Topische toepassing Bioassay om insecticide toxiciteit voor muggen en fruitvliegen te kwantificeren

Door insecticide rechtstreeks op het insect aan te brengen in plaats van via oppervlaktecontact, is er minimale variatie in blootstelling aan insecticiden, en dit stelt ons in staat om het gevoeligheidsprofiel van muggenpopulaties nauwkeuriger te meten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om massa-gerelativeerde dodelijke doses van een insecticide te berekenen in plaats van dodelijke concentraties, wat de vergelijkingen van de resistentieverhouding aanzienlijk verbetert. Zorg ervoor dat u de insecticiden op de juiste manier bewaart, voorkom dat uw gereedschap wordt verontreinigd en zorg ervoor dat de onderdelen van de spuit in goede staat zijn.

Dit zal u helpen om consistente resultaten te behalen. Verwijder om te beginnen de benodigde insecticide-oplossingen uit de vriezer. Draai de oplossing onmiddellijk of keer vijf keer om en plaats deze in een lichtbestendige container bij kamertemperatuur om de insecticiden vóór gebruik tot kamertemperatuur te laten opwarmen.

Zet vijf microcentrifugebuizen uit met elk 0,5 milliliter aceton. Vul het vat van de spuit volledig met aceton uit de eerste buis. Verdrijft vervolgens de aceton in een afvalcontainer door snel op de zuiger te duwen en herhaal dit nog vier keer om in totaal vijf acetonwassingen van dezelfde aceton aliquot te voltooien.

Vul vervolgens het vat van de spuit volledig met lucht en verdrijft de lucht en mogelijke acetonresten in de afvalcontainer. Herhaal dit nog twee keer om drie wasbeurten met lucht te voltooien. Maak een luchtvak in de loop tussen de zuiger van de spuit en de bovenkant van de naald door de zuiger ongeveer vijf millimeter in de loop omhoog te trekken.

Label de plastic bekers met de willekeurige ID voor blinde sterftebeoordeling. Gebruik een aspirator aangedreven door zuigkracht van inademing, aspirateer het gewenste aantal drie tot vijf dagen oude volwassen muggen. Plaats de punt van de aspirator in de tube met katoen om de punt gewikkeld.

Adem zachtjes uit en tik op de aspirator om de muggen in een conische buis over te brengen. Gebruik het katoen om de buis te sluiten wanneer de aspiratorpunt wordt verwijderd en deed vervolgens met het deksel. Sla de muggen kort in de buizen door ze minimaal 10 minuten bij vier graden Celsius te plaatsen of onder het ijs in een ijsbak te begraven.

Breng de neergeslagen muggen over naar de insectenbehandelingstent. Gooi de muggen voorzichtig uit op een plastic bak die op het ijs is geplaatst en giet ongeveer 50 muggen tegelijk om ervoor te zorgen dat elk de koele bak eronder raakt en neergeslagen blijft. Sorteer de muggen op geslacht door ze voorzichtig op te pakken bij de benen of vleugels met een tang, gevolgd door elk geslacht in een aparte houdbeker te plaatsen en stop wanneer het gewenste aantal is bereikt.

Verwijder tijdens het sorteren alle muggen die gewond zijn of extra groot of klein zijn. Om het gewicht van de muggenbeker te registreren, plaatst u een lege beker met een petrischaal als deksel op de weegschaal en tarra de weegschaal. Giet de muggen in de container en plaats het deksel erop.

Plaats de container op de weegschaal en noteer het uiteindelijke gewicht, samen met het aantal muggen. Plaats de beker met exemplaren onmiddellijk terug op het ijs om ze geïmmobiliseerd te houden totdat alle kopjes van het exemplaar zijn gewogen. Verdeel de voorbereide muggen in vijf tot 10 afzonderlijke kopjes op ijs, gelabeld met willekeurige ID's.

Gebruik een pincet en een handheld teller om 20 tot 25 muggen per kopje te bereiken. Om de fruitvliegjes te sorteren, verdooft u de vliegen met behulp van koolstofdioxide gedurende zeven seconden. Giet de vliegen op een ijspak gewikkeld in bankpapier.

Met behulp van een verfkwast met fijne punt, scheid en tel de mannetjes en vrouwtjes. Gebruik de kwast om de gekozen vliegen voorzichtig op te pakken en plaats ze in een schone, lege voorraadfles. Nadat u een gelijk aantal mannelijke en vrouwelijke fruitvliegen hebt gekozen, labelt u de voorraadflessen met de soortnaam en het totaal van de fruitvlieg.

Verdoof de fles fruitvliegjes met koolstofdioxide gedurende zeven seconden. Giet de fruitvliegjes op weegpapier en gebruik het papier als een trechter om de vliegen in een geteerde injectieflacon te brengen met een willekeurige ID.Nadat u het deksel van de petrischaal op de flacon met fruitvliegjes hebt geplaatst, plaatst u deze op de weegschaal. Noteer het gecombineerde gewicht en het aantal exemplaren op het scoreblad.

Plaats de flacon met fruitvliegjes onmiddellijk in een bakje ijs met het deksel er nog bovenop om te voorkomen dat de vliegen ontsnappen. Laad de spuit met de juiste insecticideconcentratie, te beginnen met de minst geconcentreerde dosis en werk toe naar de meest geconcentreerde dosis met elke groep organismen. Tip de monsters op weegpapier dat bovenop een bakje op het ijs is geplaatst.

Scheid de monsters die dicht bij elkaar staan met behulp van een schone insecticidevrije verfkwast of wattenstaafje om gemakkelijk toegang te krijgen tot elk monster voor dosering. Breng met behulp van de spuit één druppel insecticide-oplossing aan op de ventrale thorax en het buikgebied voor muggen en de dorsum voor fruitvliegen. Giet de monsters onmiddellijk terug in de gelabelde plastic beker.

Bedek de beker met gaas en een elastiekje. Let op een bijgewerkte telling van het aantal exemplaren op de beker als er exemplaren zijn gedood, beschadigd of ontsnapt in dit proces. Plaats de voltooide beker in een opbergbakje.

Noteer voor de eerste beker de tijd waarop de dosering is voltooid. Herhaal de dosering voor elke cup totdat alle monsters zijn gedoseerd met de juiste insecticideconcentraties en noteer de eindtijd wanneer alle monsters zijn gedoseerd. Geef 10% sucrose-oplossing aan elke beker via een nat watje en bewaar de muggen en fruitvliegjes op de gewenste temperatuur en vochtigheid.

Recordsterfte van specimens 24 uur na het begin van blootstelling aan insecticiden. Classificeer muggen als levend als ze kunnen vliegen en houd zichzelf rechtop en dood als ze immobiel of ataxisch zijn, zoals beschreven door de WHO. Volg dezelfde sterftebeoordeling voor fruitvliegen.

Na het uitvoeren van de bioassay werden dosisresponsgegevens verkregen met twee stammen die Rockefeller en IICC-genotype zijn voor de mannelijke en vrouwelijke Aedes aegypti. De massagerelativeerde mediane letale dosis voor Rockefeller en IICC was respectievelijk 0,008 en 0,336 nanogram per milligram. De resultaten toonden geen verschillen tussen de dosisresponscurves van vrouwelijke en mannelijke muggen binnen elke stam.

Daarom werden gegevens van beide geslachten gecombineerd om de mediane letale dosiswaarden te berekenen. Aangezien de 95%-betrouwbaarheidsintervallen voor de mediane letale dosis van deze twee stammen elkaar niet overlapten, werden deze waarden als significant verschillend beschouwd. Bovendien was de IICC-stam bij het berekenen van de resistente verhoudingen meer dan 40 keer resistenter dan de vatbare Rockefeller-stam.

Dosisresponsgegevens voor fruitvlieg, Drosophila melanogaster, Canton-S-stam, werden ook verkregen en de massagerelativeerde mediane letale dosis bleek 0,213 nanogram per milligram te zijn. Consistentie is van cruciaal belang, vooral bij het opslaan en toepassen van het insecticide en het beoordelen van de mortaliteit. Wees ook voorzichtig bij het hanteren van het monster om schade of de dood te voorkomen die niet door het insecticide wordt veroorzaakt.

Met deze methode kunnen we nu nauwkeurig de technische weerstand van een muggenpopulatie bepalen en hoe omgevingsomstandigheden de weerstand beïnvloeden of hoe technische weerstand praktische weerstand voorspelt.