Name: Een zeer schaalbare aanpak om ecologische onderzoeken van zelfrijdende Caenorhabditis-nematoden uit te voeren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Leer een schaalbare methode voor ecologisch onderzoek van Caenorhabditis-nematoden met mobiele datacollectie en cloudtechnologie. Deze aanpak verbetert de nauwkeurigheid en toegankelijkheid van veldgegevens.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door start-up fondsen van Northwestern University en een National Science Foundation CAREER Award (IOS-1751035), beide toegekend aan E.C.A.

<ol><li>Frézal, L., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+outside+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849(2015).</li>
<li>Sivasundar, A., Hey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+from+natural+populations+with+RNAI+reveals+high+outcrossing+and+population+structure+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Sampling from natural populations with RNAI reveals high outcrossing and population structure in Caenorhabditis elegans.</a> Current Biology: CB. 15 (17), 1598-1602 (2005).</li>
<li>Kiontke, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phylogeny+and+molecular+barcodes+for+Caenorhabditis%2C+with+numerous+new+species+from+rotting+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">A phylogeny and molecular barcodes for Caenorhabditis, with numerous new species from rotting fruits.</a> BMC Evolutionary Biology. 11, 339(2011).</li>
<li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+life+in+compost%3A+temporal+and+spatial+variation+of+North+German+Caenorhabditis+elegans+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations.</a> Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).</li>
<li>Richaud, A., Zhang, G., Lee, D., Lee, J., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+local+coexistence+pattern+of+selfing+genotypes+in+Caenorhabditis+elegans+natural+metapopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The local coexistence pattern of selfing genotypes in Caenorhabditis elegans natural metapopulations.</a> Genetics. 208 (2), 807-821 (2018).</li>
<li>Ferrari, C., Salle, R., Callemeyn-Torre, N., Jovelin, R., Cutter, A. D., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephemeral-habitat+colonization+and+neotropical+species+richness+of+Caenorhabditis+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ecology%22%5BJournal%5D)">Ephemeral-habitat colonization and neotropical species richness of Caenorhabditis nematodes.</a> BMC Ecology. 17 (1), 43(2017).</li>
<li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sampling+of+Hawaiian+Caenorhabditis+elegans+reveals+high+genetic+diversity+and+admixture+with+global+populations%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Deep sampling of Hawaiian Caenorhabditis elegans reveals high genetic diversity and admixture with global populations.</a> eLife. 8, 50465(2019).</li>
<li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+adaptation+and+spatiotemporal+patterns+of+genetic+diversity+revealed+by+repeated+sampling+of+Caenorhabditis+elegans+across+the+Hawaiian+Islands%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Noble, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selfing+is+the+safest+sex+for+Caenorhabditis+tropicalis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Selfing is the safest sex for Caenorhabditis tropicalis.</a> eLife. 10, 62587(2021).</li>
<li>Cutter, A. D., Morran, L. T., Phillips, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Males%2C+Outcrossing%2C+and+Sexual+Selection+in+Caenorhabditis+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Males, Outcrossing, and Sexual Selection in Caenorhabditis Nematodes.</a> Genetics. 213 (1), 27-57 (2019).</li>
<li>Petersen, C., Dirksen, P., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+we+need+more+ecology+for+genetic+models+such+as+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Why we need more ecology for genetic models such as C. elegans.</a> Trends in Genetics: TIG. 31 (3), 120-127 (2015).</li>
<li>Haber, M., Schüngel, M., Putz, A., Müller, S., Hasert, B., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+history+of+Caenorhabditis+elegans+inferred+from+microsatellites%3A+evidence+for+spatial+and+temporal+genetic+differentiation+and+the+occurrence+of+outbreeding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding.</a> Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2005).</li>
<li>Barrière, A., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+C.+elegans+and+Related+Nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Isolation of C. elegans and Related Nematodes.</a> WormBook. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19764/ (2018).</li>
<li>Poullet, N., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sampling+and+isolation+of+C.+elegans+from+the+natural+habitat%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sampling and isolation of C. elegans from the natural habitat.</a> Methods in Molecular Biology. 1327, 221-229 (2015).</li>
<li>Di Bernardo, M., Crombie, T. A., Cook, D. E., Andersen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((easyFulcrum%3A+An+R+package+to+process+and+analyze+ecological+sampling+data+generated+using+the+Fulcrum+mobile+application%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">easyFulcrum: An R package to process and analyze ecological sampling data generated using the Fulcrum mobile application.</a> PloS one. 16 (10), 0254293(2021).</li>
<li>Mobile data collection & workflow automation in NCAP. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/">https://www.fulcrumapp.com/</a> (2021).</li>
<li>Nematode Isolation Application. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-isolation">https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-isolation</a> (2021).</li>
<li>Nematode Field Sampling Application. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-field-sampling">https://www.fulcrumapp.com/apps/nematode-field-sampling</a> (2021).</li>
<li>JOVE wild_isolate-genotyping-template. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://docs.google.com/spreadsheets/d/1oEP40jy6_K6Wkwn7Qm4iF58rTUe4JWk2zhJ20-keoOk/edit">https://docs.google.com/spreadsheets/d/1oEP40jy6_K6Wkwn7Qm4iF58rTUe4JWk2zhJ20-keoOk/edit</a> (2021).</li>
<li>Nucleotide BLAST: Search nucleotide databases using a nucleotide query. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch">https://blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch</a> (2021).</li>
<li>easyFulcrum. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html">http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html</a> (2021).</li>
<li>Andersen, E. C., Bloom, J. S., Gerke, J. P., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+in+the+neuropeptide+receptor+npr-1+is+a+major+determinant+of+Caenorhabditis+elegans+growth+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A variant in the neuropeptide receptor npr-1 is a major determinant of Caenorhabditis elegans growth and physiology.</a> PLoS Genetics. 10 (2), 1004156(2014).</li>
<li>Tuli, M. A., Daul, A., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormBook%3A+Caenorhabditis+Nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">WormBook: Caenorhabditis Nomenclature.</a> WormBook. , (2018).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormBook%3A+Maintenance+of+C.+Elegant%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">WormBook: Maintenance of C. Elegant.</a> WormBook. , (2006).</li>
</ol>

De auteurs melden geen belangenverstrengeling.

Dit protocol bevat kritieke stappen die met de nodige voorzichtigheid moeten worden uitgevoerd. Het is bijvoorbeeld belangrijk dat de veld- en isolatieteams zorgvuldig het juiste verzamelproject in de toepassing selecteren voordat ze monsters uit het veld verzamelen of nematoden isoleren van de monsters in het laboratorium. In het geval dat het verkeerde verzamelproject wordt geselecteerd, kunnen de foutieve gegevensrecords het beste worden gecorrigeerd in de Fulcrum-database met behulp van de online tools voor het bewerken van records. Dit proces kan vervelend zijn voor veel misplaatste records. De database bewaart echter alle wijzigingen in records, zodat een volledige controle van verzamelings- en isolatierecords mogelijk is. De andere kritieke stappen in dit protocol omvatten de behandeling van monsters uit het veld en de nematoden die uit die monsters zijn geïsoleerd. Om ervoor te zorgen dat Caenorhabditis-nematoden de bemonsterings- en verzendingsstappen overleven, moet de temperatuur van de monsters tussen 4 °C en 25 °C worden gehouden. Temperaturen boven 25 °C kunnen steriliteit veroorzaken in C. elegans14. Zorg ervoor dat monsters waar mogelijk binnen vijf dagen van verzamelzakken naar verzamelplaten worden overgebracht om het verlies aan nematoden te minimaliseren. Nadat nematoden zijn geïsoleerd, is het van cruciaal belang dat ze worden gegenotypeerd en gecryopreserveerd voordat ze vergaan. Het is moeilijk om levende aaltjes te vinden op S-platen die meer dan twee tot drie weken oud zijn omdat schimmel- en bacteriële besmetting de S-platen onherbergzaam kunnen maken.
Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast aan verschillende soorten gegevens die onderzoekers mogelijk willen verzamelen terwijl ze in het veld zijn. Het is bijvoorbeeld eenvoudig om de toepassing 'Nematode field sampling' aan te passen met nieuwe gegevensinvoervelden met behulp van de online GUI van Fulcrum voor het bewerken van toepassingen. Bovendien kan het data-analysepakket, easyFulcrum, deze bewerkingen accommoderen bij het verwerken van de nieuwe gegevens15. Een andere wijziging die gebruikers aantrekkelijk kunnen vinden, is om een andere bemonsteringsmethode in het veld te gebruiken. In plaats van afzonderlijke substraten te bemonsteren, willen onderzoekers misschien grotere gebieden bemonsteren die meerdere substraattypen bevatten. Deze grotere monsters kunnen het beste in het laboratorium worden verwerkt met behulp van de Baermann-trechter- of trayextractiemethoden13. Belangrijk is dat het gebruik van C-labels en S-labels nog steeds van toepassing is op deze technieken en daarom compatibel is met mobiele applicaties.
De primaire beperkingen van dit protocol hebben betrekking op de verwerkingstijd van nematoden voorafgaand aan isolatie in het laboratorium. Ten eerste maakt de vertragingstijd tussen monsterverzameling en isolatie van nematoden het onmogelijk om de ontwikkelingsstadia van nematoden op een bepaald monster op het moment van verzameling vast te leggen. Ten tweede zijn de frequentie van mannetjes en outcrossing in de natuur belangrijke evolutionaire vragen voor het zelf bepalen van Caenorhabditis-nematoden10. Deze methode is niet geschikt om deze vragen aan te pakken, omdat nematoden waarschijnlijk meerdere generaties voorafgaand aan isolatie hebben doorlopen. Vertraagde isolatie betekent dat direct bewijs van mannelijke frequentie in de natuur onmogelijk is. Bovendien betekent de multi-generatie vertraging tijdens de genotyperingsstappen dat genomisch bewijs van outcrossing (heterozygositeit) zal worden geërodeerd voordat een nematodenstam kan worden gesequenced. Om heterozygositeit in de natuur te identificeren, worden de nakomelingen geproduceerd door een nematode die direct geïsoleerd is van de natuur gebruikt voor sequencing2. Een andere mogelijke beperking van dit protocol is dat het bevooroordeeld is in de richting van de identificatie van zelf-Caenorhabditis. Dit komt omdat geïsoleerde nematoden van zichzelf zichzelf ontwikkelende soorten een grotere kans hebben om zich te vermenigvuldigen dan obligate outcrossers, die zich alleen zullen vermenigvuldigen als een bevrucht vrouwtje wordt geïsoleerd.
Deze verzamelmethode is gebaseerd op bestaande verzamelprotocollen13,14. De belangrijkste vooruitgang van deze techniek is het gebruik van mobiele technologie en aangepaste software om de organisatie van enorme hoeveelheden ecologische en moleculaire gegevens in verband met grootschalige verzamelprojecten te vergemakkelijken. De ecologische gegevens die met behulp van dit verzamelprotocol worden gegenereerd, kunnen worden gebruikt om openstaande vragen voor natuurlijke populaties van Caenorhabditis-soorten aan te pakken. Gegevens die met deze methode zijn gegenereerd, zijn bijvoorbeeld gebruikt om nichevoorkeuren voor de soort op de Hawaiiaanse eilanden te ontdekken. Bovendien kunnen onderzoekers door het sequentiëren van de genomen van gecryopreserveerde nematoden onderzoeken hoe patronen van genetische variatie gecorreleerd zijn met ecologische gegevens. Dergelijk onderzoek kan handtekeningen van lokale aanpassing in Caenorhabditis-populaties blootleggen en belangrijke inzichten verschaffen in de relevantie van genetische variatie in natuurlijke contexten8. Om een functioneel begrip te krijgen van veel genen in Caenorhabditis-nematoden, zijn waarschijnlijk ecologische studies vereist11. Zelfs voor C. elegans mist een groot deel van de genen functionele annotaties, ondanks dat het het eerste meercellige dier is dat wordt gesequenced en een van de meest grondig bestudeerde dieren op aarde is. Dit verzamelprotocol is ontwikkeld om deze kenniskloof aan te pakken door de verzameling van wilde Caenorhabditis-nematoden en de studie van hun ecologie en natuurlijke genetische diversiteit te vergemakkelijken.

De laatste twee decennia is er meer belangstelling voor de ecologie van Caenorhabditis nematoden. Uit deze studies weten we dat de vrijlevende Caenorhabditis-soorten kunnen worden geïsoleerd uit kortstondige microhabitats in zowel gematigde als tropische streken, waar ze zich voeden met microbiële bloei geassocieerd met ontbindend plantaardig materiaal, soms in sympatry1,2,3,4,5,6,7,8 . We hebben ook geleerd dat convergente evolutie van zelfbevruchting drie keer in het geslacht heeft plaatsgevonden, en zelfvorming is de dominante reproductiewijze voor C. briggsae, C. elegans en C. tropicalis9,10. Onder deze selfers is C. elegans een van de meest bestudeerde dieren op aarde en is door onderzoekers gebruikt om kritische vooruitgang te boeken in de biologie. Belangrijk is dat de andere zelfrijdende Caenorhabditis-soorten veel van C. elegans experimentele voordelen delen en snel vergelijkende studies in het geslacht bevorderen. De cryptische aard van deze nematoden in het wild maakt het echter moeilijk om hun ecologie en natuurlijke diversiteit te bestuderen, wat van cruciaal belang is voor het begrijpen van de biologische functies van hun genen en de manieren waarop evolutie de genetische diversiteit tussen de soorten heeft gevormd10,11.
De grootste uitdaging voor het bestuderen van de ecologie van zelfzuchtige Caenorhabditis-nematoden in het wild is hun kleine formaat; volwassen nematoden zijn vaak 1 mm lang of minder. Deze uitdaging vereist dat onderzoekers substraten uit het wild bemonsteren en proberen nematoden van belang te scheiden van de substraten in het laboratorium zonder de mogelijkheid om dieren in het wild te observeren. Omdat zelfs getrainde experts het moeilijk vinden om zelf-zelfhoudende Caenorhabditis-nematoden onder de microscoop te onderscheiden van andere vrijlevende nematoden, worden nematoden meestal uit het substraat verwijderd, geïsoleerd en achtergelaten om zich te vermenigvuldigen voordat ze worden geïdentificeerd door sequentie-identiteit met behulp van gevestigde moleculaire barcodes3,12,13,14 . De tijd en moeite die nodig is om elk aaltje op deze manier te verwerken, vormt een organisatorische uitdaging, omdat onderzoekers in staat moeten zijn om de identiteit van elke in het laboratorium geïsoleerde nematode terug te voeren op het exacte substraat en de bijbehorende ecologische gegevens die in het veld zijn bemonsterd. Hier beschrijven we een stapsgewijs proces om zelf-zelfbindende Caenorhabditis-nematoden uit het veld efficiënt te verzamelen en te identificeren en deze isolaten op grote schaal getrouw te koppelen aan hun bijbehorende ruimtelijke en ecologische gegevens.
Deze verzamelmethode verhoogt de schaal en nauwkeurigheid van ecologische onderzoeken door gebruik te maken van mobiele dataverzamelingsplatforms, cloudgebaseerde databases en de R-softwareomgeving. Fulcrum is een aanpasbaar platform voor gegevensverzameling dat werkt met de meeste mobiele apparaten en waarmee gebruikers aangepaste applicaties kunnen bouwen om locatiegebaseerde gegevens (https://www.fulcrumapp.com) te verzamelen en te organiseren. Dit protocol biedt gedetailleerde instructies voor het gebruik van aangepaste gegevensverzamelingstoepassingen om ruimtelijk expliciete ecologische gegevens uit het veld te organiseren en die gegevens nauwkeurig te koppelen aan de identiteit van nematoden die in het laboratorium zijn geïsoleerd. Het protocol legt ook uit hoe zelf-zelf-erende Caenorhabditis-nematoden efficiënt kunnen worden geïdentificeerd met behulp van gevestigde moleculaire barcodes. De gegevens van deze methoden kunnen eenvoudig en reproduceerbaar worden verwerkt met het bijbehorende R-softwarepakket easyFulcrum15 om de ecologie en genetische diversiteit van natuurlijke Caenorhabditis-populaties te verkennen.

<table><tbody><tr><td>Zelfklevende etiketten</td><td>Avery</td><td>61533</td><td>Afdrukken van de C-labels en S-labels</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thomas Scientific</td><td>C748D75</td><td>agarose gel voorbereiding</td></tr><tr><td>Rugzak</td><td></td><td></td><td>Een rugzak voor elk teamlid om apparatuur, monsters, voedsel en water voor de dag in te doen.</td></tr><tr><td>Kartondozen</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS261</td><td>Opslag van S-platen</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>Nematoden lysis, SSU en ITS2 PCR</td></tr><tr><td>Verzamelzakken</td><td>Zip-lock</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>Verzamelen van substraten</td></tr><tr><td>Digitaal temperatuur-/vochtigheidsmeter</td><td>Preciva</td><td>HT-86</td><td>Meten van omgevingstemperatuur en vochtigheid</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>Nematoden isolatie, lysis</td></tr><tr><td>Duurzame reservoirs</td><td>USA Scientific</td><td>1306-1010</td><td>Aliquoteren van PCR mastermixes en ladingsverf</td></tr><tr><td>DNA ladder, 1 KB plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0243</td><td>Visualisatie van SSU en ITS2 PCR producten</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Thomas Scientific</td><td>CB4430-2</td><td>PCR mastermix component</td></tr><tr><td>easyFulcrum R-pakket</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>Een R-pakket voor het verwerken van verzamelgegevens http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html</td></tr><tr><td>EDTA-oplossing (0,5 M pH 8,0)</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>Zie aanvullende tabel 3 voor recept</td></tr><tr><td>Ethanol (95%)</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>Monsters uitplateren, lepel sterilisatie</td></tr><tr><td>Ethidiumbromide-oplossing (10 mg/mL)</td><td>VWR</td><td>97064-602</td><td>Visualisatie van SSU en ITS2 PCR producten</td></tr><tr><td>Externe batterijlader voor mobiel apparaat</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>Externe batterijlader en oplaadkabel voor iPhone of Android</td></tr><tr><td>Fles (500 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB501500</td><td>agarose gel voorbereiding</td></tr><tr><td>Voedsel</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>Dienovereenkomstig in te pakken</td></tr><tr><td>Gelelektroforese apparaat</td><td>Thermo Scientific</td><td>B2</td><td>Visualisatie van SSU en ITS2 PCR producten</td></tr><tr><td>Gelelektroforese voeding</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td>Visualisatie van SSU en ITS2 PCR producten</td></tr><tr><td>Gel ladingsverf, 6x</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td>Visualisatie van SSU en ITS2 PCR producten</td></tr><tr><td>ITS2 primer set</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>oECA1687 = voorwaartse primer CTGCGTTACTTACCACGAATTG CARAC, oECA202 = omgekeerde primer GCGGTATTTGCTACTACCAYYAM GATCTGC</td></tr><tr><td>ITS2 sequencing primer</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>oECA306 = voorwaartse primer CACTTTCAAGCAACCCGAC</td></tr><tr><td>Lysis buffer</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>Nematoden lysis, zie protocol voor recept</td></tr><tr><td>Microgolfoven</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>agarose gel voorbereiding</td></tr><tr><td>Mobiele apparaat</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>Opgeladen telefoon in vliegtuigmodus. De GPS-posities van de Fulcrum-app zijn onnauwkeurig in vergelijking met de GPS-posities die uit foto's zijn geëxtraheerd. Deze instelling zorgt ervoor dat u minder stroom verbruikt en nauwkeuriger GPS-metingen krijgt.</td></tr><tr><td>NGMA-platen, 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>C-platen, zie Andersen et al. 2014 voor NGMA-plaatprotocol.</td></tr><tr><td>NGMA-platen, 3,5 cm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>5662-7102Q</td><td>S-platen, zie Andersen et al. 2014 voor NGMA-plaatprotocol.</td></tr><tr><td>Niet-contact infrarood thermometer</td><td>Etekcity</td><td>B00837ZGRY</td><td>Meten van substraattemperatuur</td></tr><tr><td>Papieren handdoeken</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>Papieren handdoeken voor het absorberen van overtollig vocht in een verpakt monster.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td>Platen afsluiten</td></tr><tr><td>PCR kleeffolie</td><td>VWR</td><td>60941-126</td><td>PCR kleeffolie</td></tr><tr><td>PCR buffer (10x)</td><td>Thomas Scientific</td><td>CB3702-7</td><td>PCR mastermix component</td></tr><tr><td>PCR platen (96-well)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1149K04</td><td>SSU en ITS2 PCR's</td></tr><tr><td>Potlood</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof lepels</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>Uitplateren van monsters</td></tr><tr><td>Platinum pick</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>Nematoden isolatie, lysis</td></tr><tr><td>Vooraf gelabelde ziplock verzamelzakken</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>Bundels van zip-lock plastic zakken vooraf gelabeld met C-label streepjescodes. Elke bundel moet 25 gestrepte zakken bevatten die met een rubberen band zijn omwikkeld.</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>3115879001</td><td>Nematoden lysis, toegevoegd aan lysis buffer vlak voor gebruik</td></tr><tr><td>R software</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>R software: Een taal en omgeving voor statistische computing https://www.R-project.org/</td></tr><tr><td>Zachte koeltas en ijspak</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>Verzamelkoelers en koelpakketten om monsters koel te houden wanneer de omgevingstemperatuur boven de 25 &deg;C ligt.</td></tr><tr><td>Reservebatterijen</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>Extra batterijen voor bemonsteringsapparatuur</td></tr><tr><td>SSU primer set</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>NIET BESCHIKBAAR</td><td>oECA1271 = voorwaartse primer TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = omgekeerde primer CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA</td></tr><tr><td>Stripbuisdoppen (12-well)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159V29</td><td>Nematoden lysis</td></tr><tr><td>Strip

een zeer schaalbare aanpak om ecologische onderzoeken van zelfrijdende caenorhabditis-nematoden uit te voeren

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

Caenorhabditis elegans is een van de belangrijkste modelorganismen in de biologie, maar pas onlangs hebben onderzoekers zich gericht op de natuurlijke ecologie. De relatieve spaarzaamheid van informatie over C. elegans in zijn natuurlijke context komt voort uit de uitdagingen die gepaard gaan met de identificatie van de kleine nematode in de natuur. Ondanks deze uitdagingen heeft een toenemende focus op de ecologie van C. elegans een schat aan nieuwe informatie veroorzaakt over zijn leven buiten het laboratorium. De geïntensiveerde zoektocht naar C. elegans in de natuur heeft bijgedragen aan de ontdekking van veel nieuwe Caenorhabditis-soorten en onthulde dat congenerische nematoden vaak in het wild samenleven, waar ze zich voeden met microbiële bloemen geassocieerd met rottend plantaardig materiaal. De identificatie van nieuwe soorten heeft ook onthuld dat het androdioecious paringssysteem van mannetjes en zelfbevruchtende hermafrodieten drie keer onafhankelijk van elkaar is geëvolueerd binnen Caenorhabditis. De andere twee zelfzuchtige soorten, C. briggsae en C. tropicalis, delen de experimentele voordelen van C. elegans en hebben vergelijkende studies mogelijk gemaakt naar de mechanistische basis van belangrijke eigenschappen, waaronder zelfbevruchting. Ondanks deze vooruitgang valt er nog veel te leren over de ecologie en natuurlijke diversiteit van deze belangrijke soorten. We missen bijvoorbeeld nog steeds functionele informatie voor veel van hun genen, die alleen kan worden bereikt door een goed begrip van hun natuurlijke ecologie. Om ecologisch onderzoek naar zelfrijdende Caenorhabditis nematoden te vergemakkelijken, ontwikkelden we een zeer schaalbare methode om nematoden uit het wild te verzamelen. Onze methode maakt gebruik van mobiele dataverzamelingsplatforms, cloudgebaseerde databases en de R-softwareomgeving om het vermogen van onderzoekers te verbeteren om nematoden uit het wild te verzamelen, bijbehorende ecologische gegevens vast te leggen en wilde nematoden te identificeren met behulp van moleculaire barcodes.

Dit protocol is gebruikt om Caenorhabditis-nematoden te verzamelen van meerdere locaties, waaronder Hawaï en Californië. Het succespercentage van de isolatie voor Caenorhabditis-nematoden varieert afhankelijk van de verzamellocatie, het klimaat, de bemonsteringservaring en de bemonsterde substraattypen. Het protocol is gebruikt om uitgebreid de Hawaiiaanse eilanden te bemonsteren, waar negen verzamelprojecten zijn uitgevoerd over meerdere jaren en seizoenen. De isolatiesuccespercentages voor zelfrijdende Caenorhabditis-soorten zijn bijna identiek voor C. briggsae (162 van de 4.506 monsters, 3,6%) en C. elegans (163 van 4.506 monsters, 3,6%), en veel lager voor C. tropicalis (26 van 4.506 monsters, 0,58%)8. Elk van de zelfrijdende soorten is verrijkt op rottende fruit- en bloemsubstraten ten opzichte van de andere substraatcategorieën. Monster rottende fruit- en bloemsubstraten als de onderzoeker probeert het slagingspercentage te maximaliseren in plaats van substraatvoorkeuren te karakteriseren. Het slagingspercentage varieert echter met de kwaliteit van het geselecteerde substraat. Onder fruit- en bloemsubstraten zullen die substraten die te droog, nat of vers zijn, bijvoorbeeld waarschijnlijk geen Caenorhabditis-nematoden opleveren.
De schaalbaarheid van dit verzamelprotocol blijkt uit het aantal collecties dat een enkel paar onderzoekers uit het wild kan verzamelen. In oktober 2018 was een paar onderzoekers die dit verzamelprotocol gebruikten bijvoorbeeld in staat om in totaal meer dan 1.000 monsters in 7 dagen te verzamelen van meerdere locaties op twee Hawaiiaanse eilanden. Dit veldteam stuurde de monsters 's nachts naar het laboratorium, waar een team van acht onderzoekers meer dan 2.000 nematoden uit de monsters isoleerde toen ze aankwamen. Een belangrijk voordeel van dit protocol is dat het de kosten in verband met bemonstering op afgelegen locaties minimaliseert door de apparatuur en het personeel dat in het veld nodig is, te verminderen. Met behulp van dit protocol kan een klein veldteam zich concentreren op bemonstering, terwijl het isolatieteam de monsters in hun thuisinstelling kan verwerken met behulp van fragiele en zware apparatuur zoals ontleedmicroscopen en agarplaten voor het isoleren van nematoden. Bovendien maakt de implementatie van de mobiele dataverzamelingsapplicatie het mogelijk om alle veldgegevens die aan de monsters zijn gekoppeld, rechtstreeks aan het C-label te koppelen, waardoor het isolatieteam onafhankelijk van het veldteam kan werken tijdens het verwerken van monsters.
Onderzoekers die dit verzamelprotocol gebruiken, moeten rekening houden met de inspanning die nodig is om nematoden te isoleren voorafgaand aan een verzamelproject. De isolatie- en identificatiestappen zijn snelheidsbeperkend en een klein verzamelteam kan isolatoren snel overweldigen met monsters. Bovendien kan de laboratoriumruimte die nodig is om veel collecties te verwerken, het lopende onderzoek verstoren (figuur 3). Bovendien vereisen sommige geïsoleerde nematoden extra inspanning om te genotyperen. Ongeveer 2% van de isolaten wordt bijvoorbeeld niet versterkt met de SSU PCR-primerset na de eerste lysispoging en moet opnieuw worden gelyseerd om ervoor te zorgen dat het lysismateriaal geschikt is voor versterking met de ITS2-primerset (figuur 8). Bovendien slaagt ongeveer 3% van de isolaten er niet in om kwaliteitssequenties te produceren na een eerste ronde van Sanger-sequencing. Voor deze isolaten is vaak een nieuwe ronde van lysis, ITS2 PCR en Sanger-sequencing vereist, wat de overdrachtstijd voor het isolatieteam kan verlengen. Belangrijk is dat sequentie-identiteit alleen niet voldoende bewijs is om een nieuwe Caenorhabditis-soort te rechtvaardigen (figuur 7). Om het verhogen van een isolaat als een nieuwe Caenorhabditis-soort goed te rechtvaardigen , moet extra inspanning worden geleverd om paringsexperimenten uit te voeren en een getypt exemplaar vast te stellen13. Een formele morfologische beschrijving van het getypte specimen heeft ook de voorkeur, maar is niet vereist3. Samen suggereren deze overwegingen dat onderzoekers die dit verzamelprotocol aannemen, baat zullen hebben bij proeftests van de isolatie- en identificatiestappen om ervoor te zorgen dat middelen correct worden toegewezen voordat een verzamelproject begint. Belangrijk is dat zelfs kleine verzamelprojecten van dit protocol kunnen profiteren, omdat het proces zeer reproduceerbaar is en de gegevens gemakkelijk kunnen worden gecontroleerd voor kwaliteitscontroledoeleinden in verschillende laboratoriumgroepen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig01.jpg"> Figuur 1: Substraatvoorbeelden. (A) In het midden van de afbeelding wordt een ideale rottende vrucht getoond (1), de vrucht is bijna onherkenbaar. Minder verrot fruit wordt in de buurt getoond; vermijd het proeven van vers gevallen vruchten (2). (B) Bovenaan wordt een ideaal afgebroken bloem weergegeven (3). Vermijd het proeven van vers gevallen bloemen (4). (C) Het donkere bladstrooisel onder de bovenste laag droge bladeren is ideaal bij het bemonsteren van caenorhabditis-nematoden (5). Vermijd het bemonsteren van droog bladstrooisel (6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig02.jpg"> Figuur 2: De mobiele applicatie Nematode Field Sampling. (A) Het eerste scherm na het openen van de Nematode Field Sampling-applicatie op een Apple-apparaat in Fulcrum. De rode pijl rechtsonder wijst naar de knop + die wordt gebruikt om een nieuwe collectierecord te maken. (B) Een voorbeeld van een nieuwe collectierecord die wordt weergegeven op een Apple-apparaat. De rode pijl wijst naar het veld 'Project' boven aan het scherm met collectierecords. Zorg ervoor dat u het juiste project selecteert bij het nemen van steekproeven in het veld. Het projectveld wordt standaard ingesteld op het laatste project dat is gebruikt bij het maken van volgende verzamelingsrecords. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig03.jpg"> Figuur 3: Verzamelzakken en verzamelplaten georganiseerd voorafgaand aan het uitzetten van monsters. Deze figuur toont de monsters in C-gelabelde verzamelzakken aan de linkerkant. Elke collectiezak heeft een bijpassend C-gelabeld bord van 10 cm erop. Aan de rechterkant zijn verzamelplaten van 10 cm die monstermateriaal bevatten nadat het uit de verzamelzakken is overgebracht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig04.jpg"> Figuur 4: Een verzamelplaat (C-plaat) met een goed overgebracht monster. Een C-plaat van 10 cm met ontbindend fruit geplaatst op de rand van het bacteriële gazon. Het C-label is bevestigd aan het plaatdeksel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig05.jpg"> Figuur 5: De mobiele applicatie Nematode isolation. (A) Het applicatieselectiescherm in de Fulcrum mobiele applicatie. De rode pijl wijst naar de toepassing Nematode Isolation . (B) Het eerste scherm na het openen van de Nematode Isolation-applicatie op een Apple-apparaat in Fulcrum. De rode pijl rechtsonder wijst naar de knop + die wordt gebruikt om een nieuwe isolatierecord te maken. (C) Een voorbeeld van een nieuwe isolatierecord die wordt weergegeven op een Apple-apparaat. De rode pijl wijst naar het veld 'Project' boven aan het isolatierecordscherm. Zorg ervoor dat u het juiste project selecteert bij het isoleren. Het projectveld wordt standaard ingesteld op het laatste project dat wordt gebruikt bij het maken van volgende isolatierecords. (D) Nadat gebruikers op het veld Selecteren onder C-label hebben getikt, tikken ze op de zoekknop (rode pijl) om het C-label te vinden waaruit ze nematoden isoleren. (E) Nadat het C-label is geselecteerd, zullen gebruikers de C-plaat fotograferen met behulp van de camera van het apparaat. (F) Gebruikers voeren dan in of er nematoden op de C-plaat zitten of niet. S-labels worden aan het isolatierecord toegevoegd als er nematoden moeten worden geïsoleerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig06.jpg"> Figuur 6: NCBI BLAST-resultatenpagina. (1) Het vervolgkeuzemenu dat wordt gebruikt om de BLAST-resultaten voor alle sequenties te bekijken. (2) De beschrijving van de huidige volgorde geselecteerd uit de vervolgkeuzelijst. In dit geval worden de resultaten voor S-label S-05554 getoond. (3) De top BLAST hit voor S-05554 wordt getoond. De paarse tekst geeft aan dat op de koppeling om deze uitlijning te visualiseren is geklikt. Zorg ervoor dat u de uitlijningen met het oog inspecteert om mogelijke nieuwe Caenorhabditis-soorten te identificeren, zie stap 9.8 hierboven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig07.jpg"> Figuur 7: Voorbeelden van NCBI BLAST-uitlijningsvisualisatie. (A) Een voorbeeld van de ITS2-queryreeks van een isolaat die is uitgelijnd met een C. kamaaina-onderwerpsequentie . (1) De procentuele identiteit van de uitlijning (89%), wat laag is voor een top BLAST-hit. (2) Een mismatch tussen de query en de onderwerpvolgorde (G tot en met A). (3) Een opening van vier basenparen in de onderwerpsequentie gemaakt door het uitlijningsalgoritme; hiaten in de query of het onderwerp duiden op een slechte uitlijning. (4) Een gegeneraliseerd gebied in het midden van de uitlijning met veel mismatches en hiaten. Een regio als deze suggereert dat de querysequentie afkomstig kan zijn van een nieuwe Caenorhabditis-soort . Getoond is een actueel uitlijningsvoorbeeld van een nieuwe soort, C. oiwi, die in 2017 werd ontdekt. (B) Een voorbeeld van een goede afstemming tussen de ITS2-queryreeks van een isolaat en een onderwerpsequentie. (5) De procentuele identiteit van de uitlijning (99%), wat meestal betekent dat de querysequentie afkomstig is van een isolaat van dezelfde soort als het onderwerp. (6) Een centraal gebied van de afstemming met perfecte identiteit. Een gebied als dit suggereert dat de query isolaat waarschijnlijk dezelfde soort is als het onderwerp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63486/63486fig08.jpg"> Figuur 8: SSU- en ITS2 PCR-producten. De bovenste gel toont PCR-producten die zijn gegenereerd met de SSU-primerset voor 12 representatieve monsters. Links is als referentie een DNA-ladder opgenomen. De SSU PCR producten voor Caenorhabditis nematoden zijn ongeveer 500 bp lang. Monsters 2-12 versterkt met de SSU primer set, maar monster één niet. De afwezigheid van een 500 bp SSU-amplicon voor monster één suggereert dat het lysismateriaal van slechte kwaliteit was en dat het monster opnieuw moet worden gelyseerd. De onderste gel toont PCR-producten die zijn gegenereerd met de ITS2-primerset voor dezelfde 12 monsters die in de bovenste gel worden weergegeven. De ladder en monsters staan voor beide gels in dezelfde richting. Zes van de 12 samples werden niet versterkt met de ITS2 primer set. De monsters met SSU- en ITS2-banden zijn Sanger-gesequenced en geïdentificeerd door sequentieovereenkomst met behulp van het NCBI BLAST-algoritme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/63486fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullend bestand 1: C-labels. Een PDF-bestand met 2500 unieke C-labels. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/C-labels.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 2: S-labels. Een PDF-bestand met 5000 unieke S-labels. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/S-labels.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 1: Veldmaterialen. Een paklijst van materialen die in het veld worden gebruikt om nematoden te bemonsteren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 2: PCR-recepten en thermocyclercondities. Een tabel met PCR-recepten en thermocyclercondities voor de ITS2- en SSU-PCR's. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_2.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 3: Elektroforese bufferrecepten. Een recept voor 0,5 M pH 8,0 Ethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (EDTA) en de TRIS-acetaat-EDTA (TAE) bufferoplossing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63486/Supplemental_Table_3.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Dit protocol kan worden gebruikt om grootschalige ecologische onderzoeken uit te voeren van zelfrijdende Caenorhabditis-nematoden . Het belangrijkste voordeel van deze methode is de efficiënte organisatie en analyse van ecologische en moleculaire gegevens die verband houden met de nematoden die uit de natuur zijn verzameld.

Een zeer schaalbare aanpak om ecologische onderzoeken van zelfrijdende Caenorhabditis-nematoden uit te voeren

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative ...

Dit protocol kan worden gebruikt om de isolatie en identificatie van Caenorhabditis-nematoden uit de natuur te stroomlijnen en belangrijke ecologische en milieugegevens vast te leggen die verband houden met de natuurlijke omgeving van de nematoden. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de schaalbaarheid en nauwkeurigheid, die mogelijk worden gemaakt door gebruik te maken van mobiele dataverzamelingsplatforms, cloudgebaseerde databases en gestandaardiseerde gegevensverwerkingsfuncties. Identificeer om te beginnen een locatie om Caenorhabditis-nematoden te onderzoeken.Om een Fulcrum-project aan te maken, maakt u online een account aan bij Fulcrum met behulp van een gratis educatieve overeenkomst en voegt u de toepassing voor veldbemonstering van nematoden toe. Voeg vervolgens de nematode-isolatietoepassing toe. Druk een set QR-codelabels af als C-labels om de collecties te volgen en S-labels om de nematode-isolaties te volgen.Bevestig de C-labels aan ziploc plastic zakken voor verpakking. Bewaar de set S-labels voor gebruik in het laboratorium. Selecteer de bemonstering van het aaltjesveld in het vervolgkeuzemenu van de mobiele Fulcrum-app en druk op plus om een nieuwe record in het project te starten.Maak een foto van het substraat. Tik op het veld C-Label en kies scannen. Scan de streepjescode op de verzameltas met de camera van het mobiele apparaat en tik vervolgens op Gereed.Tik op het substraatveld en selecteer een substraattype. Meet de oppervlaktetemperatuur van het substraat met de contactloze thermometer en noteer de waarde in het substraattemperatuurveld. Meet en registreer ook de omgevingstemperatuur en luchtvochtigheid.Opslaan en opnemen in Fulcrum door linksboven in het scherm op opslaan te tikken. Verzamel een eetlepel van het substraat zonder stokjes of andere harde stukken door de verzamelzak om te keren als een handschoen om het substraat op te pakken en sluit de zak vervolgens af. Noteer voor elke Ziploc-zak het C-label op de zak en bevestig een bijpassend C-label aan het deksel van een plaat van 10 centimeter die is gespot met OP50-bacteriën.Breng een eetlepel monster van elke verzamelzak over op de C-platen met behulp van een schone plastic lepel. Kies in de fulcrum-toepassing nematode-isolatie in het toepassingsmenu. Maak vervolgens een nieuwe isolatierecord door op het pluspictogram rechtsonder te tikken.Tik op de selectieknop om het C-label te vinden dat aan een monster is gekoppeld. Tik op het zoekpictogram. Tik vervolgens op het scanpictogram om de C-Label QR-code te scannen.Zoek naar nematoden op de C-plaat met een ontleedmicroscoop. Tik op de wormen op het monsterveld om de aanwezigheid van nematoden op het monster te registreren. Als er geen nematoden aanwezig zijn, parafilm dan de C-plaat en gooi deze weg in een biohazard bak.Als er nematoden aanwezig zijn, isoleer dan maximaal vijf nematoden uit de C-plaat en breng elk over op zijn eigen S-plaat. Tik vervolgens op het veld met S-gelabelde platen om de S-plaat in te voeren die voor deze isolatie wordt gebruikt. Tik op de plus rechtsonder.Tik op S-Label en klik vervolgens op scannen om de camera van het apparaat te openen en scan vervolgens de S-Label QR-code op de S-plaat. Tik op de opslagknop rechtsboven zodra alle informatie correct is toegevoegd aan het isolatierecord, parafilm vervolgens de S-S-platen met geïsoleerde nematoden en zet ze opzij in een gebied dat is aangewezen om S-platen met nematoden te houden. Meld u aan bij de Fulcrum-website en selecteer de toepassing voor nematode-isolatie.Klik op exporteren om een zip-bestand te downloaden dat de nematode-isolatie s_labeled_plates bevat. csv-bestand. Navigeer naar de wild isolaat genotypering sjabloon Google Sheet en kopieer de Google Sheet.Plaats de S-Labels gekopieerd van de nematode isolatie s_labeled_plates. csv-kolom in het genotyperingsblad. Controleer 48 uur na isolatie op woekerende dieren op S-platen.Als een S-plaat woekerende dieren heeft, voert u er een in de kolom proliferatie 48 in het genotyperingsvel in en verplaatst u de S-plaat naar een doos met het label 48 uur proliferatiedoos één. Controleer de S-platen die zich 48 uur na isolatie niet verspreidden na 168 uur na isolatie opnieuw. Als een S-plaat zich nu vermenigvuldigt, voert u er een in de kolom proliferatie 168 op het genotyperingsvel in en verplaatst u de S-plaat naar een doos met het label 168 uur proliferatievak één.Filter het genotype in Google Spreadsheet om alleen de S-labels op te nemen in één proliferatievak dat moet worden gelyseerd en selecteer vervolgens de kolommen S-Label via lysis-knooppunten. Druk een lysis-werkblad af voor elke proliferatiedoos die moet worden gelyseerd. Bereid 12 buisjes voor op de te lyseren monsters.Maak één stripbuis los en voeg acht microliter lysisbuffer toe aan elke dop met een repeat pipetter. Kies drie tot vijf dieren uit de bronplaten in de dopposities die op het lysis-werkblad worden aangegeven. Herhaal dit gedurende maximaal acht stripbuizen en plaats de stripbuizen in de vriezer van min 80 graden Celsius.Verwijder de sets stripbuizen en voer het lysisprogramma uit in de thermocycler. Bewaar de lysaten vervolgens maximaal een week bij min 80 graden Celsius. Haal de stripbuizen uit de vriezer van min 80 graden Celsius en ontdooi het lysismateriaal op ijs.Terwijl het lysismateriaal ontdooit, bereidt u ITS2- en SSU-mastermixen in afzonderlijke buizen op ijs. Voeg twee microliter lysaat toe aan de juiste put in de PCR-plaat met een meerkanaalspipet met een laag volume. Voer de PCR's uit met het juiste thermocyclerprogramma en noteer welke S-Labels ITS2- of SSU PCR-producten opleveren in het genotyperingsblad.Gebruik voor elk monster dat ITS2-positief is het resterende ITS2 PCR-product voor Sanger-sequencing en verkrijg de seq-uitvoerbestanden voor elk S-Label van het sequencingplatform. Navigeer naar de NBCI BLAST-website in een webbrowser om de BLAST-zoekopdracht te starten. Voor S-plaatsequenties die BLAST naar een Caenorhabditis-soort knallen, voert u de volledige geslachts- en soortnaam van de top BLAST-hit in de kolom species ID in.Geef de stammen een unieke naam, volgens de nomenclatuurconventies van Caenorhabditis en voer de stamnamen in de kolom stamnaam in. Om de gegevens te verwerken, navigeert u naar de Fulcrum-website en exporteert u de onbewerkte projectgegevens uit de Fulcrum-database. Open een nieuw R-script en volg de aanwijzingen in het easyfulcrum-vignet om de verzamelgegevens te verwerken.In NBCI BLAST laten de resultaten voor S-Label S-05554 zien dat de tophit Caenorhabditis briggsae is. Bovendien vereisen sommige geïsoleerde nematoden extra inspanning om te genotyperen. Ongeveer 2% van de isolaten wordt bijvoorbeeld niet versterkt met de SSU PCR-primerset na de eerste lysispoging en moet worden vertrouwd om ervoor te zorgen dat het lysismateriaal geschikt is voor versterking met de ITS2-primerset.Na deze procedure kunnen onderzoekers de ecologische en milieugegevens verkennen die verband houden met isolaten van wilde nematoden om locaties en substraatkenmerken te identificeren die het meest waarschijnlijk specifieke nematodensoorten herbergen.

a-highly-scalable-approach-to-perform-ecological-surveys-selfing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video laten we een methode zien om een ontwikkelingsgesynchronleerde populatie steriele volwassen C. elegans teproduceren. Het voorbeeldprotocol synchroniseert wormen om zuurstofverbruik bij levende dieren te bestuderen.

Nematodensynchronisatie: een methode om populaties wormen in identieke stadia van ontwikkeling te verkrijgen

We presenteren een gedragsopname-opstelling en protocol waarmee geautomatiseerde analyse van de nematode, Caenorhabditis elegans , de voorkeur geeft aan oplosbare verbindingen in een populatie gebaseerde assay. Dit artikel beschrijft de constructie van een gedragskamer, het gedragsprotocol en het gebruik van videoanalyse software.

Geautomatiseerde Analyse van een Chemische Sensorische Preference Assay van een Nematodebevolking

Het huidige protocol bevat een methode voor het sorteren en het schoonmaken van leeftijd-matched populaties van Caenorhabditis elegans. Het gebruikt een eenvoudig, goedkoop, en efficiënt instrument is op maat te verkrijgen een grote experimentele populatie van nematoden voor onderzoek.

Caenorhabditis Zeef: Een Low-tech Instrument en methodologie voor het sorteren van kleine meercellige organismen

We beschrijven de protocollen voor het gebruik van het brede veld-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), waarmee de fenotypische karakterisering van de high-throughput van grote populaties van Caenorhabditis elegans. Deze protocollen kunnen worden gebruikt voor subtiele gedragsveranderingen in gemuteerde stammen of in reactie op farmacologische behandeling in een uiterst schaalbaar mode karakteriseren.

Geautomatiseerde Behavioral analyse van grote C. elegans populaties met behulp van een breed veld-of-view Tracking Platform

Om Caenorhabditis elegans (C. elegans) te gebruiken in omics-onderzoek, is een methode nodig om grote populaties wormen te genereren waar een enkel monster kan worden gemeten op verschillende platforms voor vergelijkende analyses. Hier wordt een methode gepresenteerd om C. eleganspopulaties op grootschalige cultuurplaten (LSCPs) te culteren en de bevolkingsgroei te documenteren.

Cultuur en assay van grootschalige gemengde caenorhabditis elegans populaties

Wilde Caenorhabditis-nematoden worden geassocieerd met veel microben, vaak in het darmlumen of infecteren de darm. Dit protocol beschrijft een methode om niet-tecultureerbare microben te verrijken die de darm koloniseren, gebruikmakend van de weerstand van de dauer cuticula.

Selectieve reiniging van wilde caenorhabditis nematoden om te verrijken voor intestinale microbioombacteriën

Dit protocol schetst een methode voor het efficiënt extraheren van levende nematoden uit natuurlijke substraten in het veld.

Snelle isolatie van wilde nematoden door Baermann Funnel

Darmmicroben kunnen de gezondheid van hun gastheer positief of negatief beïnvloeden via specifieke of geconserveerde mechanismen. Caenorhabditis elegans is een handig platform om te screenen op dergelijke microben. Het huidige protocol beschrijft high-throughput screening van 48 bacteriële isolaten op impact op nematodenstressresistentie, gebruikt als proxy voor de gezondheid van wormen.

High-Throughput screening van microbiële isolaten met impact op caenorhabditis elegans gezondheid

Dit protocol beschrijft een 96-well verstoring van individuele bacterieel gekoloniseerde Caenorhabditis elegans na koude verlamming en oppervlaktebleking om externe bacteriën te verwijderen. De resulterende suspensie wordt op agarplaten geplaatst om nauwkeurige kwantificering van bacteriële belasting in grote aantallen individuele wormen mogelijk te maken.

Gegevens met één worm gebruiken om heterogeniteit in caenorhabditis elegans-bacteriële interacties te kwantificeren

Caenorhabditis elegans dienen als een uitstekend modelsysteem met robuuste en goedkope methoden voor het onderzoeken van de gezondheid, levensduur en veerkracht tegen stress.

Onderzoek naar goedkope methoden om levensduur en gezondheid te meten in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is een krachtig model om de moleculaire determinanten te onderzoeken die de interacties tussen gastheer en microbioom aansturen. We presenteren een pijplijn met hoge doorvoer die de niveaus van darmmicrobioomkolonisatie bij één dier profileert, samen met belangrijke aspecten van de fysiologie van C. elegans.

Toepassing van flowvermimetrie voor kwantificering en analyse van het darmmicrobioom van Caenorhabditis elegans

Leer een schaalbare methode voor ecologisch onderzoek van Caenorhabditis-nematoden met mobiele datacollectie en cloudtechnologie. Deze aanpak verbetert de nauwkeurigheid en toegankelijkheid van veldgegevens.

Een zeer schaalbare aanpak om ecologische onderzoeken van zelfrijdende Caenorhabditis-nematoden uit te voeren

Meer video's verkennen