Een robuuste methode voor de grootschalige productie van sferoïden voor screening- en analysetoepassingen met een hoog gehalte

Dit protocol biedt een methode om enkele honderden meercellige tumorvormige sferoïden te produceren in elke put van een multiputplaat die geschikt is voor geautomatiseerde microscopie. Geproduceerde sferoïden kunnen worden onderverdeeld in verschillende grootteklassen en subcellulaire informatie kan uit elke cel worden geëxtraheerd. De techniek produceert voldoende serums die kunnen worden gebruikt in directe screening en RNA-interferentiestudies.

Verdun ECM-keldermateriaal in koud fenolrood serumvrij medium met behulp van voorgekoelde uiteinden die op min 20 graden Celsius worden gehouden. Ik zet 15 microliter van het ECM-keldermateriaal en de mediumoplossing in op een 96 putbeeldplaat. Centrifugeer de plaat gedurende 20 minuten bij 91 maal G bij vier graden Celsius.

Incubeer de plaat niet langer dan 30 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg trips en EDTA toe aan de cellen. Incubateer de cellen bij 37 graden Celsius aan het einde van de incubatie, we suspenseren de cellen in een compleet medium met 10% FBS.

Pipetteer 10 microliter van de celsuspensie in een hemocytometertelkamer. Tel het aantal cellen in vier kwadranten van de kamer. Centra bekijkt de cellen op 135 keer G gedurende vier minuten bij kamertemperatuur.

Een van deze cellen wordt gepelletiseerd, zuigt het supernatant op en resuspendeert de cellen in een fenolrood vrij volledig medium om een concentratie van 10 tot de zes cellen per milliliter te verkrijgen. Verdun de cellen in een fenolrood vrij volledig medium. Zie de cellen druppelsgewijs in een cirkelvormige beweging in een totaal volume van 35 microliter per put.

Incubeer de cellen gedurende een uur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide. Bij 1,2 microliter ECM keldermateriaal tot 23,8 microliter fenolrood vrij volledig medium per put, wat resulteert in een eindvolume van 60 microliter per put. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide.

Vervang de volgende dag het medium door 100 microliter vers fenolroodvrij volledig medium. Plaats de 96 putplaat met sferoïden in een confocale screeningsmicroscoop met hoog gehalte. Selecteer de juiste lasers om de gebruikte vloeren te prikkelen.

Verkrijg de kanalen sequentieel om overspraak te voorkomen, stel de sferoïden in beeld met behulp van geschikte doelstellingen. Om de morfologie van sferoïden te analyseren, segmenteert u de sferoïden op basis van de fluorescerend geconjugeerde FLoid en kleuring. Segmenteer de kernen op basis van de zeskant drie, drie, drie, vier, twee kleuringen.

Segmenteer het cytoplasma van elke cel door de resterende hex drie, drie, vier, twee, kleuring die aanwezig is in het celcytoplasma. Bereken verschillende morfologische eigenschappen van de sferoïden, waaronder volume, oppervlakte, sfericiteit en het aantal kernen per zijn sferoïden. Ross heeft verder beelden om sferoïden kleiner dan 75 kubieke micrometer en een grotere dan 900.000 kubieke micrometer te verwijderen.

Om een enkele cel in sferoïden te analyseren, segmenteert u de sferoïden op basis van de fluorescerend geconjugeerde sferoïde kleuring. Segmenteer de kernen op basis van de zeskant drie, drie, drie, vier, twee kleuringen. Segmenteer het cytoplasma van elke cel door de resterende hex drie, drie, drie, vier, twee vlek die aanwezig is in het celcytoplasma.

Segmenteer de lysosomen op basis van de secundaire antilichaamkleuring. Bereken verschillende morfologische eigenschappen van de cellen binnen elke sferoïde, inclusief het aantal lysosomen per cel, celvolume en celoppervlak. De figuur toont goede overzichten van drie verschillende soorten sferoïden, inclusief afbeeldingen op verschillende confocale vlakken.

Er wordt ook een volumetrische weergave van de gehele sferoïden getoond. De figuur toont het pH-segmentatieproces, paneel A toont de volledige sferoïden in een volumetrische weergave. Paneel B toont de setsegmentatie van het cytoplasma, de kernen en de lysosomen in alle cellen van een enkele sferoïden.

Het cytoplasma en de kernen zijn gesegmenteerd op basis van de zeshoekkleuring drie, drie, drie, vier, twee. En lysosomen worden gesegmenteerd op basis van de antilaboratorium één antilichaamkleuring. Paneel C toont hetzelfde gesegmenteerd als paneel B, maar in een drievoudige weergave.

Er kunnen verschillende morfologische metingen op het niveau van de sferoïden worden gedaan. Deze metingen omvatten de berekening van het aantal kernen per sferoïden, evenals deze Felicity, volume en oppervlakte van de pH. Het typische volume van elke cel in de drie sferoïde typen.

Evenals het aantal lysosomen per cel worden in deze figuur weergegeven. Het optimaliseren van de initiële celzittingsdichtheid aan het begin van de SP-generatie is een cruciale stap. De figuur laat zien dat het toevoegen van te veel cellen nog steeds sferoïdenvorming mogelijk maakt.

Dit kan echter resulteren in de fusie als sferoïden. Sferoïden die op deze manier produceren, kunnen worden onderworpen aan transcriptomische en proteomische analyse. Deze techniek wordt gebruikt om de opname van medicijnafgifte zoals nanodeeltjes kwantitatief te analyseren en hun toxiciteit voor individuele cellen in de sferoïden te beoordelen.