High-Throughput analyse van niet-fotochemische blussing in gewassen met behulp van pulsamplitude gemoduleerde chlorofylfluorometrie

Deze methode kan inzicht geven in de genetische variatie in niet-fotochemische blussing die beschikbaar is binnen genetische diversiteitspanels of broedpopulaties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het potentieel om een groot aantal genotypen binnen één dag te screenen op variatie in niet-fotochemische blussing. Het protocol wordt gepresenteerd voor glycine max of sojabonen, maar kan worden aangepast om andere plantenruimtes te analyseren waaruit liftschijven kunnen worden verzameld.

Voor iemand die het protocol voor de eerste keer uitvoert, is de sleutel het hanteren van de liftschijf om schade of oververzadigde sponzen met water te voorkomen. Om te beginnen, bemonster de planten op de veldlocatie 30 dagen na ontkieming. Vul 1/3-niveau gedestilleerd water in alle putten van een 24-well plaat.

Label het deksel en de zijkant van de plaat met de te bemonsteren replica's. Houd het jongste volledig geëxpandeerde blad dat aan de bovenkant van de plant aanwezig is tegen een rubberen stop. Druk een nummer twee Humboldt kurkboorder door het blad en draai om een schijf te snijden, waarbij de middenrib wordt vermeden.

Verzamel achtereenvolgens vijf schijven van hetzelfde blad voor technische replicaties. Duw de bladschijven uit de kurkboorder in een enkele put van een 24-wells plaat met behulp van een wattenstaafje en herhaal dit voor een andere plant van hetzelfde genotype. Controleer of alle bladschijven in het water drijven.

Zo niet, beweeg dan voorzichtig bladschijven die aan de zijkant van een put kleven in een zwevende positie met een wattenstaafje. Ga verder met bemonsteringsschijven uit de volgende plot. Plaats het deksel en sluit af met een semi-transparante flexibele folie.

na het voltooien van de bemonstering in de gehele 24-well plaat. Bewaar het bord uit direct zonlicht in een zak, doos of lege koeler. Tik in een schone laboratoriumruimte op het deksel van de verzegelde plaat om bladschijven los te maken die tijdens het transport aan het deksel zijn vastgeplakt.

Pak de film uit en verwijder het deksel. Breng een bladschijf van de eerste positie van de 24-well plaat over in een verse 96-well plaat met de bladschijf plat naar beneden gericht op de bodem van de put. Snijd een neusaspiratorfilter doormidden.

Dompel het resulterende filter halverwege in water en dep op een papieren handdoek om overtollige vloeistof te verwijderen. Plaats het filter in de put met de bladschijf om de luchtvochtigheid op peil te houden. Neem een tweede bladschijf vanaf de eerste positie van de 24-well plaat en plaats deze met de voorkant naar beneden in de volgende beschikbare positie van de 96-well plaat.

Dompel de resterende helft van het geproduceerde neusfilter in water en dep het op een papieren handdoek voordat u het met de tweede bladschijf in de put steekt. Plak de rechterbovenhoek vast om de plaat in het donker te oriënteren voor beeldvorming. Sluit platen af met een semi-transparante flexibele film en wikkel de plaat in aluminiumfolie.

Schrijf de plot-ID's en plaat-ID op de aluminiumfolie. Plaats platen in een donkere doos of kast gedurende minimaal 30 minuten voor de ontspanning van de eerste twee fasen van niet-fotochemisch blussen. Gebruik een langdurige donkere incubatietijd van een uur voor beeldvorming als langdurige fasen van niet-fotochemische blussing van belang zijn.

Bereid een extra dummyplaat voor om tijdens de analyse scherp te stellen door een bladschijf in elke hoek van een verse 96-well plaat en een in het midden te plaatsen. Beveilig bladschijven met neusfilters zoals gedaan met eerdere platen, sluit de plaat af en incubeer in het donker bij kamertemperatuur en 50% relatieve vochtigheid. Schakel de imager in en open de imaging software.

Klik op Instellingen gevolgd door Protocol om een venster te openen voor het invoeren van stappen in het PAM experimentele protocol. Stel de technische specificaties van de machine in het manuscript in. Stel het programma in om te beginnen met een verzadigingspuls om de maximale kwantumefficiëntie van donker-aangepaste fotosynthese te meten door 20 seconden in te voeren in het vak met de naam After a delay of.

Klik op het vak Puls toepassen en voer 1 in het vak met de titel Dit aantal keren in. Stel de puls PPFD in op 6, 152, de pulslengte op 800 milliseconden en vink het vakje aan Neem F prime- en FM-prime-beelden met alle pulsen. Schakel Invoegen na in om een tweede stap aan het protocol toe te voegen.

Voer 30 seconden in het vak met de titel Na een vertraging van in. Selecteer vervolgens de optie Actinic wijzigen en voer 50 in het vak met de titel Actinic PPFD in om de lichtintensiteit in de kamer in te stellen op 50 PPFD. Klik op Invoegen na om een nieuwe stap aan het protocol toe te voegen en voer 150 seconden in het vak met de titel Na een vertraging van in.

Selecteer Puls toepassen en voer 4 in het vak Dit aantal keren om meetpulsen om de 150 seconden vier keer achter elkaar toe te passen terwijl het actinische licht op 50 PPFD wordt gehouden. Pas de vertraging en lichtintensiteit voor elke stap aan volgens de waarden in het manuscript voordat u het protocol opslaat als een pcl-bestand op de gewenste locatie. Doe het licht uit en plaats de dummyplaat met de voorkant naar beneden op het monstertrap, zodat het adaxiale oppervlak van het blad naar de detector wijst en de spons naar beneden naar het platform is gericht.

Stel de hoogte van het monstertrapsysteem zo in dat de bladschijven zich 140 millimeter boven de basis van het instrument bevinden. Klik op het pictogram Verbinden/loskoppelen van de camera en de hardwarecamera om de camera te starten. Klik op het focusfluorescentiesymbool, dat wordt weergegeven door een roodgekleurd, tweezijdig pijlpictogram met twee groene lijnen aan de basis, en pas de lens en belichting aan om de plaat scherp te stellen.

Klik nogmaals op het focusfluorescentiepictogram om het knipperende lampje uit te schakelen. Werk in het donker en vervang de dummyplaat door de te analyseren plaat. Plaats het met de voorkant naar beneden met de tape aan de buitenkant die wordt gebruikt om de rechterbovenhoek te oriënteren en klik op het pictogram van de kaartafbeeldingscamera.

Pas de beeldbelichting aan door het diafragma te openen of te sluiten totdat de balk in het pop-upvenster in de groene zone is geplaatst. Klik op de knop Opnieuw proberen na elke aanpassing van het diafragma totdat de belichting correct is aangepast en het instrument een opname maakt. Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en selecteer Afbeeldingsisolatie toepassen om achtergrondsignalen te blokkeren.

Het gefocuste bladgebied wordt grijs weergegeven en de achtergrond blauw. Selecteer het gebied of de pixels die u wilt gebruiken om alleen de bladschijven op te nemen door het histogram- en gammaniveau aan te passen in het vervolgkeuzemenu Afbeelding wijzigen door met de rechtermuisknop op de afbeelding te klikken. Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en selecteer Hoge en lage delen verwijderen om de lichtblauw gemarkeerde gebieden te verwijderen.

Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en selecteer Afdwalen verwijderen om alle pixels te verwijderen die de laatste drie andere pixels niet raken. Alle gebieden op de afbeelding die als geïsoleerde eilanden worden weergegeven, worden afzonderlijk geanalyseerd en opgenomen in de uiteindelijke gegevensuitvoer. Klik op het pictogram Protocol uitvoeren om het programma te starten.

Er verschijnt een timer onder aan het scherm die u informeert hoe lang het protocol nog moet worden uitgevoerd. Wacht tot het protocol klaar is. Klik op Bestand en Opslaan als om de gegevens op te slaan als een iGR-bestand.

Sluit het venster door op het rode kruis in de rechterbovenhoek van het venster te klikken voordat u een andere monsterplaat start. Om de chlorofylfluorescentiegegevens te exporteren, opent u het igr-bestand in de beeldbewerkingssoftware en klikt u op Bestand gevolgd door Exporteren naar map om een nieuwe map met alle benodigde bestanden te maken. Een typische meting van niet-fotochemische blussing in in het veld gekweekte sojabonen toonde aan dat na een eerste verzadigingsflits om Fv / Fm te bepalen wanneer de bladschijven werden blootgesteld aan weinig licht van 50 micromol per meter per seconde, de niet-fotochemische blusbeurt minder dan één was.

Bovendien nam bij overdracht naar hoog licht van 2.000 micromol per meter per seconde het niet-fotochemische blussen na 15 minuten toe tot de maximale waarde van vier. Een mislukte meting toonde een minimale toename van niet-fotochemische blussing bij overdracht naar hoog licht. Het oriënteren van platen in de imager en een duidelijk gedefinieerd plan voor het bemonsteren en plateren van bladschijven is essentieel om ervoor te zorgen dat de gegevens zijn gekoppeld aan het juiste genotype.

Dit protocol kan de impact van omgevingsvariabelen zoals droogte en afstoten op niet-fotochemische blussen kwantificeren of niet-fotochemische blussen op verschillende canopy-niveaus evalueren om gewasmodellen te verfijnen.