Primaire menselijke neusepitheelcellen: biobanking in de context van precisiegeneeskunde

Dit protocol belicht de belangrijkste stappen voor het versterken, differentiëren en cryopreserveren van primaire neusepitheelcellen. In onze kweekomstandigheden bootsen primaire neusepitheelcellen het longepitheel na. Dit maakt patiënt afgeleide culturen en gepersonaliseerde geneeskundestudies van verse of biobankcellen mogelijk.

De patiënt-afgeleide nasale epitheliale culturen kunnen worden gebruikt om CFTR-activiteit te evalueren en te helpen bij cystische fibrosetherapie door de individuele reactie van de patiënt op nieuwe therapieën te evalueren. Aurelie Hatton, een ingenieur uit mijn laboratorium, demonstreert de procedure. Om te beginnen, kweek nasale epitheliale of HNE-cellen, in 10 milliliter versterkingsmedium.

Incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide in een met collageen beklede kolf van 75 vierkante centimeter totdat deze 80 tot 90% confluency bereikt. Vervang het medium elke 48 tot 72 uur. Was de cellen later met 10 milliliter magnesium- en calciumvrije DPBS.

Aspirateer en gooi de zoutoplossing weg. Voordat twee milliliter van 0,25% trypsine wordt toegevoegd en de kolf gedurende acht tot 12 minuten in de incubator wordt teruggebracht. Tik later stevig op de kolf met een handpalm om de cel los te maken.

Voeg 10 milliliter van het versterkingsmedium toe om de enzymatische reactie te stoppen. Spoel de kolf krachtig af met een pipet van 10 milliliter om het versterkingsmedium op te zuigen en over het kolfoppervlak te drijven om cellen te spoelen en los te maken en de cellen in een buis van 15 milliliter te verzamelen. Centrifugeer de celsuspensie gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius op 500 maal G en gooi het supernatant weg.

Suspensie de pellet opnieuw in vijf tot 10 milliliter versterkingsmedium. Tel vervolgens de cellen op een hemocytometer. Centrifugeer na het tellen van de cellen gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius op 500 keer G en gooi het supernatant weg.

Suspensuspensie vervolgens de pellet opnieuw in het verrijkte vriesmedium om drie tot vijf keer 10 tot de zes cellen per milliliter te verkrijgen en in een cryoflacon te plaatsen. Vries de cellen langzaam in door de temperatuur met ongeveer één graad Celsius per minuut te verlagen in een geschikte cryovriescontainer bij min 80 graden Celsius. Verplaats het geconserveerde monster de volgende dag naar een stikstofopslagcontainer voor langdurige opslag.

Verwarm het vers bereide versterkingsmedium in een waterbad op 37 graden Celsius. Verwijder cryoflacons uit de stikstofopslagtank en plaats ze snel in het waterbad, waarbij u ervoor zorgt dat de hele injectieflacon niet in water wordt ondergedompeld. Verwijder de cryoflacons uit het waterbad wanneer er nog maar een klein bevroren druppeltje overblijft.

Veeg de injectieflacons af met 70% alcohol en leg ze onder de motorkap. Breng met een pipet van één milliliter de ontdooide cellen over in een buis van 15 milliliter. Voeg vervolgens een milliliter warm versterkingsmedium toe op een druppelsgewijze manier.

Voeg na een minuut nog een milliliter versterkingsmedium toe en wacht een minuut. Voeg 10 milliliter versterkingsmedium toe en centrifugeer gedurende twee minuten bij vier graden Celsius bij 500 maal G. Aspirateer en gooi het supernatant weg.

Suspensie van de pellet opnieuw in een volume versterkingsmedium dat nodig is om een celdichtheid van één keer 10 tot de zes cellen per milliliter te bereiken. Na het zaaien van de cellen op een 25 vierkante centimeter collageen gecoate kolf, met versterkingsmedium, incuberen de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Observeer visueel celuitbreiding gedurende twee tot drie dagen voordat celversterking wordt uitgevoerd, zoals eerder aangetoond.

Zaai de cellen met een dichtheid van 3,3 maal 10 tot de vijfde cellen per filter op 0,33 vierkante centimeter collageen gecoate poreuze filters, aangevuld met 300 microliter versterkingsmedium aan de apicale kant en 900 microliter lucht vloeibaar medium aan de basolaterale zijde. Na drie dagen aspiraleer je het apicale medium en kweek je de cellen op het lucht-vloeistof-grensvlak gedurende drie tot vier weken in het lucht-vloeistofmedium om een gedifferentieerd epitheel tot stand te brengen. Vervang het basale medium elke 48 tot 72 uur.

Verse HNE-cellen gekweekt op het lucht-vloeistof interface vertoonden een typisch kenmerk van het gepolariseerde en gedifferentieerde respiratoire epitheel. In de 78 HNE-celmonsters werden de slagingspercentages vergeleken bij nasale borstelzaadjes die onmiddellijk en na één tot zeven dagen transport in een spoelmedium werden gezaaid. Het initiële gemiddelde percentage van succesvolle culturen was 82% en bereikte 87% in monsters gezaaid tussen nul en vijf dagen.

83% van de monsters die succesvol differentieerden in verse omstandigheden waren ook succesvol in gecryopreserveerde monsters. Evenzo was 71% in monsters die geen onderscheid maakten in verse omstandigheden ook niet succesvol in vries-dooiomstandigheden. Bovendien groeide 50% van de monsters bevroren tussen twee tot drie keer 10 tot de zes cellen per cryoflacon niet wanneer ze werden ontdooid, waardoor 80% werd bereikt voor minder dan twee keer 10 voor de zes cellen.

Voor kortsluitstroomverandering in reactie op forskoline en kortsluitstroomverandering in reactie op CFTR-remmer 172 in met DMSO behandelde HNE-cellen werd geen significant verschil waargenomen tussen vers of bevroren ontdooid HNE. Na behandeling vertoonden beide celtypen een significante correctie met een toename van de kortsluitstroomverandering als reactie op forskoline en een afname van de kortsluitstroomverandering als reactie op CFTR-remmer 172. de corrigerende respons van cftr-functie duale therapieën werden beoordeeld in vergelijking met dmso behandelde HNE-cellen kortsluitstroomverandering in respons op forskoline en in reactie op CFTR-remmer 172 waren significant verbeterd door zowel VX-809 plus VX-770, en VX-661 plus VX-770.

Drie verschillende CFTR-modulatortherapieën in HNE van zes F508del homozygote patiënten werden vergeleken. Bij gebruik in combinatie met een CFTR-corrector en potentiator, zowel vertex- als een CFTR-modulator, corrigeerden kortsluitstroomverandering in reactie op forskoline en kortsluitstroomverandering in reactie op CFTR-remmer 172 in vergelijkbare mate. Bij het invriezen van HNE-cellen is het belangrijk om ten minste 3 miljoen cellen per cryoflacon te hebben om de kans op een goed resultaat bij het ontdooien te vergroten.

CFTR-activiteit in HNE-cellen is een goed voorspellend model gebleken om gepersonaliseerde therapieën bij cystische fibrose te evalueren en aan te passen.