Protocol voor humane blastoïden modellering blastocyst ontwikkeling en implantatie

Onderzoek op menselijke embryo's wordt beperkt door hun lage beschikbaarheid en ethische zorgen, dus het verkrijgen van individuele modellen die de vroege menselijke ontwikkeling getrouw repliceren, zou wetenschappelijke en medische vooruitgang ondersteunen. Het vermogen van deze techniek om de menselijke ontwikkeling te voorspellen hangt af van het vermogen om de sequenties van blastocyst cellulaire bepaling en morfogenese effectief te reproduceren, volgens de ontwikkelingssequentie en het tempo, en een dergelijke modellering zou zorgen voor de vorming van cellen die echt het blastocyststadium weerspiegelen. In de toekomst kunnen menselijke blastoïden worden gebruikt om therapeutische doelen te identificeren en bij te dragen aan preklinische modellering, bijvoorbeeld om een in-vitrofertilisatiemedium te verbeteren of om niet-hormonale anticonceptiva te ontwikkelen.

De procedure wordt gedemonstreerd door Harunobu Kagawa, Alok Javali, Heidar Heidari Khoei, Theresa Maria Sommer en Giovanni Sestini. Bereid om te beginnen de PXGL-media, N2B27 basale media, wasbuffer, PBS en aggregatiemedia voor en verwarm ze voor. Sluit MEF's uit van de hPSC-suspensie voor het vormen van blastoïden.

Voor MEF-uitsluiting bereidt u een met gelatine bedekte plaat door één milliliter 0,1% gelatine toe te voegen aan de put van een plaat met zes putten. Incubeer de platen bij 37 graden Celsius gedurende 30 tot 90 minuten. Om de cellen te oogsten, verwijdert u het medium en wast u de cellen met één millimeter PBS.

Voeg 500 microliter celloslatingsoplossing toe aan elke put van een plaat met zes putten en incubeer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Controleer de cellen onder de microscoop om de dissociatie van kolonies in afzonderlijke cellen te volgen. Verdun de celloslatingsoplossing met één milliliter wasbuffer.

Verzamel de cellen van de plaat door vijf tot 10 keer voorzichtig te pipetteren. Breng de celsuspensie over in een buis van 15 milliliter. Draai de cellen op 200 RCF gedurende vier minuten.

Verwijder het supernatant en resuspend de cellen in 1,5 milliliter PXGL-medium in elke put. Zaai de cellen op de met gelatine beklede platen voor MEF-uitsluiting en incubeer de platen bij 37 graden Celsius gedurende 60 tot 90 minuten. Zodra de naïeve cellen zijn gezaaid voor MEF-uitsluiting, verwijdert u de PBS uit MicroWells en brengt u de putten in evenwicht met 200 microliter basaal N2B27-medium voor elke MicroWell-chip en incubeer gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius.

Verzamel het bovennatuurlijk met daarin de onaangetaste naïeve cellen. Breng het over in een buis van 15 milliliter en draai de cellen gedurende vier minuten op 200 RCF. Gooi de media weg en resuspend de cellen in één milliliter N2B27 basale media.

Tel de cellen met behulp van celtellingsdia's. Draai de cellen op 200 RCF gedurende vier minuten. Gooi het medium weg en voeg een geschikte hoeveelheid N2B27-media toe die 10 micromolaire Y27632 bevatten om een celdichtheid van 30.000 cellen per 50 microliter te verkrijgen.

Verwijder het medium uit gebalanceerde MicroWell-arrays en voeg 25 microliter N2B27-media toe met 10 micromolaire Y27632. Voeg 50 microliter celsuspensie toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius om cellen in de bodem van de MicroWell te laten vallen. Voeg vervolgens 125 microliter N2B27 medium toe, aangevuld met 10 micromolair Y27632.

Binnen 24 uur worden aggregaten van naïeve hPSC's waargenomen op de MicroWell-chip. Start de blastoïdevorming door het PALY-medium voor te bereiden. Verwarm het 30 minuten voor op 37 graden Celsius.

Verwijder het aggregatiemedium en voeg 200 microliter voorgewarmd PALY-medium toe aan de MicroWells. Plaats de celkweekplaat terug in een hypoxische couveuse bij 37 graden Celsius. Herhaal de mediaverandering op dag één.

Verwijder op dag twee het PALY-medium en voeg 200 microliter N2B27-medium toe, aangevuld met LPA en 10 micromolair Y27632. Herhaal mediawissel op dag drie. Volledige blastoïdevorming vindt plaats op dag vier.

Bereid naïeve hPSC-celsuspensie voor op blastoïdevorming zoals eerder beschreven. Gooi het medium weg en voeg een geschikte hoeveelheid N2B27-media toe die 10 micromolaire Y27632 bevatten om de celdichtheid van 70 cellen per 100 microliter van het medium te verkrijgen. Om cellen op de bodem van de putten te clusteren, centrifugeer je de plaat bij 200 RCF gedurende twee minuten bij kamertemperatuur.

Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius onder hypoxische kweekomstandigheden. Binnen 24 uur zullen aggregaten van naïeve hPSC's op de putten worden waargenomen. Voeg 100 microliter vers bereid en voorverwarmd tweemaal PALY medium toe aan de putten.

Plaats de celkweekplaat terug in een hypoxische couveuse bij 37 graden Celsius. Gooi na 24 uur de helft van het medium weg en vervang het door 100 microliter voorverwarmd PALY-medium. Herhaal de stap tot dag vier.

Bereid naïeve HPSC-celsuspensie voor troposfeervorming voor zoals eerder beschreven. Zodra aggregaten van naïeve HPSC's zich na 24 uur hebben gevormd, wisselt u het aggregatiemedium uit met PALY zonder LIF, aangevuld met drie micromolaire SC144 om trofosfverbindingen te vormen die vroege trophectoderm vertegenwoordigen. Om trofosfen te vormen die volwassen trophectoderm vertegenwoordigen, wisselt u het aggregatiemedium uit met PALY, aangevuld met twee micromolaire XMUMP1.

Ververs het medium dagelijks. Volledige trofosferevorming vindt plaats op dag vier. Om de celtoestanden te evalueren, vergelijkt u de transcriptomische gegevens van blastoid en trofosferen met de juiste controles, waaronder postimplantatie-achtige menselijke trofoblaststamcellen.

Naïeve hPSC's gekweekt in PXGL waren geaggregeerde en cavitaire structuren die tussen 48 en 72 uur na PALY-inductie ontstonden en binnen 96 uur een diameter van 150 tot 250 micrometer bereikten. Op basis van morfometrische parameters en de aanwezigheid van de drie afstammingslijnen bereikte de inductie-efficiëntie 70 tot 80% Trofosfen werden gevormd bij 50 tot 60% efficiëntie binnen 96 uur na inductie. Blastoïdvorming was succesvol in in de handel verkrijgbare ultralage bevestigingsplaten met 96 putten onder geoptimaliseerde inductieomstandigheden.

Single cell RNA sequencing technologie werd gebruikt om blastoïde cel toestand verder te karakteriseren. Cellen vertonen duidelijk reproduceerbaar verschillende clusteringprofielen, ongeacht de parameters die worden gebruikt om de clustering en visualisatie van gegevens uit te voeren, waardoor de drie blastocyst-afstammingslijnen met vertrouwen konden worden onderscheiden. Tussen 24 en 60 uur vormen de PXGL pluripotente stamcellen analogen van de epiblast en van het trophectoderm.

Vervolgens worden tussen 60 en 96 uur analogen van het polaire trophectoderm en van het primitieve endoderm gevormd. Dit is de volgorde van specificatie binnen de blastocyst, dus blastoïden recapituleren de ontwikkelingsvolgorde van afstammingsspecificatie. De samensmelting van blastoïdendatasets met de referentiedataset van cellen geïsoleerd uit embryo's in verschillende stadia van ontwikkeling toonde aan dat 97% van de cellen van blastoïden geclusterd waren met de blastocystcellen, maar niet met cellen van embryo's na implantatie.

Onafhankelijke analyse bevestigde dat de stamcellen na verloop van tijd cellen vormden die transcriptioneel overeenkwamen met de cellen van menselijke embryo's tussen dag vijf en 7,5. Dit is inderdaad de ontwikkelingsfase waarin de menselijke blastocyst zich vormt. Ze bevestigden ook dat meer dan 95% van de cellen in blastoïden een transcriptoom hebben dat overeenkomt met de drie cellijnlijnen van blastocysten, terwijl 3% van de cellen off target was en overeenkwam met postimplantatiestadia.

Van belang is dat we hebben waargenomen dat onze initiële 2D-culturen ook ongeveer 5% van de doelcellen omvatten. De equivalente ontwikkelingsstadia kan ook worden gevisualiseerd door te kijken naar de expressiepatronen van specifieke markers zoals CDX2 voor de blastocyst trophectoderm en PRMD14 voor de blastocyst epiblast. De kwaliteit van de initiële PXGL-cultuur is absoluut cruciaal, en het aantal cellen binnen het initiële aggregaat is ook van cruciaal belang en kan worden gecontroleerd met MicroWells.

De totale grootte van het cellulaire aggregaat na 24 uur moet ongeveer 50 tot 70 micrometer zijn. De efficiënte vorming van fase volledige blastoïden maakt de weg vrij voor het bestuderen van de processen van implantatie en post-implantatieontwikkeling van het menselijk embryo.