Isolatie en karakterisering van de immuuncellen van micro-ontleedde muischoroïde plexussen

Dit protocol kan nuttig zijn voor het beantwoorden van vragen over de rol van de choroïde plexussen en perifere immuuncellen bij de regulatie van de hersenen in verschillende contexten in muismodellen. Dit protocol maakt een diepgaande kwantitatieve en kwalitatieve analyse mogelijk van de unieke immuuncelpopulaties in de choroïde plexussen van muizen. Dissectie van de choroïde plexussen kan in het begin moeilijk zijn vanwege hun kleine formaat en transparante kleur.

We raden aan om eerst te oefenen op niet-doordrenkte dieren. Plaats om te beginnen de hersenen ontleed van een C57 zwarte zes muis dorsale kant naar boven in een petrischaal en plaats de schaal onder de doelen van de binoculaire lussen. Terwijl u de hersenen op hun plaats houdt met behulp van een tang, brengt u de twee uiteinden van een ander paar tangen door de middellijn tussen de hemisferen naar beneden.

Trek met behulp van de tang de cortex met het callosum en de hippocampus weg van het septum, waardoor de laterale ventrikel en een deel van de derde ventrikel worden blootgesteld. Identificeer de laterale choroïde plexus als een lange sluier die de laterale ventrikel bekleedt en aan beide uiteinden affakkelt. Gebruik vervolgens twee uiteinden van een dunne tang en verzamel de laterale plexus choroideus.

Wees voorzichtig met het verzamelen van het driehoekige achterste deel verborgen door de achterste plooi van de hippocampus. Trek vervolgens de cortex met het corpus callosum en de hippocampus van de contralaterale hemisfeer weg van het septum om het hele derde ventrikel en de tegenovergestelde laterale ventrikel bloot te leggen. Gebruik een fijne tang om de derde plexus choroïde te verzamelen die is geïdentificeerd als een korte structuur met een korrelig oppervlakteaspect.

Verzamel vervolgens de andere laterale choroïde plexus. Breng vervolgens de twee uiteinden van de tang naar beneden tussen het cerebellum en de middenhersenen en maak het cerebellum los van de pons en medulla om het vierde ventrikel bloot te leggen. Identificeer vervolgens de vierde plexus choroideus als een lange bolvormige structuur met een korrelig oppervlakteaspect dat de vierde ventrikel van het laterale rechtereinde naar het linkereinde tussen het cerebellum en medulla bekleedt.

Gebruik een fijne tang om de vierde plexus choroïde te verzamelen. Na het incuberen van alle verzamelde choroïde plexussen met collagenase IV, pipetteer voorzichtig op en neer ongeveer 10 keer om de dissociatie te voltooien. Vul vervolgens de buis tot 1,5 milliliter met MACS-buffer om de collagenase IV-activiteit te stoppen.

Centrifugeer vervolgens de cellen en gooi het supernatant weg voordat u de cellen wast met 1,5 milliliter MACS-buffer. Na het toevoegen van de juiste compensatieparels en antilichaamoplossingen, incubeer je de monsters gedurende 30 tot 45 minuten op ijs en bescherm je ze tegen blootstelling aan licht. Vul vervolgens de buizen met 1,5 milliliter MACS-buffer en centrifugeer de cellen en compensatieparels.

Na het resuspenderen van de cellen en compensatieparels in 500 microliter MACS-buffer, filtert u de cellen door een zeef van 70 micron. Nadat u de flowcytometer en de software hebt ingeschakeld, selecteert u het voorwaartse spreidingsgebied versus het zijverstrooiingsgebied en de poort voor cellen op basis van grootte. Maak vervolgens een dochterpoort voor afzonderlijke cellen met voorwaartse spreidingsgebied versus voorwaartse strooihoogte.

Maak vervolgens een dochterpoort voor levende cellen met DAPI versus voorwaarts verstrooiingsgebied om de DAPI-positieve cellen uit te sluiten. Maak vervolgens een dochterpoort voor CD45-positieve immuuncellen met CD45 versus voorwaarts verstrooiingsgebied. Maak nu een dochterpoort van de CD45-positieve cellen en selecteer F480 versus CD11b om de CD11b-positieve F480-positieve en de CD11b-positieve F480-negatieve populaties te identificeren.

Maak vervolgens een dochterpoort voor CD11b-positieve F480-positieve cellen en selecteer CX3CR1 versus IA-IE om zowel CX3CR1-positieve IA-IE-positieve grensgeassocieerde macrofagen als CX3CR1-positieve IA-IE-negatieve macrofagen te identificeren. Maak vervolgens een dochterpoort voor CD11b positieve F480 positieve CX3CR1 positieve IA-IE negatieve macrofagen en selecteer F480 versus CD11b om zowel de CD11b hoge F480 intermediaire CX3CR1 positieve IA-IE negatieve Kolmer's epiplexus macrofagen als de CD11b positieve F480 hoge CX3CR1 positieve IA-IE negatieve grensgeassocieerde macrofagen te identificeren. Dan van de CD11b positieve F480 negatieve populatie, poort voor Ly6C versus IA-IE.

Selecteer zowel IA-IE positieve Ly6C negatieve populatie als IA-IE negatieve Ly6C positieve cellen die voornamelijk overeenkomen met monocyten of neutrofielen. Maak ten slotte een dochterpoort voor CD11b positieve F480 negatieve IA-IE positieve Ly6C negatieve populatie en selecteer CD11b versus CX3CR1. Identificeer vervolgens zowel CD11b hoge CX3CR1 lage als CD11b positieve CX3CR1 negatieve populaties.

Voor T-cell gating, na het uitsluiten van de DAPI-positieve cellen zoals eerder beschreven, maak een dochterpoort voor CD45 positieve immuuncellen met CD45 versus FSC-A, maak vervolgens een dochterpoort van de CD45-positieve cellen en selecteer TCR beta versus CD11b. Sluit de CD11b-positieve myeloïdecellen uit en selecteer de TCR-positieve CD11b-negatieve T-celpopulatie. Maak ten slotte een dochterpoort voor de TCR bètapositieve CD11b-negatieve populatie en selecteer CD4 versus CD8a.

Identificeer zowel CD8 negatieve als CD4 positieve T-cellen en CD8 positieve CD4 negatieve T-cellen. De hier gedemonstreerde flowcytometrie-analyses onthulden met succes belangrijke subsets van myeloïde en T-cellen en hun relatieve totale aantal per muis op een zeer reproduceerbare manier. Flowcytometrie-analyse van de myeloïde cellen toont aan dat de choroïde plexus wordt bevolkt door CD11b-positieve CX3CR1-positieve F480-hoge grensgeassocieerde macrofagen, die 80% van de CD45-positieve immuuncellen aan de choroïde plexus vertegenwoordigen.

De CD11b hoge F480 intermediaire CX3CR1 positieve IA-IE negatieve populatie van Kolmer's epiplexus macrofagen werd ook geïdentificeerd. Onder de CD11b-positieve F480-negatieve immuuncellen werden twee verschillende populaties van Ly6C-negatieve IA-IE-positieve cellen gekarakteriseerd en komen waarschijnlijk overeen met dendritische cellen. De analyse en gating strategie van T-cellen benadrukte de aanwezigheid van de kleine populatie van CD45 positieve CD11b negatieve TCR bèta positieve cellen.

Onder hen bevolkten ongeveer 30-50 CD8 negatieve CD4-positieve en CD8-positieve CD4-negatieve T-cellen per muis de choroïde plexus onder fysiologische omstandigheden. Het is belangrijk om de kwaliteit van de perfusie te controleren, omdat elke bloedverontreiniging de immuunsamenstelling van de plexus choroideus kan vervagen. Deze methode kan worden gevolgd door het sorteren van geselecteerde celpopulaties voor verdere analyse, zoals bulk- of eencellige RNA-sequencing.