Name: Förster Resonance Energy Transfer Mapping: een nieuwe methodologie om wereldwijde structurele kenmerken op te helderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Leer FRET-mapping om ligandbindingsplaatsen en conformationele veranderingen in eiwitten te identificeren met fluorescerende kleurstoffen. Deze methode werkt in oplossing en is breed toepasbaar in biochemisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health grant R15GM135904 (toegekend aan IM) en National Institutes of Health Grant GM110552 (toegekend aan DBO).

De auteurs hebben niets te onthullen.

Door het gebruik van de FRET-mappingmethodologie identificeerden we de signaalsequentiebindingsplaats op het SecA-eiwit. Belangrijk is dat de aanwezigheid van een 3D-kristalstructuur van het complex onze studie aanzienlijk vergemakkelijkte. De kracht van deze mappingmethodologie ligt in de mogelijkheid om een bestaande structuur te gebruiken om locaties voor labeling te identificeren. Deze methodologie kan niet worden gebruikt om een 3D-structuur te bepalen; bepaling van structurele elementen56, v...

Voor eiwitten leidt opheldering van dynamica samen met 3-dimensionale (3D) structurele kennis tot een beter begrip van structuur-functierelaties van biomoleculaire systemen. Structurele methoden, zoals röntgenkristallografie en cryogene elektronenmicroscopie, vangen een statische structuur op en vereisen vaak de bepaling van meerdere structuren om aspecten van biomolecuulbinding en dynamica op te helderen1. In dit artikel wordt een oplossingsgerichte methode besproken voor het in kaart brengen van globale structurele elementen, zoals bindingsplaatsen of bindingsinteracties, die mogelijk meer van voorbijgaande aard zijn en minder gemakkelijk kunnen worden vastgelegd door statische methoden. Sterke kandidaatsystemen voor deze methodologie zijn systemen waarin een 3D-structuur eerder is bepaald door röntgenkristallografie, NMR-spectroscopie of andere structurele methoden. In dit geval maken we gebruik van de röntgenkristalstructuur van het SecA-SecYEG-complex, een centrale speler in de eiwit-algemene secretoire route, om de locatie van een signaalpeptidebindingsplaats in kaart te brengen met behulp van Förster resonantie-energieoverdracht (FRET) voorafgaand aan het transport van het preproteïne over het membraan2. Manipulatie van het biologische systeem door genetische modificaties in combinatie met onze kennis van de 3D-structuur maakte het mogelijk om de conformatie van de signaalsequentie en het vroege volwassen gebied te bepalen onmiddellijk voorafgaand aan het inbrengen in het kanaal 3.
FRET omvat de stralingsloze overdracht van energie van het ene molecuul (donor) naar het andere (acceptor) op een afstandsafhankelijke manier die door de ruimte is 4,5. De efficiëntie van deze overdracht wordt bewaakt door een afname van de donor of een toename van de fluorescentie-intensiteit van de acceptor. De efficiëntie van energieoverdracht kan worden omschreven als
E = R06/(R06 + R6)
waarbij de R0-waarde de afstand is waarop de overdracht 50% efficiënt is6. De techniek is eerder beschreven als een moleculaire liniaal en is effectief in het bepalen van afstanden in het bereik van 2,5-12 nm, afhankelijk van de identiteit van de donor-acceptorkleurstoffen 4,7,8,9. De fluorescentie-intensiteiten en levensduur van de donor met of zonder acceptor maken het mogelijk om de overdrachtsefficiënties en bijgevolg de afstanden 5,8 te bepalen. Vanwege de beschikbaarheid van de technologie, de gevoeligheid van de methode en het gebruiksgemak, heeft FRET ook een brede toepassing gevonden op gebieden als fluorescentiespectroscopie met één molecuul en confocale microscopie6. De komst van fluorescerende eiwitten zoals groen fluorescerend eiwit heeft de waarneming van intracellulaire dynamica en live-cell imaging relatief gemakkelijk gemaakt10,11. Veel FRET-toepassingen zoals deze worden in dit virtuele nummer in detail besproken.
In deze studie richten we ons vooral op het gebruik van FRET-metingen om afstandswaarden te genereren om structurele details te bepalen. Voorheen werden FRET-metingen effectief gebruikt om de conformatie van DNA-moleculen te bepalen wanneer ze gebonden zijn aan eiwit 12,13,14, de interne dynamiek van eiwitten en eiwitbindingsinteracties 15,16,17. De voordelen van deze methode liggen in de mogelijkheid om flexibele en dynamische structurele elementen te bepalen in een oplossing met relatief lage hoeveelheden materiaal. Het is veelzeggend dat deze methode bijzonder effectief is wanneer deze wordt gebruikt in combinatie met bestaande structurele informatie en niet kan worden gebruikt als een middel voor 3D-structuurbepaling. De methode biedt het beste inzicht en de verfijning van de structuur als het werk voortbouwt op bestaande structurele informatie, vaak gekoppeld aan computationele simulatie18,19. Hier wordt het gebruik van afstanden verkregen uit steady-state en time-resolved FRET-metingen beschreven om een bindingsplaats, waarvan de locatie niet bekend was, op een bestaande kristallografische structuur van het SecA-SecYEG-complex, belangrijke eiwitten in de algemene secretoire route 3 in kaart tebrengen.
De algemene secretoire route, een sterk geconserveerd systeem van prokaryoten tot eukaryoten tot archaea, bemiddelt het transport van eiwitten over of in het membraan naar hun functionele locatie in de cel. Voor Gram-negatieve bacteriën, zoals E. coli, het organisme dat in onze studie wordt gebruikt, worden eiwitten ingebracht in of getransloceerd over het binnenmembraan naar het periplasma. Het bacteriële SecY-kanaalcomplex (de translocon genoemd) coördineert met andere eiwitten om het nieuw gesynthetiseerde eiwit te transloceren, dat naar de juiste locatie in de cel wordt geleid via een signaalsequentie die zich meestal bevindt op de N-terminus20,21. Voor eiwitten gebonden aan het periplasma, associeert het ATPase SecA-eiwit zich met de uitgangstunnel van het ribosoom en met het preproteïne nadat ongeveer 100 residuen zijn vertaald22. Samen met het SecB-chaperonne-eiwit houdt het het preproteïne in een ongevouwen toestand. SecA bindt aan de SecYEG-translocon en vergemakkelijkt door vele cycli van ATP-hydrolyse het eiwittransport over het membraan23,24.
SecA is een multi-domein eiwit dat bestaat in cytosolische en membraangebonden vormen. SecA, een homodimeer eiwit in het cytosol, bestaat uit een preproteïnebindend of cross-linking domein25, twee nucleotidebindende domeinen, een spiraalvormig vleugeldomein, een spiraalvormig steigerdomein en de twee helixvingers (THF)26,27,28,29 (figuur 1). In eerdere kristallografische studies van het SecA-SecYEG-complex suggereerde de locatie van de THF dat het actief betrokken was bij eiwittranslocatie en daaropvolgende cross-linking experimenten met het signaalpeptide stelden de betekenis van dit gebied in eiwittranslocatie verder vast30,31. Eerdere studies, met behulp van de FRET-mappingmethodologie, toonden aan dat exogene signaalpeptiden binden aan dit gebied van SecA 2,32. Om de conformatie en locatie van de signaalsequentie en het vroegrijpe gebied van het preproteïne volledig te begrijpen voorafgaand aan het inbrengen in het SecYEG-kanaal, werd een eiwitchimaera gemaakt waarin de signaalsequentie en residuen van het vroegrijpe gebied via een Ser-Gly-linker aan SecA werden bevestigd (figuur 1). Met behulp van dit biologisch levensvatbare construct werd verder aangetoond dat de signaalsequentie en het vroeg volwassen gebied van het preproteïne op een parallelle manier binden aan de THF2. Vervolgens werd de FRET-mappingmethodologie gebruikt om de conformatie en locatie van de signaalsequentie en het vroege volwassen gebied in aanwezigheid van SecYEG op te helderen, zoals hieronder beschreven3.
Kennis van de 3D-structuur van het SecA-SecYEG-complex 33,34,35 en de mogelijke locatie van de bindingsplaats stelde ons in staat om oordeelkundig donor-acceptorlabels te plaatsen op locaties waar de kruising van individuele FRET-afstanden de bindingslocatie identificeert. Deze FRET-mappingmetingen onthulden dat de signaalsequentie en het vroege volwassen gebied van het preproteïne een haarspeld vormen met de punt aan de monding van het SecYEG-kanaal, wat aantoont dat de haarspeldstructuur wordt gesjabloond voorafgaand aan het inbrengen van het kanaal.

<table><tbody><tr><td>490 nm LED laser</td><td>Horiba</td><td>1684-LED</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>A20347</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Difco</td><td>DF0812</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>A10254</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>S10904</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 DIBO Alkyne</td><td>Life Technologies</td><td>S10906</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra&shy;4 Centrifugal filter (50kDa MWCO)</td><td>Sigma</td><td>UFC805008</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylmaltoside (DDM)</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>E. coli alkalische fosfatase signaalpeptide SP22</td><td>Biomolecules Midwest</td><td>N/A</td><td>Gesynthetiseerd aangepast item</td></tr><tr><td>uitgebreid signaalpeptide SP41</td><td>Biomolecules Midwest</td><td>N/A</td><td>Gesynthetiseerd aangepast item</td></tr><tr><td>FluorEssence</td><td>Horiba</td><td>versie 2.4</td><td>spectraal acquisitieprogramma voor Fluoromax4 spectrofluorometer</td></tr><tr><td>Fluoromax 4 spectrofluorometer</td><td>Horiba</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GlobalsWE</td><td>Laboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvine</td><td></td><td>spectraal analyseprogramma voor tijdsafhankelijke vervalprocessen</td></tr><tr><td>H&shy;4&shy;Azido&shy;Phe&shy;OH</td><td>BACHEM</td><td>4020250.0001</td><td></td></tr><tr><td>LB (Miller) Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9723</td><td></td></tr><tr><td>Ludox HS-40 colloïdaal silica (40 wt.% suspensie in H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>420816</td><td>verdunning is nodig om een goede verstrooiingsoplossing te maken</td></tr><tr><td>PTI Felix GX</td><td>Horiba</td><td>versie 4.1.0.4096</td><td>spectraal acquisitieprogramma voor PTI Time Master Instrument</td></tr><tr><td>PTI Time Master Instrument</td><td>Horiba</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pymol Molecular Graphics Program</td><td>Schrodinger</td><td>versie 2.4</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad</td><td>Thermo Scientific</td><td>NESLAB RTE 10</td><td></td></tr></tbody></table>

förster resonance energy transfer mapping: een nieuwe methodologie om wereldwijde structurele kenmerken op te helderen

F&#246;rster Resonance Energy Transfer Mapping: A New Methodology to Elucidate Global Structural Features

Förster resonantie energieoverdracht (FRET) is een gevestigde fluorescentie-gebaseerde methode die wordt gebruikt om met succes afstanden in en tussen biomoleculen in vitro en binnen cellen te meten. In FRET heeft de efficiëntie van energieoverdracht, gemeten aan de hand van veranderingen in fluorescentie-intensiteit of levensduur, betrekking op de afstand tussen twee fluorescerende moleculen of labels. Bepaling van dynamica en conformatieveranderingen vanaf de afstanden zijn slechts enkele voorbeelden van toepassingen van deze methode op biologische systemen. Onder bepaalde voorwaarden kan deze methodologie bestaande röntgenkristalstructuren aanvullen en verbeteren door informatie te verstrekken over dynamiek, flexibiliteit en aanpassing aan bindende oppervlakken. We beschrijven het gebruik van FRET en bijbehorende afstandsbepalingen om structurele eigenschappen op te helderen, door de identificatie van een bindingsplaats of de oriëntaties van dimeersubeenheden. Door een verstandige keuze van etiketteringslocaties en vaak het gebruik van meerdere etiketteringsstrategieën, hebben we deze mappingmethoden met succes toegepast om wereldwijde structurele eigenschappen in een eiwit-DNA-complex en het SecA-SecYEG-eiwittranslocatiesysteem te bepalen. In het SecA-SecYEG-systeem hebben we FRET-mappingmethoden gebruikt om de preproteïne-bindingsplaats te identificeren en de lokale conformatie van het gebonden signaalsequentiegebied te bepalen. Deze studie schetst de stappen voor het uitvoeren van FRET-mappingstudies, inclusief identificatie van geschikte etiketteringslocaties, bespreking van mogelijke labels, waaronder niet-inheemse aminozuurresiduen, etiketteringsprocedures, hoe metingen uit te voeren en het interpreteren van de gegevens.

Deze studie richtte zich op het bepalen van de locatie van de preproteïnebindingsplaats op SecA voorafgaand aan het inbrengen van het preproteïne in het SecYEG-kanaal. Om de bindingsplaats in kaart te brengen, werden FRET-experimenten uitgevoerd tussen verschillende regio's van het preproteïne en drie verschillende locaties op de SecA- en SecYEG-eiwitten (figuur 1A-D). Uit de verkregen afstanden en driedimensionale structuren van SecA, SecYEG en het preprote...

De studie beschrijft de methodologie van FRET-mapping, inclusief de selectie van etiketteringslocaties, keuze van kleurstoffen, acquisitie en data-analyse. Deze methodologie is effectief bij het bepalen van bindingsplaatsen, conformatieveranderingen en dynamische bewegingen in eiwitsystemen en is het meest nuttig als deze wordt uitgevoerd in combinatie met bestaande 3D-structurele informatie.

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: een nieuwe methodologie om wereldwijde structurele kenmerken op te helderen

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) is an established fluorescence-based method used to successfully measure distances in and between ...

We hebben een FRET-mappingmethodologie ontwikkeld die de identificatie en karakterisering van ligandbindingsplaatsen, subeenheidsoriëntatie, conformatieveranderingen geassocieerd met ligandbinding en dynamische bewegingen van eiwitten mogelijk maakt. Een voordeel van deze techniek is dat het in oplossing kan worden uitgevoerd en dat de moleculen vrij kunnen bewegen. De afstanden die met deze techniek worden gemeten, zijn geschikt voor biologische systemen.FRET is breed toepasbaar op veel systemen. Mapping verbetert de monitoring van structurele en dynamische veranderingen in elk biomoleculair systeem en is vooral effectief als er driedimensionale structurele informatie bestaat. Na het zuiveren van het eiwit, is het moeilijkste deel het labelen met hoge efficiëntie en het verwijderen van de vrije kleurstof.Voor de experimenten helpt het om zo min mogelijk vrije kleurstof te hebben. Kies om te beginnen etiketteringsplaatsen binnen 25 tot 75 angstrom van de punitieve bindingsplaats en in relatief statische gebieden van het eiwit. De afstand bepaalt het specifieke FRET-kleurstofpaar dat moet worden gebruikt.Lokaliseer de etiketteringsplaatsen in eiwitgebieden die relatief van elkaar verschillen. Dus de sites beschrijven de hoekpunten van een driehoek, met de bestraffende bindingsplaats in het midden. Om de R0-waarden te meten, afhankelijk van de gewenste cuvettegrootte en het gewenste volume, bereidt u twee eiwitmonsters in dezelfde concentratie totaal eiwit.Eén met het eiwit alleen gelabeld met de donorkleurstof en één met het eiwit gelabeld met alleen de acceptorkleurstof. Schakel de fluorometer in en open het spectrale acquisitie- en analyseprogramma in de FluorEssence-software, als u een spectrofluorometer gebruikt. Klik op de rode M om de computer op het instrument aan te sluiten en kies Emissiespectra.Voer scanparameters in met behulp van het menu-item experiment verzamelen, zoals excitatiegolflengte, het bereik voor emissiescan, temperatuur en monster wijzigen uw positie. Klik op RTC en geoptimaliseerde instrumentinstellingen zoals beschreven in het manuscript, door de fluorescentie-emissie op het hoogtepunt te controleren met behulp van een excitatiegolflengte die is ingesteld op het absorptiemaximum van de kleurstof. Plaats het door de donor gelabelde eiwitmonster in de monsterhouder en klik op uitvoeren om een emissiescan te genereren van het eiwit dat alleen met de donorkleurstof is gelabeld, door het monster op het kleurstofabsorptiemaximum te prikkelen en de emissiepiek te scannen.Stel een basislijn voor de scan vast door de scan uit te breiden tot 25 tot 50 nanometer voorbij het einde van de piek. Meet de kwantumopbrengst van het donor-only eiwit door absorpties en fluorescentiemetingen uit te voeren op monsters van verschillende concentraties, zoals beschreven in het tekstmanuscript. Bereid alleen donoreiwit, acceptor alleen eiwit en donor-acceptor eiwitmonsters, in dezelfde concentratie.Verkrijg de donor alleen scan om fluorescentie-emissiespectra te genereren. Prikkel de oplossing op het maximale dosisabsorptie van de donorkleurstof en scan de emissiepieken van de donor en de acceptor. Wissel het monster om naar het acceptor-eiwit of verander het monster in het cuvet dat het alleen-acceptor-eiwit bevat.Verkrijg een emissiescan van het eiwit dat alleen is gelabeld met de acceptorkleurstof. Prikkel het monster op de donor excitatiegolflengte. Wissel het monster om naar het donor-acceptor eiwitmonster of verander het monster verander uw positie in het cuvet dat het donor-acceptor gelabelde eiwit bevat.Verkrijg een emissiescan van het donor-acceptor eiwitmonster met dezelfde instellingen. Corrigeer voor alle spectra de achtergrondfluorescentie door de achtergrondtellingen af te trekken die aan het einde van de scan zijn gemeten. Gebruik een 3D grafisch weergaveprogramma zoals PyMOL om de afstanden op de structuur toe te wijzen, door de opdrachten uit het script rechtstreeks in het opdrachtvenster in te voeren met de juiste afstandsinformatie.Genereer een shell voor elke gemeten afstand en de bijbehorende fout. Breng de positie in kaart via het snijpunt van de verschillende schelpen. De signaalpeptidebindingsplaats werd in kaart gebracht met behulp van drie verschillende locaties op SecA en SecYEG en vier verschillende locaties op het signaalpeptide.FRET-experimenten tussen verschillende regio's van het pre-eiwit en drie verschillende locaties op de SecA- en SecYEG-eiwitten brengen de pre-eiwitbindingsplaats en oriëntatie in kaart. De punitieve bindingsplaats van het signaalpeptide werd eerder geïdentificeerd als de vinger met twee helixen en de SecA C-terminale staart suggereerde een oriëntatie parallel aan de vinger met twee helixen. Steady state FRET spectra tussen SecA37, en PhoA2, en PhoA22, werden verkregen.Vermindering van de donorintensiteit gaf aan dat er meer energie werd overgedragen door PhoA22. Ten opzichte van de PhoA2-site, die verder weg van SecA37 ligt. Time resolved fluorescence decay spectra toonden aan dat het donor-acceptor complex een korter homogeen verval heeft dat consistent is met energieoverdracht geassocieerd met één afstand.FRET-afstandsschalen geconstrueerd tussen het SecA PhoA2-residu en de driehoekige locaties, toonden aan dat elke schaal kruist met de twee-helixvinger, de veronderstelde bindingsplaats, die in groen wordt weergegeven. Het doorsneden gebied is kleiner dan elke FRET-schaal en bevat een grote bijdrage van de spiraalvormige steiger. FRET-afstandsschalen bepaald tussen het PhoA2-residu en de gelabelde locaties, beschrijven een kleiner gebied dichter bij de punt van de twee-helixvinger en de monding van het SecYEG-kanaal.Dit doorsneden gebied bevindt zich aan het tegenovergestelde uiteinde van de twee-helix vinger van PhoA2. Belangrijke dingen om te overwegen zijn onder meer de juiste selectie van de etiketteringslocaties om het interessegebied te trianguleren, om de kwantumopbrengsten voor elke site te meten en alle vrije kleurstof te verwijderen. Deze methode sluit aan bij structurele informatie die is verkregen met methoden zoals NMR of röntgenkristallografie.Wanneer de FRET-resultaten in een structurele context worden geplaatst, kan dit de bestaande informatie verbeteren.

frster-resonance-energy-transfer-mapping-new-methodology-to-elucidate

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Een combinatie van drie enkele golflengte korte gepulste lasers wordt gebruikt om coherent anti-Stokes Raman scattering (auto's) en dubbel-resonante CARS (DR-CARS) te genereren. Het verschil tussen deze signalen zorgt voor een verbeterde gevoeligheid voor anders moeilijk te coherent Raman signalen te detecteren, waardoor beeldvorming van zwakke Raman scatterers.

Differentiële beeldvorming van biologische structuren met dubbel-resonante Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS)

We beschrijven hier een verbeterde werkwijze Luminescentie Resonance Energy Transfer (LRET) waarin we introduceren protease splitsingsplaats tussen de donor en acceptor fluorofoor sites. Deze modificatie kunnen wij specifieke LRET signalen die door membraaneiwitten plaats, waardoor de studie van membraaneiwitten zonder eiwitzuivering verkrijgen.

Luminescentie Resonance Energy Transfer om te studeren vormveranderingen in membraaneiwitten Uitgedrukt in zoogdiercellen

We presenteren de opstelling en experimentele procedure om smFRET-gegevens te verkrijgen van grote donor-acceptor-netwerken met een TIRF-microscoop. De stapsgewijze analyse van deze metingen met de Bayesiaanse inferentiesoftware Fast-NPS levert hoog opgeloste structurele informatie op via de toepassing van aangepaste kleurstofmodellen.

Structurele Informatie van Single-molecule FRET experimenten met de Fast Nano-positioneringssysteem

Hier wordt een protocol voor hoogwaardige FRET-experimenten op het molecuulniveau voorgesteld. Daarnaast kan deze methodologie worden gebruikt om drie conformatieve staten in het ligand-bindende domein van de N-methyl-D-aspartaat (NMDA) receptor te identificeren. Het bepalen van precieze afstande is de eerste stap in de richting van het opbouwen van structurele modellen op basis van FRET-experimenten.

High Precision FRET op single-molecuul niveau voor biomolecule structuur bepaling

Structuren van supramoleculaire eiwit samenstellingen met atomaire resolutie zijn van groot belang vanwege hun cruciale rol in een verscheidenheid van biologische fenomenen. Hierin presenteren wij een protocol voor het uitvoeren van high-resolution structurele studies op onoplosbare en niet-kristallijne macromoleculaire eiwit samenstellen door magie-angle spinning solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (MAS SSNMR).

Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Dit witboek beschrijft een protocol om 3D-chemische kaarten combineren energie gefilterd beeldvorming en Elektronentomografie. De chemische verdeling van twee katalysator ondersteunt gevormd door elementen die moeilijk zijn te onderscheiden van andere beeldvormingstechnieken werd bestudeerd. Elke toepassing bestaat voor het toewijzen van overlappende chemische elementen - respectievelijk spaced-ionisatie randen.

3D-chemische kaarten door energie verkrijgen gefilterd Transmissie Electronenmicroscopie tomografie

Gepresenteerd hier is een protocol voor het uitvoeren van single-molecuul Förster resonantie energie overdracht te bestuderen HJ resolutie. Voor het bepalen van de dissociatieconstanten wordt tweekleurige alternerende excitatie gebruikt. Single-Color timelapse smFRET wordt vervolgens toegepast in real-time decolleté assays om de dwelltijd verdeling vóór HJ resolutie te verkrijgen.

Single-molecuul Förster Resonance Energy Transfer methoden voor real-time onderzoek van de Holliday Junction-resolutie door GEN1

Dit artikel presenteert een methode voor spatiotemporale analyse van mobiele, single-molecule Förster resonantie energieoverdracht (smFRET)-gebaseerde probes met behulp van widefield fluorescentiemicroscopie. De nieuw ontwikkelde softwaretoolkit maakt het mogelijk om smFRET-tijdsporen van bewegende sondes te bepalen, inclusief de juiste FRET-efficiëntie en de moleculaire posities, als functies van de tijd.

Geautomatiseerde tweedimensionale spatiotemporale analyse van mobiele fret-sondes met één molecuul

Elektronische pre-resonantie gestimuleerde Raman-verstrooiing (epr-SRS) beeldvorming van regenboogachtige Raman-kleurstoffen is een nieuw platform voor sterk gemultiplexte epitoop-gebaseerde eiwitbeeldvorming. Hier presenteren we een praktische gids met antilichaamvoorbereiding, weefselmonsterkleuring, SRS-microscoopassemblage en epr-SRS-weefselbeeldvorming.

Hoog-gemultiplexte weefselbeeldvorming met Raman-kleurstoffen

We presenteren een protocol om chemische beelden te verkrijgen met breedband gestimuleerde Raman scattering (SRS) microscopie. Gebaseerd op een SRS-microscoop die werkt met differentiële meerkanaals-lock-in detectie, beschrijft het protocol de monstervoorbereiding, aanpassing van het SRS-apparaat en chemometrie om verschillende bestanddelen van chemisch heterogene monsters te ontwarren.

Multiplex chemische beeldvorming op basis van breedband gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie

Het protocol geeft instructies voor het modificeren van RNA met dimethylsulfaat voor mutatieprofileringsexperimenten. Het omvat in vitro en in vivo tasten met twee alternatieve bibliotheekvoorbereidingsmethoden.

Onderzoekende RNA-structuur met dimethylsulfaatmutatieprofilering met sequencing in vitro en in cellen

Leer FRET-mapping om ligandbindingsplaatsen en conformationele veranderingen in eiwitten te identificeren met fluorescerende kleurstoffen. Deze methode werkt in oplossing en is breed toepasbaar in biochemisch onderzoek.

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: een nieuwe methodologie om wereldwijde structurele kenmerken op te helderen

Meer video's verkennen