Een stapsgewijze methode om neutraliserende antilichamen tegen AAV te detecteren met behulp van een colorimetrische celgebaseerde test

Reeds bestaande antilichamen die AAV neutraliseren, vormen een barrière voor de vooruitgang van AAV-gentherapieën. Deze test is een screeningsinstrument om neutraliserende antilichamen tegen AAV te detecteren. Het belangrijkste voordeel is dat het kosteneffectief, tijdsefficiënt, eenvoudig in te stellen is en minimale technische vaardigheden, laboratoriumapparatuur en reagentia vereist.

Begin op de eerste dag met het platen van HT1080-cellen door de cellen te verdunnen tot een concentratie van 1 x 10 tot de vijfde cel per milliliter in voorverwarmde complete DMEM-media. Zaai vervolgens 100 microliter cellen per put in heldere 96-well platbodemplaten tot de concentratie van 1 x 10 tot de vierde cel per put. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 16 tot 22 uur.

Genereer op dag twee seriële verdunningen van de serummonsters van belang in microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter met behulp van voorverwarmde complete DMEM. Voeg aan elke buis met verdunde serummonsters 66 microliter van de 7,5x10 toe aan de zes virale genoom per microliter viruswerkoplossing. Meng de virusserumverdunning door te pipetteren en plaats vervolgens de buisjes met de virusserummengsels gedurende 30 minuten in een incubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide om mogelijke neutralisatie mogelijk te maken.

Pipetteer na 30 minuten 100 microliter van het virusserummengsel naar elke put op de 96-putplaat met 1x10 tot de vierde cellen per put en wikkel de plaat vervolgens in een folie om gedurende 16 tot 24 uur in een incubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide te plaatsen. Zuig op dag drie de media uit de putten van de 96-putplaat op met behulp van een zuurkastvacuüm zonder de aangehechte cellen te verstoren en voeg 50 microliter 4% paraformaldehyde toe aan elke put. Nadat je de plaat in folie hebt gewikkeld, laat je deze 10 minuten op kamertemperatuur staan.

Was en zuig de cellen later twee keer aan met 200 microliter PBS bij kamertemperatuur. Pipetteer na de tweede wasbeurt 200 microliter voorverwarmde PBS in elke put en wikkel de plaat in folie, gevolgd door incubatie bij 65 graden Celsius gedurende 90 minuten om de endogene alkalische fosfatase-activiteit te denatureren, na incubatie met 50 microliter van het vers bereide opgeloste BCIP / NBT in elke put en incubeer de verpakte platen bij kamertemperatuur gedurende twee tot 24 uur. Maak later foto's van elke put met behulp van een 4X objectieflens in een lichtmicroscoopcamera, waardoor consistent gebruik van dezelfde belichting, witbalans en lichtinstellingen voor alle testen wordt gegarandeerd.

Als u de afbeelding in ImageJ wilt analyseren, selecteert u het bestand en klikt u op Openen. Voor de gekleurde afbeeldingen converteert u naar grijsschaal door de tabbladen Afbeelding, Type en 8-bits in volgorde te selecteren. Ga vervolgens naar het tabblad Afbeelding en selecteer Aanpassen en Drempel om de drempel te wijzigen totdat alle gekleurde gebieden gekleurd en rood zijn, maar de achtergrond niet.

klik op Metingen analyseren en instellen en vink de selectievakjes voor Gebied, Gebiedsfractie, Limiet tot drempel en Weergavelabel aan voordat u op OK.To de signaalaflezing van een bepaald goed te bepalen, klik op Analyseren en meten zodat de kolom procentgebied van het pop-upvenster de signaallezing weergeeft. De studie stelde de optimale virale dosering vast door het AAV6-hPLAP reporter-gen in de cellen toe te voegen bij een reeks concentraties van het virale genoom. Een veelheid aan infecties van 15.000 verleende 36% plaatkleuring en werd geselecteerd als de optimale virale dosering.

De representatieve analyse toont de correlatie tussen kleuring en veelvouden van infectie. De hoogste geteste concentratie die de lineaire correlatie tussen kleuring en virale concentratie niet beïnvloedde, werd verkregen. De studie van neutraliserende activiteit op een anti-AAV6 monoklonaal antilichaam tegen adeno-geassocieerd virus of AAV6 bij log 10 verdunning toonde 50% remming van AAV6-transductie of TI50 bij een concentratie van 10 nanogram per milliliter.

In de neutraliserende antilichaam- of NAb-test varieerde de mate van AAV-neutralisatie binnen de naïeve steekproefpopulatie met TI50-titerwaarden variërend van 1/2 tot 1/80. De testresultaten gaven aan dat de AAV-remming TI50-titerwaarden vóór toediening van AAV varieerden van 1/4 tot 1/80. Na toediening van AAV nam de TI50-titer toe tot tussen 1/2000 en meer dan 1/32.000, wat een duidelijk contrast in titerwaarden tussen pre- en post-AAV-toediening aantoont.

Bij het maken van foto's van de putten is het belangrijk om consequent dezelfde microscoopinstellingen te gebruiken tijdens de test en om er ook voor te zorgen dat de foto's direct in het midden van de putten worden genomen.