Het kweken en screenen van de plant Parasitaire Nematode Ditylenchus dipsaci

Dit protocol maakt het mogelijk om nieuwe nematiciden te ontdekken om Ditylenchus dipsaci te bestrijden door middel van kweektechniek en chemische schermen met gemiddelde doorvoer. De eenvoud van deze techniek maakt het mogelijk om duizenden verbindingen per week te screenen om verbindingen met nematicidaal potentieel te identificeren. Deze techniek kan nieuwe verbindingen identificeren om plantparasitaire nematoden van gewassen te doden en daarom de wereldwijde voedselvoorziening te vergroten.

Bereid om te beginnen 500 milliliter voedingsagar of NA-media voor met 23 gram per liter NA en ultrazuiver water. Giet met behulp van steriele techniek 25 milliliter geautoclaveerde NA-media in 20 wegwerp petrischalen met een diameter van 100 millimeter en 15 millimeter diep. Bereid 500 milliliter Gamborg B5, of GA-media, met 3,2 gram per liter GA basaal medium met minimale organische stoffen, 20 gram per liter sucrose, 15 gram per liter agar en gedestilleerd water.

Giet met behulp van steriele techniek 50 milliliter geautoclaveerde GA-media in 10 wegwerp petrischalen. Om zaadsterilisatie uit te voeren, giet je 150 erwtenzaden in een steriel bekerglas van twee liter met een roerstaaf in de buurt van een Bunsen-brandervlam op een laboratoriumbank. Voeg 200 milliliter 95% ethanol toe aan de zaden en roer vijf minuten krachtig op de roerplaat.

Giet vervolgens ethanol in een afvalcontainer. Giet bleekoplossing in het bekerglas om de zaden volledig onder te dompelen. Roer krachtig op een roerplaat gedurende 20 minuten.

Giet vervolgens het bleekmiddel af in een afvalcontainer. Giet gedestilleerd water in het bekerglas om de zaden onder te dompelen en roer krachtig op een roerplaat gedurende 20 minuten. Giet na de laatste waterwas gesteriliseerde zaden in de glazen petrischaal.

Om te controleren op besmetting, breng zes zaden over naar elke 10-centimeter NA-plaat in de laminaire stroomkap met behulp van gesteriliseerde tang. Schik de zaden rond de omtrek van de plaat. Wikkel de platen afzonderlijk in laboratoriumwikkelfolie en incubeer ze drie dagen in het donker bij 26 graden Celsius.

In een laminaire stromingskap, plaat twee niet-verontreinigde zaden op elke GA-plaat met gesteriliseerde tang. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 7 tot 10 dagen om zaden te laten ontkiemen. Bereid 50 milliliter sucrose-oplossing van 20 gram per liter.

Filter steriliseer de sucrose-oplossing en zet apart. Snijd in een laminaire stroomkap een stuk agar met wortelweefsel van een bestaande kweekplaat. Pipetteer 500 microliter sucrose-oplossing op een nieuwe GA-plaat met erwtenzaailingen en plaats een agarblokje bovenop de sucrose.

Bewaar de cultuur in een doos bekleed met aluminiumfolie op kamertemperatuur. Om de cultuur in stand te houden, subcultureren de aaltjes elke acht tot negen weken op verse GA-platen. Nematoden zijn na ongeveer acht weken klaar om te worden geëxtraheerd.

Snijd in een laminaire stroomkap de agar en het wortelweefsel in blokjes van één centimeter met een steriel scalpel. Breng de agarblokjes over in de met koffiefilters beklede trechter en giet langzaam gedestilleerd water op de agar om het koffiefilter te bevochtigen. Verwijder de met koffiefilters beklede trechter uit het bekerglas en vul het bekerglas met gedestilleerd water totdat het waterniveau net de bodem van het filter raakt zodra de met koffiefilter beklede trechter is vervangen.

Bedek de met koffiefilters beklede trechter en bekerglas met aluminiumfolie. Om de wormen te verzamelen, verwijdert u de met koffiefilters beklede trechter en zuigt u de bovenste 40 milliliter water uit het verzamelbeker op, zonder de bezonken wormen te verstoren. Verzamel de resterende vloeistof in een conische centrifugebuis van 15 milliliter met een plastic serologische pipet van 10 milliliter.

Om de testplaten te bereiden, giet u autoclaaf gedestilleerd water in een steriele trog en doseert u 40 microliter gedestilleerd water uit de trog in elke put van een vlakke bodemplaat met 96 putten met een meerkanaalspipet. Voeg chemicaliën van de 96-well chemische voorraadplaten toe aan de testplaten door drie keer in de chemische plaat te pinnen. Breng vervolgens de pinnen 10 keer over in de testplaat.

Dep op papier voor de reinigingsoplossing. Om het aantal nematoden uit de collectie te tellen, schorst u eerst de verzameling opnieuw en pipetteert u vervolgens vijf microliter van de oplossing met behulp van tips met lage retentie op een dia. Tel het aantal nematoden in vijf microliters met behulp van een dissectiemicroscoop.

Pas vervolgens de concentratie aan op twee wormen per microliter met behulp van steriel, gedestilleerd water. Voeg vervolgens 10 microliter van het monster toe aan elke put van de 96-putplaten met een meerkanaalspipet en een trog. Wikkel de borden in met een vochtig keukenpapier en doe ze in een doos.

Voeg vervolgens een extra vochtige papieren handdoek toe om te stabiliseren en minimale beweging van de platen te garanderen en bevestig op een kleverige pad in een schudincubator van 20 graden Celsius ingesteld op 200 RPM. Bekijk de platen op dag vijf onder een ontleedmicroscoop. Tel het aantal mobiele en totale D.dipsaci in DMSO-oplosmiddelcontroles en met geneesmiddelen behandelde putjes.

Als de wormen onbeweeglijk zijn, voeg dan twee microliter eenvoudig natriumhydroxide toe aan een eindconcentratie van 40 millimolair aan de put om beweging te stimuleren. Bereken het aandeel mobiele wormen. In de D.dipsaci-schermen worden putten die reproduceerbaar 0% mobiele wormen opleverden, gecategoriseerd als sterke hits.

Drie verschillende medicijnplaten werden gescreend in een concentratie van 60 micromolair, waarbij elke medicijnplaat drie biologische replicaties heeft. Alle drie de platen bevatten 6% dmso-solvent-only controles. Veel platen met geneesmiddelen uit de bibliotheek met kleine moleculen misten elk molecuul met waarneembare bioactiviteit tegen D.dipsaci.

Sommige platen hadden volledig reproduceerbare hits, terwijl andere gekarakteriseerde nematiciden varieerden in hun activiteit. De foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde. Hier vertoonde fluopyram robuuste activiteit in de test.

Fluopyram veroorzaakte een duidelijk dosisafhankelijk effect op de mobiliteit van D.dipsaci met een EC50 van 9,3-micromolair. Oxamyl had geen significant effect op de mobiliteit tot een concentratie van 120 micromolair. Oxamyl had geen significant effect op de mobiliteit tot een concentratie van 120 micromolair.

De toevoeging van natriumhydroxide verbeterde de testgevoeligheid bij het detecteren van immobiele wormen. 40-millimolair natriumhydroxide werd gebruikt als het testeindpunt om beweging bij capabele individuen te stimuleren en zo rustende wormen van zieke wormen te onderscheiden. Dit protocol heeft de identificatie mogelijk gemaakt van verbindingen met nieuwe werkingsmechanismen tegen D.dipsaci en andere soorten.