumes geconcentreerde lentivirussen toe. Bijvoorbeeld lentivirussen, bijvoorbeeld 10, 20 en 40 microliter, afhankelijk van de titer van de lentivirussen naar elke put. Draai de plaat voorzichtig om de inhoud te mengen.

Voer spinfectie uit door centrifugeren bij 920 g bij 37 graden Celsius gedurende 90 minuten. Incubeer de platen onmiddellijk in een kooldioxide-incubator. Observeer de GFP aan het einde van 48 uur en kwantificeer hetzelfde aan het einde van 72 uur.

Volg vervolgens de stappen zoals weergegeven in het stroomdiagram om de promotor te kiezen die een consistente GFP-expressie in de hele cultuur weergeeft. Voorbereiding van de gepoolde lentivirale menselijke epigenetische factor shRNA-bibliotheek. Kweek 293T-cellen bij een laag passagegetal met een goede proliferatiesnelheid in drie celkweekschalen van 10 centimeter met 8 ml 10% DMFM-medium in elke plaat.

Zodra de cellen 60% confluentie bereiken, vervangt u volledig door vers medium. Bereid de transfectiemix zoals beschreven die serumvrij medium bevat, lentivirale verpakkingsplasmide PAX2, envelopplasmide pMD2. G, gepoolde bibliotheekplasmiden en ten slotte het transfectiereagens.

Tik op het mengsel om het goed te mengen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Voeg het transfectiemengsel toe aan de 293T-cellen en meng voorzichtig door de platen te draaien. Incubeer de platen in een kooldioxide-incubator.

Vervang het medium na 24 uur. Controleer na 48 uur op GFP-expressie onder een fluorescentiemicroscoop om een hoge transfectie-efficiëntie in 293T-cellen te garanderen. Verzamel de virussupernatanten na 48, 60 en 72 uur en bewaar ze op 4 graden en voeg vers medium, 8 ml, toe op elk tijdstip na het verzamelen van het virus.

Filter de gepoolde virussen met een filter van 0,4 micron. Voor het verkrijgen van een hoge titer van virussen, concentreer de gepoolde virussen door ultracentrifugatie. Breng de gefilterde virussupernatanten over in 70 Ti-buizen en centrifugeer gedurende 2 uur bij 18.000 g.

Gebruik voorgekoelde rotor en centrifuge op 4 graden. Haal de buisjes voorzichtig uit de centrifuge en verwijder het bovennatuurmiddel volledig. Resuspend de pellet voorzichtig in 400 microliter DMEM zonder FBS en antibiotica met behulp van een micropipette, incubeer gedurende 1 uur op ijs.

Aliquot de virussen en bevriezen bij min 80 graden. Bereken de concentratie van het virus zoals getoond. Schatting van de transductie-efficiëntie van lentivirussen.

Transduceer 293T-cellen met een geconcentreerd virus in verschillende volumes, 2, 4 en 8, om de succesvolle bereiding van het lentivirus te bevestigen. Waarde voor geconcentreerd virus tot 100X om een titratie-experiment uit te voeren in de doelcellijn. Zaad 1 miljoen doelcellijn in 1,5 ml 10% RPMI medium met 8 microgram per ml polybreen in één put van een zes-well plaat.

Voeg vier verschillende volumes toe, 1, 1,5, 2, 2,5 microliter van 100X virussen. Voer spinfectie uit door centrifugering van de plaat bij 920 g gedurende 90 minuten bij 37 graden Celsius. Meet na 72 uur het percentage GFP-positieve cellen door middel van flowcytometrie.

Bepaal het volume van de virussen om 30% transductie-efficiëntie te verkrijgen. Deze lage transductie-efficiëntie moet zorgen voor één shRNA-integratie per cel. Transductie van de gepoolde epigenetische shRNA-bibliotheek in de medicijnresistente cellijn.

Bereken het aantal cellen dat voor het experiment moet worden genomen, zoals hieronder op basis van het aantal virale integranten. Resuspend 11 miljoen cellen in 16 ML van 10% RPMI medium. Voeg polybreen toe, acht microgram per ml en meng goed, en voeg vervolgens het vereiste volume virussen toe om 30% transductie-efficiëntie te verkrijgen zoals eerder berekend.

Zaai alle cellen op een plaat met zes putten met een dichtheid van 1 miljoen cellen per 1,5 ml per put. Centrifugeer de plaat gedurende 90 minuten bij 920 g bij 37 graden Celsius. Incubeer de plaat een nacht in een kooldioxide-incubator.

Vervang na 24 uur het medium en breng de getransduceerde cellen over in een T-75-kolf. Controleer na 48 uur de GFP onder een fluorescentiemicroscoop om een succesvolle transductie te garanderen. Kwantificeer na 72 uur de GFP door middel van flowcytometrie.

Verrijking van de GFP-positieve cellen. Breid de getransduceerde cellen uit door ze te kweken met een dichtheid van 0,5 miljoen per ml gedurende 5 tot 7 dagen en voer stroomsortering uit met de stroomsorteerinstelling ingesteld als hoge zuiverheid en lage opbrengst. Kweek de gesorteerde cellen in een 10%RPMI medium.

Voer na 72 uur de schatting na het sorteren uit van het percentage van de GFP-positieve cellen om meer dan 95% sorteerefficiëntie te garanderen. Dropout screening om epigenetische factoren te identificeren die resistentie tegen geneesmiddelen bemiddelen. Kweek de shRNA-bibliotheek-getransduceerde cellen in 10% RPMI gedurende maximaal 5 dagen.

Centrifugeer 10 miljoen cellen in duplicaten. Gooi het bovennatuurlijk middel weg en bewaar de pellets bij min 80 graden. Deze monsters zullen dienen als de referentie voor de epigenetische shRNA-bibliotheek.

Kweek de resterende getransduceerde cellen als duplicaten, R1 en R2, elk onderhouden op een celtelling die een 500X-weergave van de bibliotheek biedt. Behandel een van de duplicaten met het medicijn, 10 micromolair cytarabine, en de andere zonder de medicamenteuze behandeling. Vervang het medium voor de kolven met en zonder het medicijn om de 72 uur.

Herhaal de mediumverandering drie keer voor een cumulatieve blootstelling aan geneesmiddelen van 9 dagen. Controleer na de 9e dag van de medicamenteuze behandeling de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van de trypan blue exclusion-methode. Draai de resterende levensvatbare cellen af, was met steriel PBS en centrifugeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 280 g.

Gooi het supernatant weg en bewaar de pellets op min 80 voor DNA-extractie. Versterking van de geïntegreerde shRNA's door PCR. Extract DNA uit de getransduceerde basislijncellen, behandelde en onbehandelde cellen, gevolgd door het controleren van de concentratie met behulp van fluorometer, bereken de hoeveelheid DNA die nodig is zoals getoond en onderwerp de monsters aan de eerste ronde PCR.

Het PCR-reactiemengsel is weergegeven in tabel 2 met de omstandigheden van de thermische cycler. Stel meerdere reacties in met 850 nanogram DNA per buis voor een totaal van 43 reacties. Bundel de PCR-producten en zuiver ze.

Eluteer de producten in een buffer van 50 microliter en kwantificeer ze en bewaar ze ten slotte bij min 20. Gebruik voor de tweede ronde PCR reverse index primers en de reagentia zijn in tabel 4 in tabel 4 weergegeven. Stel vier reacties in met 500 nanogram van het primaire PCR-product in een totaal reactievolume van 50 microliter voor elk monster, samen met de negatieve controle.

Laad het hele product voor elektroforese met 2% TBE agarose gel en bevestig de bandgrootte met één KB molecuulladder. Visualiseer de PCR-producten op het geldocumentatiesysteem. Snijd de specifieke band weg en zuiver met behulp van een gelzuiveringskit.

Berekeningen voor de zuivering met de kit zijn opgenomen in tabel 3. Elulaat in een eindvolume van 30 microliter elutiebuffer met de geschatte concentratie van elk eluent ongeveer 80 tot 90 nanogram per microliter. Next generation sequencing en data-analyse.

De gelgezuiverde producten worden onderworpen aan next-generation sequencing om afgelezen tellingen te verkrijgen voor de uitgeputte shRNA-behoeften. Trim de adaptersequenties, lijn de gefilterde leesbewerkingen uit op de referentiesequenties, laad de bestanden met SAMtools om een uitlijningssamenvatting te verkrijgen. Laad de bijgesneden fastQ-bestanden in CRISPRCloud2 en voer de analyse uit volgens de instructies.

Klik op de link voor crisprcloud2. Selecteer het schermtype als Overlevings- en uitvalschermen. Stel het aantal groepen in en typ de naam voor elke groep.

Upload de referentiebibliotheek als fasta-bestandsindeling. De geüploade gegevens worden verwerkt en de resultaten zijn beschikbaar in de opgegeven URL. Representatieve gegevens.

Deze figuur toont MV4-11 ouderlijke en resistente cellen behandeld met toenemende cytarabineconcentratie, 0,1 micromolair tot 1.000 micromolair en levensvatbaarheidsbeoordeling door MTT-assay. Deze figuur toont representatieve stroomplots van de GFP gekwantificeerd door flowcytometrie aan het einde van 72 uur voor menselijke EF-1 alfa, menselijke CMV en SFFV promotors. Menselijke CMV toont onze heterogene piek, terwijl menselijke EF-1 alfa en SFFV een enkele homogene piek laten zien.

Deze figuur toont het staafdiagram voor de drie verschillende promotorefficiënties in MV4-11. SFFV-gestuurde GFP toonde het zwijgen van de GFP in langdurige cultuur. hEF-1 alfa-gestuurde GFP-cellen vertoonden aanhoudende expressie na het sorteren van deze cellen.

Het linkerpaneel toont de transfectie-efficiëntie van de gepoolde shRNA-bibliotheek getransfecteerd in 293T aan het einde van 48 uur onder fluorescentiemicroscopie. Het rechterpaneel toont de transductie-efficiëntie van het zwembadvirus in 293T-cellen met verschillende virusvolumes, 2, 4 en 8 microliter. Dit cijfer vertegenwoordigt de transductie-efficiëntie in MV4-11 resistente cellijn met verschillende volumes virussen, zoals 1, 1,5, 2, 2,5 microliter om 30% transductie-efficiëntie te bereiken.

Deze figuur toont de sortering van de GFP-positieve cellen met een transductie-efficiëntie van 30% met een hoge zuiverheid en een sorteerinstelling met lage opbrengst. De figuur toont een schematische illustratie van medicamenteuze behandeling voor de GFP-positief gesorteerde cellen voor een langdurige blootstelling aan cytarabine van 9 dagen, gevolgd door het controleren van de levensvatbaarheid en het verzamelen van de cellen voor DNA. Deze figuur toont de bindingsgebieden van de primer die wordt gebruikt in de eerste en tweede ronde van PCR.

Deze figuur illustreert de bandgrootte van het PCR-product aan het einde van de eerste ronde PCR, 397 base paar, en het tweede ronde PCR product 399 base pair, dat gel-eluted, gezuiverd en gegeven voor NGS. Deze figuur illustreert de weergave van de verrijkte of uitgeputte shRNA's gericht op de epigenetische factoren die cytarabineresistentie in AML kunnen bemiddelen. Conclusie. Dit protocol benadrukt het belang van gerichte knockdown-screening om zowel essentiële als niet-essentiële genen systematisch te ondervragen en toont het gebruik van deze aanpak als een functioneel platform, waardoor doelen kunnen worden geïdentificeerd die verantwoordelijk zijn voor resistentie tegen geneesmiddelen.