Name: Onderzoek naar biomoleculaire interactie tussen de moleculaire chaperonne Hsp90 en zijn clienteiwit kinase Cdc37 met behulp van field-effect biosensing-technologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Leer de interactie tussen het moleculaire chaperon Hsp90 en het kinase Cdc37 met behulp van field-effect biosensing-technologie. Deze labelvrije methode biedt snelle en accurate metingen voor farmaceutisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van de Binational Science Foundation (BSF) aan S.K.S. en N.Q.

OPMERKING: De recombinante eiwitten die in deze studie werden gebruikt, Hsp90 en Cdc37, werden commercieel verkregen (zie Tabel met materialen).
1. Chip activering
OPMERKING: Alle materialen die in het experiment moeten worden gebruikt, worden vermeld in de tabel met materialen. Filtreer alle bereide oplossingen door een steriel filter van 0,2 μm.
<ol><li>Bereid 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide (EDC) oplossing door 2 mg EDC toe te voegen aan 2,5 ml 1 M 2-(N-morfolino) ethaansulfonzuur (MES) buffer (pH = 6,0) in een buis van 15 ml. Bereid N-Hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS)-oplossingen door 6 mg sulfo-NHS toe te voegen aan 2,5 ml MES-buffer van 1 M (pH = 6,0) in een afzonderlijke buis van 15 ml. Vul 50 μL van elke oplossing in onafhankelijke buizen en bewaar bij -20 °C voor toekomstig gebruik.</li>
	<li>Meng gelijke volumes EDC-zandsulfosfo-NHS-oplossing (50 μL EDC + 50 μL sulfo-NHS) door op en neer te pipetteren (geen vortex gebruiken). OPMERKING: De gemengde oplossing van EDC/sulfo-NHS moet binnen 30 minuten worden gebruikt om effectieve cross-linking te behouden voor een goede chipfunctionalisatie.</li>
	<li>Plaats de door het bedrijf geleverde biosensorchip (5,7 cm x 2,4 cm; zie Materialentabel) in een glazen petrischaaltje met deksel. Alle functionalisatiestappen die betrokken zijn bij chipactivering worden voorgesteld om in de petrischaal te worden uitgevoerd. Breng 50 μL van 1 M MES-buffer (pH = 6,0) aan op de biosensorchip, incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en zuig vervolgens de buffer op.</li>
	<li>Breng onmiddellijk 50 μL EDC/sulfo-NHS-oplossing aan op de sensorchip. Dek de petrischaal af en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Zuig EDC/sulfo-NHS-oplossing uit de chip.</li>
	<li>Spoel de chip eenmaal af met 50 μL van 1 M MES-buffer (pH = 6,0); de MES-buffer opzuigen.</li>
</ol>2. Doel eiwit immobilisatie
<ol><li>Spoel de chip 2x af met 50 μL van 1x PBS (pH = 7,4). Zuig de PBS uit de chip en voeg het doelmolecuul Hsp90 (50 μL; 500 nM) toe. OPMERKING: Buffermismatch kan het hele experiment verpesten; daarom is het belangrijk om vóór het experiment ervoor te zorgen dat het doelmolecuul zich in dezelfde buffer bevindt als die welke wordt gebruikt voor kalibratie (bijv. 1x PBS (pH = 7,4)). Voer indien nodig een bufferuitwisseling uit door nachtelijke dialyse vóór het experiment. In dit experiment werd nachtelijke dialyse uitgevoerd voor beide recombinante eiwitten, Hsp90 en Cdc37, tegen 1x PBS (pH = 7,4; zie Tabel met materialen) met een goede bufferuitwisseling bij 4 °C. De concentratie van het doelmateriaal (Hsp90 in dit geval) kan variëren afhankelijk van verschillende experimentele protocollen en de aard van doelmaterialen (eiwit/peptide/liganden).</li>
	<li>Dek de glazen petrischaal af en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Zuig de oplossing met het doelmolecuul op en spoel 3x met 50 μL 1x PBS (pH = 7,4). Zuig de 1x PBS (pH = 7,4) oplossing uit de chip.</li>
	<li>Voeg 50 μL Quench 1 (3,9 mM amino-PEG5-alcohol in 1x PBS (pH = 7,4)) oplossing toe aan de chip. Dek de glazen petrischaal af en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Zuig de Quench 1-oplossing uit de chip.</li>
	<li>Voeg 50 μL Quench 2 (1 M ethanolamine (pH = 8,5)) oplossing toe aan de chip. Dek de glazen petrischaal af en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Zuig Quench 2-oplossing uit de chip en spoel de chip 5x met 50 μL 1x PBS, waarbij de laatste PBS-druppel op de sensor achterblijft.</li>
</ol>3. Voorbereiding van analytmonsters
<ol><li>Bereid analytverdunningsreeksen voor Cdc37 voor in het gewenste concentratiebereik. Voor het eerste experiment werden de volgende concentraties gebruikt: 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1.000 nM, 2.000 nM, 3.000 nM en 5.000 nM. Voor het tweede experiment werd een andere set concentraties gebruikt, variërend van 0,4 nM tot 200 nM.</li>
	<li>Ontwerp het experiment om ten minste acht verschillende analytconcentraties op te nemen om een betrouwbare KD-waarde te verkrijgen. bereid de verschillende verdunningen van het analyte-eiwit in dezelfde buffer als die welke wordt gebruikt voor kalibratie en doeleiwit; hier is het 1x PBS (pH = 7,4).</li>
</ol>4. Laden van de geactiveerde biosensorchip in het FEB-apparaat
OPMERKING: Het FEB-apparaat bestaat uit een lezer met LED-lichtindicaties en een cartridge om de biosensorchip in te brengen.
<ol><li>Na doeleiwitimmobilisatie plaatst u de geactiveerde chip in de cartridge van het apparaat, die via USB op een computer is aangesloten. Na het inbrengen van de chip wordt een groen LED-lampje op de lezer weergegeven dat aangeeft dat het FEB-apparaat klaar is voor het experiment. Installeer de geautomatiseerde software (zie Materiaaltabel) die door het bedrijf wordt geleverd op de computer waarop het FEB-apparaat is aangesloten, om het experiment stap voor stap te volgen zoals hieronder beschreven.</li>
</ol>5. Voer het experiment uit
<ol><li>Druk op de module Experiment uitvoeren op de geautomatiseerde software en kies 10 punten met regeneratie of een ander gewenst protocol. Vul de volgende gegevens in: naam van de operator, naam van het experiment, datum (bijv. Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); regeneratiebuffer (bijv. PBS-buffer); geïmmobiliseerd doel (bijv. Hsp90); analyt in oplossing (bijv. Cdc37). Zie aanvullende figuur S1 voor nadere bijzonderheden.</li>
	<li>Druk op de knop Experiment starten die in de software wordt weergegeven en volg de instructies die door de geautomatiseerde software worden weergegeven zoals hieronder beschreven. OPMERKING: De software is volledig geautomatiseerd, gebruiksvriendelijk en begeleidt de gebruiker stap voor stap tijdens het experiment. Er verschijnt een pop-upvenster op het scherm met instructies om verder te gaan bij elke stap van het experiment. De software geeft instructies voor elke repetitieve stap achtereenvolgens van kalibratie, analytassociatie, dissociatie, regeneratie en wassen (5x) voor elke analytconcentratie gedurende het experiment.</li>
	<li>Voer instrumentkalibratie uit. Zuig hiervoor de resterende PBS-oplossing uit de chip en breng 50 μL kalibratiebuffer aan (1x PBS; pH = 7,4). Druk op de knop Doorgaan en wacht 5 minuten totdat de kalibratiestap is voltooid. De software geeft het eindpunt weer dat is bepaald voor de kalibratiestap (5 min) met een waarschuwingsalarm voor follow-up.</li>
	<li>Voer vervolgens een analytassociatie uit. Om dit te doen, zuigt u de kalibratiebuffer uit de chip en past u 50 μL van de laagste analytconcentratie (25 nM Cdc37) toe. Druk op de knop Doorgaan en wacht 5 minuten totdat de koppelingsstap is voltooid. De software toont het eindpunt voor de koppelingsstap (5 min) met een waarschuwingsalarm om door te gaan.</li>
	<li>Voer een analytdissociatie uit. Om dit te doen, zuigt u de analytoplossing uit de chip en brengt u 50 μL van de dissociatiebuffer aan (1x PBS; pH = 7,4). Druk op de knop Doorgaan en wacht 5 minuten totdat de duur van de dissociatiestap (5 min) is voltooid. De software toont het eindpunt voor de dissociatiestap (5 min) met een waarschuwingsalarm voor follow-up.</li>
	<li>Voer vervolgens chipregeneratie uit. Zuig de dissociatieoplossing van de chip aan en breng 50 μL regeneratiebuffer aan (1x PBS; pH = 7,4). Druk op de knop Doorgaan en wacht 30 s totdat de duur van de regeneratiestap (30 s) is voltooid. De software toont het eindpunt voor de regeneratiestap (30 s) met een waarschuwingsalarm voor follow-up.</li>
	<li>Was ten slotte de chip. Zuig de regeneratieoplossing uit de chip en breng 50 μL wasbuffer (1x PBS; pH = 7,4) aan op de chip. Zuig de oplossing uit de chip en herhaal dit 5x. Laat de laatste druppel wasbuffer op de chip zitten en druk op de knop Doorgaan en wacht 30 s totdat de duur van de wasstap is voltooid in het softwaredisplay. OPMERKING: De software geeft het eindpunt voor de wasstap (30 s) weer met een waarschuwingsalarm om door te gaan met de volgende cyclus van het experiment.</li>
	<li>Herhaal de stappen voor elke gebruikte analytconcentratie; de vijf stappen van kalibratie, analytassociatie, dissociatie, regeneratie en wassen (5x) vormen één cyclus. Voor het hier getoonde experiment voerden we 10 cycli uit voor 10 analytconcentraties (variërend van 25 nM tot 5.000 nM of 0,4 nM tot 200 nM; Figuur 2).</li>
</ol>6. Analyse
<ol><li>Druk op de knop Analyse boven aan de geautomatiseerde analysesoftware aan het einde van het experiment. Er verschijnt een weergavevenster met alle experimentele punten. Controleer in het venster of de analytconcentraties die voor het voorgeschreven protocol worden gebruikt, correct zijn.</li>
	<li>Druk op de knop Analyse uitvoeren om deKD-waarde automatisch te genereren. De software genereert een Hill fit plot door de analytconcentraties uit te zetten tegen de overeenkomstige I-Responsen waaruit de dissociatieconstante bij evenwicht, KD-waarde , wordt berekend.</li>
	<li>Exporteer de onbewerkte gegevens voor analyse in andere statistische analysesoftware met behulp van de gegevensbeoordelings- / exportsoftware zoals hieronder beschreven.<ol>
<li>Kopieer het R1R-bestand dat automatisch aan het einde van het experiment is gemaakt (bijvoorbeeld Hsp90 + Cdc37 14.03.2021) naar een nieuwe map op het bureaublad. Open de door het bedrijf geleverde software voor gegevensbeoordeling/-export (zie aanvullende figuur S2A).</li>
		<li>Klik op Gegevensverwerking > R1R-bestanden verwerken > OK op het startscherm van de software voor gegevensbeoordeling / -export.</li>
		<li>Selecteer de map met R1R-bestanden die in stap 6.3.1 op het bureaublad zijn gemaakt. en druk op de knop OK . Hiermee wordt een kopie van de oorspronkelijke R1R-gegevens gemaakt om de gegevens te bekijken en te bewerken zonder het oorspronkelijke bestand te overschrijven.</li>
		<li>Druk op het pictogram voor gegevensverwerking dat te zien is op het startscherm van de software voor gegevensbeoordeling/-export. Druk op Load Processed R1R Files > OK. Selecteer dezelfde map die is gemaakt in stap 6.3.1 met verwerkte R1R-bestanden. Druk op OK. Bij deze stap is de map met de experimentbestanden klaar om te worden gecontroleerd.</li>
		<li>Druk in het startscherm van software voor gegevensbeoordeling/-export op Gegevensanalyse. Selecteer Kalibratie > bewerkte R1R-bestanden kalibreren > OK (zie Aanvullende figuur S2B). Deze stap kalibreert alle gegevenspunten volgens de eerste kalibratiestap om een basislijn te maken.</li>
		<li>Druk in het startscherm van software voor gegevensbeoordeling/-export op Gegevensanalyse. Selecteer R1R-bestanden controleren en bewerken > OK. Controleer de gegevenspunten, verwijder punten of voeg stappen toe met de knop Verwijderen/Stap toevoegen . Zorg ervoor dat alle stappen zich op de juiste plaats bevinden, bijvoorbeeld de kalibratiestap bevindt zich op de basislijn, de koppelingsstap bevindt zich op de piek (zie Aanvullende afbeelding S3) en druk vervolgens op de knop Opslaan om alle aangebrachte wijzigingen op te slaan.</li>
		<li>Druk in het startscherm van software voor gegevensbeoordeling/-export op Gegevensanalyse. Selecteer Gegevens analyseren/plotten, kies de stappen die u wilt exporteren (zie Aanvullende afbeelding S4). Voeg elke koppelingsstap (bijvoorbeeld stap 2, stap 7, enzovoort) toe nadat u de kalibratiestap (bijvoorbeeld stap 1, stap 6, enzovoort) hebt afgetrokken van de exportlijst voordat u de gegevens exporteert.</li>
		<li>Druk op Deze gegevens exporteren. De software genereert een spreadsheetbestand met de I-respons voor elk analytconcentratiegegevenspunt van elke transistor (als alle transistors werken, hebben we drie verschillende I-responswaarden voor elk concentratiepunt). Gebruik dit spreadsheetbestand om de gegevens in de statistische software verder te analyseren.</li>
	</ol></li>
	<li>Open de statistische analysesoftware. Maak een XY-tabel met drie Y-waarden; druk op Maken. De gegevens voor deze tabel (X-, Y-waarden) worden gekopieerd uit het spreadsheetbestand dat is gemaakt in stap 6.3.8. De x-as komt overeen met de analytconcentratie (afhankelijk van de gebruikte concentratie) en de drie Y-waarden komen overeen met de I-responsen, verkregen uit de door het bedrijf geleverde Data Review/Export-software .</li>
	<li>Druk op Deze gegevens analyseren. Kies XY-analyses > niet-lineaire regressie (curve fit) > bindingsverzadiging > één site > totaal. De software analyseert automatisch de gegevens, genereert de KD-waarde en maakt een grafiek van de gegevenspunten.</li>
</ol>

<ol><li>Tuncbag, N., Gursoy, A., Guney, E., Nussinov, R., Keskin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architectures+and+functional+coverage+of+protein-protein+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Architectures and functional coverage of protein-protein interfaces.</a> Journal of Molecular Biology. 381 (3), 785-802 (2008).</li>
<li>Berggård, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein%E2%80%93protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Methods for the detection and analysis of protein–protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li>
<li>Magliery, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+protein-protein+interactions+with+a+green+fluorescent+protein+fragment+reassembly+trap%3A+Scope+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: Scope and mechanism.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (1), 146-157 (2005).</li>
<li>Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo.</a> Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).</li>
<li>Nguyen, T. N., Goodrich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+assays%3A+Eliminating+false+positive+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction assays: Eliminating false positive interactions.</a> Nature Methods. 3 (2), 135-139 (2006).</li>
<li>Fernández-Suárez, M., Chen, T. S., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection+in+vitro+and+in+cells+by+proximity+biotinylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection in vitro and in cells by proximity biotinylation.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9251-9253 (2008).</li>
<li>Jiang, M., Niu, C., Cao, J., Ni, D. -A., Chu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico-prediction+of+protein%E2%80%93protein+interactions+network+about+MAPKs+and+PP2Cs+reveals+a+novel+docking+site+variants+in+Brachypodium+distachyon%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In silico-prediction of protein–protein interactions network about MAPKs and PP2Cs reveals a novel docking site variants in Brachypodium distachyon.</a> Scientific Reports. 8 (1), 15083(2018).</li>
<li>Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Induction of protein-protein interactions in live cells using light.</a> Nature Biotechnology. 27 (10), 941-945 (2009).</li>
<li>Wang, W., Goodman, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+property+of+dietary+phenolic+agents+in+a+human+LDL-oxidation+ex+vivo+model%3A+Interaction+of+protein+binding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+Research%22%5BJournal%5D)">Antioxidant property of dietary phenolic agents in a human LDL-oxidation ex vivo model: Interaction of protein binding activity.</a> Nutrition Research. 19 (2), 191-202 (1999).</li>
<li>Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo.</a> Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).</li>
<li>Qvit, N., Disatnik, M. -H., Sho, E., Mochly-Rosen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+phosphorylation+inhibitor+of+delta+protein+kinase+C%E2%80%93Pyruvate+dehydrogenase+kinase+protein%E2%80%93protein+interactions%3A+Application+for+myocardial+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Selective phosphorylation inhibitor of delta protein kinase C–Pyruvate dehydrogenase kinase protein–protein interactions: Application for myocardial injury in vivo.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7626-7635 (2016).</li>
<li>Alam, M. N., Bristi, N. J., Rafiquzzaman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+in+vivo+and+in+vitro+methods+evaluation+of+antioxidant+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Pharmaceutical+Journal%22%5BJournal%5D)">Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity.</a> Saudi Pharmaceutical Journal. 21 (2), 143-152 (2013).</li>
<li>Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+fusion+protein+approach+for+efficient+high-throughput+screening+of+small+molecule%E2%80%93mediating+protein-protein+interactions+in+cells+and+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Novel fusion protein approach for efficient high-throughput screening of small molecule–mediating protein-protein interactions in cells and living animals.</a> Cancer Research. 65 (16), 7413-7420 (2005).</li>
<li>Boute, N., Jockers, R., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+resonance+energy+transfer+in+high-throughput+screening%3A+BRET+versus+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 23 (8), 351-354 (2002).</li>
<li>Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+protein-protein+interactions+in+live+cells+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51438(2014).</li>
<li>Ekins, S., Mestres, J., Testa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+pharmacology+for+drug+discovery%3A+Methods+for+virtual+ligand+screening+and+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">In silico pharmacology for drug discovery: Methods for virtual ligand screening and profiling.</a> British Journal of Pharmacology. 152 (1), 9-20 (2007).</li>
<li>Valerio, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+advanced+in+silico+methods+for+predictive+modeling+and+information+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Application of advanced in silico methods for predictive modeling and information integration.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (4), 395-398 (2012).</li>
<li>Piehler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+methodologies+for+measuring+protein+interactions+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro.</a> Current Opinion in Structural Biology. 15 (1), 4-14 (2005).</li>
<li>Ideker, T., Sharan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+networks+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Protein networks in disease.</a> Genome Research. 18 (4), 644-652 (2008).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+development+of+protein%E2%80%93protein+interactions+modulators%3A+mechanisms+and+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the development of protein–protein interactions modulators: mechanisms and clinical trials.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 213(2020).</li>
<li>Jarosz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp90%3A+A+global+regulator+of+the+genotype-to-phenotype+map+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Hsp90: A global regulator of the genotype-to-phenotype map in cancers.</a> Advances in Cancer Research. 129, 225-247 (2016).</li>
<li>Johnson, V. A., Singh, E. K., Nazarova, L. A., Alexander, L. D., McAlpine, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrocyclic+inhibitors+of+Hsp90%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Macrocyclic inhibitors of Hsp90.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 10 (14), 1380-1402 (2010).</li>
<li>Mahalingam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+HSP90+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting HSP90 for cancer therapy.</a> British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).</li>
<li>Stewart, A., Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-Immunoprecipitation%3A+Isolation+of+protein+signaling+complexes+from+native+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-Immunoprecipitation: Isolation of protein signaling complexes from native tissues.</a> Methods in Cell Biology. 112, 33-54 (2012).</li>
<li>Pierce, M. M., Raman, C. S., Nall, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry of protein-protein interactions.</a> Methods. 19 (2), San Diego, Calif. 213-221 (1999).</li>
<li>Paketurytė, V., et al. Inhibitor binding to carbonic anhydrases by isothermal titration calorimetry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaketuryt%C4%97%2C+V+%22Carbonic+Anhydrase+as+Drug+Target%22">Carbonic Anhydrase as Drug Target</a>. , Springer International Publishing. 79-95 (2019).</li>
<li>Grote, J., Dankbar, N., Gedig, E., Koenig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance%2Fmass+spectrometry+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance/mass spectrometry interface.</a> Analytical Chemistry. 77 (4), 1157-1162 (2005).</li>
<li>Kumaraswamy, S., Tobias, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+kinetic+analysis+of+an+antibody%E2%80%93antigen+interaction+using+biolayer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Label-free kinetic analysis of an antibody–antigen interaction using biolayer interferometry.</a> Methods in Molecular Biology. , 165-182 (2015).</li>
<li>Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+bio-layer+interferometry+for+the+analysis+of+protein%2Fliposome+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 72, 150-154 (2013).</li>
<li>Singh, A. N., Ramadan, K., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+methods+to+study+the+kinetics+of+protein%E2%80%93protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Protein+Molecular+and+Structural+Biology+Methods%22%5BJournal%5D)">Experimental methods to study the kinetics of protein–protein interactions.</a> Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods. , 115-124 (2022).</li>
<li>Frenzel, D., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+titration+series+with+biolayer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Kinetic titration series with biolayer interferometry.</a> PLoS One. 9 (9), 106882(2014).</li>
<li>Vu, C. -A., Chen, W. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-effect+transistor+biosensors+for+biomedical+applications%3A+Recent+advances+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Field-effect transistor biosensors for biomedical applications: Recent advances and future prospects.</a> Sensors. 19 (19), 4214(2019).</li>
<li>Bergveld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+evaluation+of+direct+electrical+protein+detection+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">A critical evaluation of direct electrical protein detection methods.</a> Biosensors & Bioelectronics. 6 (1), 55-72 (1991).</li>
<li>Lowe, B. M., Sun, K., Zeimpekis, I., Skylaris, C. K., Green, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-effect+sensors+%E2%80%93+from+pH+sensing+to+biosensing%3A+sensitivity+enhancement+using+streptavidin%E2%80%93biotin+as+a+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Field-effect sensors – from pH sensing to biosensing: sensitivity enhancement using streptavidin–biotin as a model system.</a> The Analyst. 142 (22), 4173-4200 (2017).</li>
<li>Goldsmith, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+biosensing+by+foundry-fabricated+graphene+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Digital biosensing by foundry-fabricated graphene sensors.</a> Scientific Reports. 9 (1), 434(2019).</li>
<li>Afsahi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+graphene-based+biosensor+for+early+detection+of+Zika+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Novel graphene-based biosensor for early detection of Zika virus infection.</a> Biosensors and Bioelectronics. 100, 85-88 (2018).</li>
<li>Afsahi, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+novel+graphene-enabled+diagnostic+assays+with+improved+signal-to-noise+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Advances%22%5BJournal%5D)">Towards novel graphene-enabled diagnostic assays with improved signal-to-noise ratio.</a> MRS Advances. 2 (60), 3733-3739 (2017).</li>
<li>Roe, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+Hsp90+regulation+by+the+protein+kinase-specific+cochaperone+p50cdc37%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mechanism of Hsp90 regulation by the protein kinase-specific cochaperone p50cdc37.</a> Cell. 116 (1), 87-98 (2004).</li>
<li>Gaiser, A. M., Kretzschmar, A., Richter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc37-Hsp90+complexes+are+responsive+to+nucleotide-induced+conformational+changes+and+binding+of+further+cofactors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cdc37-Hsp90 complexes are responsive to nucleotide-induced conformational changes and binding of further cofactors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285 (52), 40921-40932 (2010).</li>
<li>Popescu, A. I., Găzdaru, D. M., Chilom, C. G., Bacalum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+interactions%3A+Their+paramount+importance+for+life%5BTitle%5D)+AND+%22Romanian+Reports+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Biophysical interactions: Their paramount importance for life.</a> Romanian Reports in Physics. 65 (3), 1063-1077 (2013).</li>
<li>Surya, S., Abhilash, J., Geethanandan, K., Sadasivan, C., Haridas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+profile+of+protein-protein+interaction%3A+Crystal+structure+of+a+lectin-lectin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">A profile of protein-protein interaction: Crystal structure of a lectin-lectin complex.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 87, 529-536 (2016).</li>
<li>Velazquez-Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ITC+in+the+post-genomic+era...%3F+Priceless%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">ITC in the post-genomic era...? Priceless.</a> Biophysical Chemistry. 115 (23), 115-124 (2005).</li>
<li>Concepcion, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+biomolecular+interactions+using+bioLayer+interferometry+for+kinetic+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+%26+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of biomolecular interactions using bioLayer interferometry for kinetic characterization.</a> Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).</li>
<li>Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+and+label-free+bio-sensing+of+molecular+interactions+by+surface+plasmon+resonance%3A+A+laboratory+medicine+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22The+Clinical+Biochemist.+Reviews%22%5BJournal%5D)">Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: A laboratory medicine perspective.</a> The Clinical Biochemist. Reviews. 33 (4), 161-173 (2012).</li>
<li>Jacob, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+molecules+for+disruption+of+the+MYC+protein-protein+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthetic molecules for disruption of the MYC protein-protein interface.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry. 26 (14), 4234-4239 (2018).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten, financieel of anderszins.

In deze studie werd de haalbaarheid van het gebruik van de FEB-technologie (een real-time kinetische karakteriseringsbenadering) geëvalueerd om de biomoleculaire interactie tussen Hsp90 en Cdc37 te bepalen. Het eerste verkennende experiment (eerste experiment) suggereerde dat het kiezen van de juiste analytconcentraties een cruciaal onderdeel van het experiment is en dat het experiment moet worden ontworpen door concentratiepunten boven en onder de KD-waarde op te nemen, die werden voorspeld op basis van de ge...

Biomoleculaire interacties: Eiwitten zijn essentiële onderdelen van organismen en nemen deel aan tal van moleculaire routes zoals celmetabolisme, celstructuur, celsignalering, immuunresponsen, celadhesie en meer. Hoewel sommige eiwitten hun functie(s) onafhankelijk uitvoeren, interageren de meeste eiwitten met andere eiwitten met behulp van een bindende interface om de juiste biologische activiteit te coördineren1.
Biomoleculaire interacties kunnen voornamelijk worden geclassificeerd op basis van de verschillende structurele en functionele kenmerken van betrokken eiwitten2, bijvoorbeeld op basis van de eiwitoppervlakken, de complexe stabiliteit of de persistentie van interacties3. Het identificeren van essentiële eiwitten en hun rol in biomoleculaire interacties is van vitaal belang voor het begrijpen van biochemische mechanismen op moleculair niveau4. Momenteel zijn er verschillende benaderingen om deze interacties5 te detecteren: in vitro6, in silico7, in levende cellen8, ex vivo9 en in vivo10 met elk zijn eigen sterke en zwakke punten.
De in vivo assays worden uitgevoerd met behulp van het hele dier als een experimenteel hulpmiddel11, ende ex vivo assays worden uitgevoerd op weefselextracten of hele organen (bijv. Hart, hersenen, lever) in een gecontroleerde externe omgeving door minimale veranderingen in natuurlijke omstandigheden te bieden. De meest voorkomende toepassing van in vivo en ex vivo studies is het evalueren van de farmacokinetiek, farmacodynamiek en toxiciteitseffecten van potentiële farmacologische agentia vóór proeven bij mensen door hun algehele veiligheid en werkzaamheid te waarborgen12.
Biomoleculaire interacties kunnen ook worden gedetecteerd in levende cellen. Beeldvorming van levende cellen stelt ons in staat om dynamische interacties te observeren terwijl ze de reacties van een bepaalde biochemische route uitvoeren13. Bovendien kunnen detectietechnieken, zoals bioluminescentie of fluorescentieresonantie-energieoverdracht, informatie geven over waar en wanneer deze interacties plaatsvinden in de cel14. Hoewel detectie in levende cellen cruciale details biedt, vertrouwen deze detectiemethoden op optica en labels, die mogelijk niet de inheemse biologie weerspiegelen; ze zijn ook minder gecontroleerd dan in vitro methoden en vereisen gespecialiseerde expertise om15 uit te voeren.
De in silico computationele methoden worden voornamelijk gebruikt voor grootschalige screening van doelmoleculen vóór de in vitro experimenten. Computationele voorspellingsmethoden, computergebaseerde databases, moleculaire docking, kwantitatieve structuur-activiteitsrelaties en andere moleculaire dynamica-simulatiebenaderingen behoren tot de gevestigde in silico-tools 16. In vergelijking met moeizame experimentele technieken kunnen de in silico-tools gemakkelijk voorspellingen doen met een hoge gevoeligheid, maar met verminderde nauwkeurigheid in voorspellende prestaties17.
In vitro assays worden uitgevoerd met micro-organismen of biologische moleculen buiten hun standaard biologische context. Het weergeven van biomoleculaire interacties door middel van in vitro methoden is van cruciaal belang voor het begrijpen van eiwitfuncties en de biologie achter het complexe netwerk van celfuncties. De voorkeurstestmethodologie wordt gekozen op basis van de intrinsieke eigenschappen van het eiwit, kinetische waarden en de wijze en intensiteit van interacties18,19.
De interactie Hsp90/Cdc37: De chaperonne-kinaseroute, die Hsp90 en Cdc37 verbindt, is een veelbelovend therapeutisch doelwit in de tumorbiologie20. Hsp90 speelt een centrale rol in de controle van de celcyclus, eiwitassemblage, celoverleving en signaalroutes. Eiwitten die afhankelijk zijn van Hsp90 voor hun functies worden geleverd aan Hsp90 voor complexatie via een co-chaperonne, zoals Cdc37. Het Hsp90/Cdc37-complex regelt de vouwing van de meeste eiwitkinasen en dient als hub voor een groot aantal intracellulaire signaleringsnetwerken21. Het is een veelbelovend antitumordoel vanwege de verhoogde expressie in verschillende maligniteiten, waaronder acute myeloblastische leukemie, multipel myeloom en hepatocellulair carcinoom22,23.
Veelgebruikte in vitro biomoleculaire interactie detectietechnieken Co-immunoprecipitatie (co-IP) is een techniek die vertrouwt op antigeen-antilichaamspecificiteit om biologisch relevante interacties te identificeren24. Het belangrijkste nadeel van deze methode is het onvermogen om interacties met lage affiniteit en kinetische waarden te detecteren24. Biofysische methoden zoals isotherme titratiecalorimetrie (ITC), oppervlakteplasmonresonantie (SPR), biolaaginterferometrie (BLI) en FEB-technologie hebben de voorkeur om de kinetische waarden te bepalen.
ITC is een biofysische detectiemethode gebaseerd op de bepaling van bindingsenergie samen met een volledige thermodynamica-analyse om biomoleculaire interacties te karakteriseren25. Het belangrijkste voordeel van ITC is dat het geen etikettering of fixatie van het doeleiwit vereist. De belangrijkste problemen die ITC ondervindt, zijn de hoge concentratie doeleiwit die nodig is voor één experiment en de moeilijkheid om niet-covalente complexen te analyseren als gevolg van kleine bindende enthalpies26. Zowel SPR als BLI zijn labelvrije biofysische technieken die afhankelijk zijn van de immobilisatie van het doelmolecuul op het sensoroppervlak, gevolgd door daaropvolgende injecties van de analyt over het geïmmobiliseerde doel27,28. In SPR worden veranderingen in de brekingsindex tijdens biomoleculaire interacties gemeten27; in BLI wordt de interferentie in gereflecteerd licht in real-time geregistreerd als een verandering in golflengte als functie van tijd28. Zowel SPR als BLI delen gemeenschappelijke voordelen van het aanbieden van hoge specificiteit, gevoeligheid en detectiemogelijkheden29. In beide methoden wordt het doeleiwit geïmmobiliseerd op biosensoroppervlakken en daarom kan er enig verlies zijn van de oorspronkelijke conformatie van het doelwit, waardoor het moeilijk is om onderscheid te maken tussen specifieke versus niet-specifieke interacties30. BLI gebruikt dure wegwerpbare glasvezelbiosensoren om het doelwit te immobiliseren en is daarom een kostbare techniek31. In vergelijking met deze gevestigde biomoleculaire detectietools biedt FEB-technologie een betrouwbaar en labelvrij platform door lage nanomolelarconcentraties te gebruiken voor biomoleculaire detectie in realtime met kinetische karakterisering. De FEB-technologie overwint ook de borrelende uitdagingen in ITC en is kosteneffectiever in vergelijking met SPR of BLI.
De op veldeffecttransistor (FET) gebaseerde biosensoren is een opkomend veld voor het detecteren van biomoleculaire interacties door gevarieerde biomedische toepassingen aan te bieden. In het FET-systeem worden doelen geïmmobiliseerd naar de biosensorchips en interacties worden gedetecteerd door veranderingen in geleiding32. Het unieke kenmerk waarmee rekening moet worden gehouden bij de ontwikkeling van een efficiënte elektronische biosensor zijn de fysisch-chemische eigenschappen zoals de semi-geleidende aard en chemische stabiliteit van het coatingmateriaal dat wordt gebruikt om het sensoroppervlak te fabriceren33. Conventionele materialen zoals silicium die voor FET worden gebruikt, hebben de gevoeligheid van sensoren beperkt omdat het oxidelagen vereist die ingeklemd zitten tussen het transistorkanaal en een specifieke omgeving voor een goede werking34. Bovendien zijn siliciumtransistors gevoelig voor zoutrijke omgevingen, waardoor het moeilijk is om biologische interacties in hun natuurlijke omgeving te meten. De op grafeen gebaseerde biosensor wordt gepresenteerd als een alternatief omdat het een uitstekende chemische stabiliteit en elektrisch veld biedt. Aangezien grafeen een enkele atomaire laag koolstof is, is het zowel extreem gevoelig als een halfgeleider en chemisch compatibel met biologische oplossingen; beide kwaliteiten zijn wenselijk om compatibele elektronische biosensoren te genereren35. Het opmerkelijke ultrahoge laadpotentieel van biomoleculen dat wordt geboden door biosensoren met grafeencoating, leidt tot de ontwikkeling van op grafeen gebaseerde biosensoren FEB-technologie.
Principe van FEB-technologie: FEB is een labelvrije biomoleculaire detectietechniek die de elektrische stroom meet door de grafeenbiosensor waaraan de bindingsdoelen worden geïmmobiliseerd. Interacties tussen het geïmmobiliseerde eiwit en de analyt resulteren in veranderingen in de stroom die in realtime worden gemonitord, waardoor nauwkeurige kinetische metingenmogelijk zijn 36.
Instrumentatie: Het FEB-systeem bestaat uit een grafeenveldeffecttransistor (gFET) sensorchip en een elektronische lezer die gedurende het hele experiment een constante spanning toepast (figuur 1). De analyt wordt in oplossing aangebracht op het doeleiwit dat op het biosensoroppervlak is geïmmobiliseerd. Wanneer een interactie optreedt, wordt een verandering in de stroom gemeten en in realtime geregistreerd. Naarmate de analytconcentratie toeneemt, zal ook de fractie van gebonden analyt toenemen, waardoor hogere wisselingen in de stroom ontstaan. Met behulp van de geautomatiseerde analysesoftware die bij het instrument wordt geleverd (Tabel van materialen), wordt I-Respons gemeten en geregistreerd in termen van biosensing units (BU)37. I-Respons wordt gedefinieerd als de verandering in de stroom (I) door de biosensorchip gemeten in real-time bij de interactie van het geïmmobiliseerde doelwit met de analyt. De geautomatiseerde analysesoftware van het VBO kan zowel de I-Respons als de C-Respons op dynamische interactiegebeurtenissen analyseren, waarbij de C-Respons de veranderingen in de capaciteit (C) registreert. De variaties in zowel de I-Respons als de C-Respons komen direct overeen met de fractie van gebonden analyt en kunnen verder worden geanalyseerd om KD-waarden te genereren. De standaardvoorkeur van de geautomatiseerde analysesoftware is I-Response.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63495/63495fig01.jpg"> Figuur 1: Overzicht van de experimentele opstelling. (A) Op grafeen gebaseerde chip en een elektronische lezer. (B) Een overzicht van de chipcomponenten. De chip is bevestigd aan twee elektroden die stroom leveren aan het systeem. Het oppervlak van de chip is bedekt met grafeen, dat bij activering het doelwit kan binden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63495/63495fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Methodologie: In eerste instantie wordt de geactiveerde biosensorchip in het FEB-apparaat ingebracht (figuur 1), gevolgd door de uitvoering van de onderstaande stappen: (1) Kalibratie: Het experiment begint met systeemkalibratie met behulp van 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS; pH = 7,4) om de basislijn equilibratierespons te creëren. (2) Associatie: De analyt wordt in de chip geïntroduceerd en de I-respons wordt gemonitord totdat de bindingsverzadiging is bereikt. (3) Dissociatie: De analyt wordt gedissocieerd met behulp van 1x PBS. (4) Regeneratie: Restanten van de analyt worden verwijderd met behulp van 1x PBS. (5) Wassen: In totaal worden vijf wasbeurten uitgevoerd met behulp van 1x PBS voor het grondig verwijderen van de gebonden en ongebonden analyten uit de chip.
Analyse: Data-analyse wordt uitgevoerd met behulp van de volledig geautomatiseerde software die bij het instrument wordt geleverd. De geautomatiseerde analysesoftware genereert een Hill fit plot met eenKD-waarde . De Hill fit plot beschrijft de associatie van een analyt met het doeleiwit als functie van analytconcentraties. De concentratie waarbij een half-maximale respons wordt bereikt, is evenredig met de KD-waarde . Een lageKD-waarde vertegenwoordigt een hoge bindingsaffiniteit en vice versa.
Om de gegevens verkregen uit het VBO-experiment te valideren, worden I-responsen geëxtraheerd uit elk uitleespunt voor elke analytconcentratie met behulp van de data review/export software en kunnen ze worden geëxporteerd naar andere statistische analysesoftware (zie Tabel met materialen) zoals hieronder uitgelegd.

<table><tbody><tr><td>Automated analysis software</td><td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td><td>NA CAS-nummer: NA</td><td>Aangeduid in de tekst als de geautomatiseerde analysesoftware geleverd bij het instrument. Genereert geautomatiseerde analyse.</td></tr><tr><td>COOH-BPU (Biosensing Processing Unit)</td><td>Agile plus software, Cardea (Nanomed)</td><td>NA CAS-nummer: NA</td><td>biosensorchip</td></tr><tr><td>Data review software</td><td>Datalign 1.0, Cardea (Nanomed)</td><td>NA CAS-nummer: NA</td><td>Aangeduid als de geleverde datareviewsoftware in de tekst. Wordt geleverd met het instrument en maakt het mogelijk om de informatiegegevenspunten te bekijken en te exporteren.</td></tr><tr><td>Dialysiszak</td><td>CelluSep,&nbsp; Membraanfiltratieproducten</td><td>T2-10-15 CAS-nummer: NA</td><td>T2-slangen (6.000-8.000 MWCO), (10 mm fw, 6,4 mm &Oslash;, 0,32 ml/cm, 15 m)</td></tr><tr><td>EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide)</td><td>Cardea (Nanomed)</td><td>EDC160322-02 CAS-nummer: 25952-53-8</td><td>Witte poeder</td></tr><tr><td>ITC (Isothermal titration calorimetry) systeem</td><td>Microcal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom)</td><td>NA CAS-nummer: NA</td><td></td></tr><tr><td>MES (2-(N-morpholino) eetaansulfonzuur) buffer</td><td>Merck</td><td>M3671-50G CAS-nummer: 4432-31-9</td><td>Witte poeder</td></tr><tr><td>NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chips</td><td>Cardea (Nanomed)</td><td>NA CAS-nummer: NA</td><td>Op grafeen gebaseerde chip</td></tr><tr><td>PBS (Fosfaat-gebufferde zoutoplossing) X 10</td><td>Bio-Lab</td><td>001623237500&nbsp; CAS-nummer: 7758-11-4</td><td>Vloeibare transparante oplossing</td></tr><tr><td>Pipet</td><td>Thermo Scientific</td><td>11855231 CAS-nummer: NA</td><td>Finnpipette F3 5-50 &micro;L, geel</td></tr><tr><td>Quench 1 (3,9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS)</td><td>Cardea (Nanomed)</td><td>0105-001-002-001 CAS-nummer: NA</td><td>Vloeibare, transparante oplossing</td></tr><tr><td>Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8,5))</td><td>Cardea (Nanomed)</td><td>0105-001-003-001 CAS-nummer: NA</td><td>Vloeibare, transparante oplossing</td></tr><tr><td>Recombinant eiwit Cdc37</td><td>Abcam</td><td>ab256157 CAS-nummer: NA</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant eiwit Hsp90 beta</td><td>Abcam</td><td>ab80033 CAS-nummer: NA</td><td></td></tr><tr><td>Spreadsheet</td><td>Excel, Microsoft office</td><td>NA CAS-nummer: NA</td><td></td></tr><tr><td>Statistisch software</td><td>GraphPad, Prism</td><td>NA CAS-nummer: NA</td><td>Aangeduid als de andere statistische software. Sigma plot, phyton of andere statistische programma's kunnen ook worden gebruikt</td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Cardea (Nanomed)</td><td>NHS160321-07 CAS-nummer: 106627-54-7</td><td>Witte poeder</td></tr><tr><td>Tips</td><td>Alex rood</td><td>LC 1093-800-000 CAS-nummer: NA</td><td>Tip 1-200 &micro;l, in bulk, 1.000 stuks</td></tr></tbody></table>

onderzoek naar biomoleculaire interactie tussen de moleculaire chaperonne hsp90 en zijn clienteiwit kinase cdc37 met behulp van field-effect biosensing-technologie

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

Biomoleculaire interacties spelen een veelzijdige rol in tal van cellulaire processen door functioneel relevante biologische gebeurtenissen te reguleren en te coördineren. Biomoleculen zoals eiwitten, koolhydraten, vitamines, vetzuren, nucleïnezuren en enzymen zijn fundamentele bouwstenen van levende wezens; ze verzamelen zich in complexe netwerken in biosystemen om een groot aantal levensgebeurtenissen te synchroniseren. Eiwitten maken meestal gebruik van complexe interactoomnetwerken om hun functies uit te voeren; daarom is het verplicht om dergelijke interacties te evalueren om hun belang in cellen op zowel cellulair als organismeniveau te ontrafelen. Om dit doel te bereiken, introduceren we een snel opkomende technologie, field-effect biosensing (FEB), om specifieke biomoleculaire interacties te bepalen. FEB is een benchtop, labelvrije en betrouwbare biomoleculaire detectietechniek om specifieke interacties te bepalen en maakt gebruik van hoogwaardige elektronische biosensoren. De FEB-technologie kan interacties in het nanomolaire bereik volgen vanwege de biocompatibele nanomaterialen die op het biosensoroppervlak worden gebruikt. Als proof of concept werd de eiwit-eiwitinteractie (PPI) tussen heat shock protein 90 (Hsp90) en celdelingscyclus 37 (Cdc37) opgehelderd. Hsp90 is een ATP-afhankelijke moleculaire chaperonne die een essentiële rol speelt bij het vouwen, stabiliteit, rijping en kwaliteitscontrole van veel eiwitten, waardoor meerdere vitale cellulaire functies worden gereguleerd. Cdc37 wordt beschouwd als een eiwitkinase-specifieke moleculaire chaperonne, omdat het specifiek eiwitkinasen voor Hsp90 herkent en rekruteert om hun stroomafwaartse signaaltransductieroutes te reguleren. Als zodanig wordt Cdc37 beschouwd als een co-chaperonne van Hsp90. De chaperonnekinaseroute (Hsp90/Cdc37-complex) is hypergeactiveerd bij meerdere maligniteiten die cellulaire groei bevorderen; daarom is het een potentieel doelwit voor kankertherapie. De huidige studie toont de efficiëntie van feb-technologie met behulp van het Hsp90/Cdc37-modelsysteem. FEB detecteerde een sterke PPI tussen de twee eiwitten (KD-waarden van 0,014 μM, 0,053 μM en 0,072 μM in drie onafhankelijke experimenten). Kortom, het VBO is een labelvrij en kosteneffectief PPI-detectieplatform, dat snelle en nauwkeurige metingen biedt.

Resultaten van experiment 1: Het doeleiwit Hsp90 (500 nM) werd geïmmobiliseerd naar de chip volgens het doelimmobilisatieprotocol zoals hierboven beschreven. Voor het eerste experiment werden 10 concentraties van het analyteiwit Cdc37, variërend van 25 nM tot 5.000 nM, bereid op basis van de beschikbare gegevens in de literatuur (zie tabel 1).
De stappen van het experiment kunnen in realtime worden gevolgd door de veranderingen in de I-respons te volgen (<s...

Field-effect biosensing (FEB) is een labelvrije techniek voor het detecteren van biomoleculaire interacties. Het meet de elektrische stroom door de grafeen biosensor waaraan de bindende doelen worden geïmmobiliseerd. De FEB-technologie werd gebruikt om biomoleculaire interacties tussen Hsp90 en Cdc37 te evalueren en er werd een sterke interactie tussen de twee eiwitten gedetecteerd.

Onderzoek naar biomoleculaire interactie tussen de moleculaire chaperonne Hsp90 en zijn clienteiwit kinase Cdc37 met behulp van field-effect biosensing-technologie

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

Het VBO is een labelvrij en kosteneffectief _______ ________ interactiedetectieplatform dat snelle en nauwkeurige metingen biedt. Deze methode biedt validatie van bekende of onbekende interacties en een eenvoudige manier om te testen op potentiële remmers van de biomoleculaire interacties. Het belangrijkste voordeel van het VBO is de geautomatiseerde, gebruiksvriendelijke software die de gebruiker gedurende het hele experiment beschermt met een open, handpipettersplatform, waardoor gebruikers met weinig of zelfs geen training kunnen werken.FEB-technologie biedt ook toepassingen op verschillende gebieden van farmaceutica, biomoleculaire analyse van kleine moleculen, peptiden en eiwitten, medicijnvalidatie door in vitro biologische activiteit gemakkelijk te vertalen in in vivo werkzaamheid. Als beginner kunt u uitdagingen tegenkomen bij het kiezen van de juiste analytconcentraties om het experiment te optimaliseren om een betrouwbare KD-waarde te krijgen. Wij adviseren om aandacht te besteden aan het chip functionalisatie proces en een goede buffer uitwisseling.Begin met het mengen van gelijke volumes EDC en sulfo-NHS-oplossing door op en neer te pipetteren. Plaats de door het bedrijf geleverde biosensorchip in een glazen petrischaaltje met een deksel. Alle functionalisatiestappen die betrokken zijn bij chipactivering worden voorgesteld om in de petrischaal te worden uitgevoerd.Breng 50 microliter mes-buffer met één kies aan op de biosensorchip. Incubeer gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Aspiraleer vervolgens de buffer en breng onmiddellijk 50 microliter EDC sulfo-NHS-oplossing aan op de sensorchip.Dek de petrischaal af en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Zuig de EDC sulfo-NHS-oplossing uit de chip en breng 50 microliter mes-buffer met één kies aan. Zuig mes-buffer op en spoel de chip twee keer met 50 microliter 1x PBS.Zuig de PBS uit de chip en voeg het doelmolecuul Hsp90 toe. Bedek de glazen petrischaal en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Zuig vervolgens de oplossing met het doelmolecuul aan en spoel drie keer met 50 microliter 1x PBS.Zuig de 1X PBS-oplossing uit de chip en voeg 50 microliter van de blusoplossing toe. Dek de glazen petrischaal af en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Zuig de blusoplossing één oplossing uit de chip en voeg 50 microliter van de bluss twee-oplossing toe.Dek de glazen petrischaal af en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Zuig daarna de blusoplossing twee uit de chip en spoel de chip vijf keer met 50 microliter 1X PBS waardoor de laatste PBS-druppel op de sensor achterblijft. Bereid de analytverdunningsreeks voor Cdc37 voor in het gewenste concentratiebereik.Ontwerp het experiment om ten minste acht verschillende analytconcentraties op te nemen om een betrouwbare dissociatieconstante of KD-waarde te verkrijgen en bereid deze verschillende verdunningen voor in dezelfde buffer die wordt gebruikt voor kalibratie en doeleiwit. Plaats de chip voorzichtig op het instrument. Zorg ervoor dat de software is ingeschakeld en dat het LED-lampje groen wordt.Druk vervolgens op de module Experiment uitvoeren op de geautomatiseerde software en kies 10 punten met regeneratie of een ander gewenst protocol. Vul de details in zoals operatornaam, experimentnaam, datum, regeneratiebuffer, geïmmobiliseerd doel en de analyt in oplossing. Druk op de knop Experiment beginnen die in de software wordt weergegeven en volg de instructies die door de geautomatiseerde software worden weergegeven.Om de instrumentkalibratie uit te voeren, zuigt u de resterende PBS-oplossing uit de chip aan en brengt u 50 microliter van de kalibratiebuffer aan. Druk op de knop Doorgaan en wacht vijf minuten totdat de kalibratiestap is voltooid. De software geeft het eindpunt weer dat is bepaald voor de kalibratiestap met een waarschuwingsalarm om op te volgen.Voer vervolgens een analytassociatie uit door de kalibratiebuffer van de chip aan te zuigen en 50 microliter van de laagste analytconcentratie toe te passen. Druk op de knop Doorgaan en wacht vijf minuten totdat de koppelingsstap is voltooid. De software geeft het eindpunt weer voor de koppelingsstap met een waarschuwingsalarm om door te gaan.Om een analytdissociatie uit te voeren, zuigt u de analytoplossing uit de chip en brengt u 50 microliter van de dissociatiebuffer aan. Druk op de knop Doorgaan. Na de duur van de dissociatiestap geeft de software het eindpunt voor de dissociatiestap weer met een waarschuwingsalarm.Voer vervolgens chipregeneratie uit door de dissociatieoplossing van de chip aan te zuigen en 50 microliter van de regeneratiebuffer aan te brengen. Druk vervolgens op de knop Doorgaan. De regeneratiestap duurt meestal ongeveer 30 seconden om te voltooien.Daarna geeft de software het eindpunt voor de regeneratiestap weer met een waarschuwingsalarm om op te volgen. Ten slotte, om de chip te wassen, zuigt u de regeneratieoplossing uit de chip en brengt u 50 microliter van de wasbuffer aan. Zuig de oplossing uit de chip en herhaal dit vijf keer.Laat de laatste druppel van de wasbuffer op de chip zitten. Druk vervolgens op de knop Doorgaan en wacht 30 seconden totdat de duur van de wasstap is voltooid in het softwaredisplay. Herhaal de stappen voor elke gebruikte analytconcentratie.De vijf stappen van de kalibratie, analytassociatie, dissociatie, regeneratie en vijf keer wassen vormen één cyclus. Druk op de knop Analyse in de geautomatiseerde analysesoftware aan het einde van het experiment. Er verschijnt een weergavevenster met alle experimentele punten.Zorg ervoor dat de analytconcentraties die voor het voorgeschreven protocol worden gebruikt, correct zijn. Druk op de knop Analyse uitvoeren om de KD-waarde automatisch te genereren. De software genereert een hill fit plot door de analytconcentraties uit te zetten tegen de overeenkomstige I-responsen waaruit de dissociatieconstante bij evenwicht wordt berekend.Het doeleiwit Hsp90 werd geïmmobiliseerd naar de chip en voor het eerste experiment werden 10 concentraties van het analyteiwit Cdc37, variërend van 25 nanomolars tot 5.000 nanomolars, bereid. De gegevensbestanden die zijn gegenereerd uit experiment één zijn hier weergegeven. De experimentele gegevens die in realtime worden gemonitord, worden hier weergegeven.De Y-as komt overeen met de I-respons in de biosensoreenheden en de X-as komt overeen met de verschillende tijdspunten en concentraties van de analyt in het experiment. De hier getoonde grafische afbeelding geeft de hill fit plot weer die is gegenereerd door de geautomatiseerde analysesoftware. De Y-as komt overeen met de I-respons in de biosensoreenheden en de X-as komt overeen met de verschillende analytconcentraties in het experiment.De hier getoonde grafische afbeelding vertegenwoordigt de associatieplot die is gegenereerd met behulp van de statistische analysesoftware. De Y-as komt overeen met de I-respons aan het einde van de associatiefase en de X-as komt overeen met de verschillende concentraties van de analyt Cdc37. In experiment twee werd een verschillende reeks concentraties gebruikt, variërend van 0,4 nanomolair tot 200 nanomolair, en de gegenereerde gegevensbestanden worden hier weergegeven.De grafische afbeeldingen vertegenwoordigen het ITC-thermogram van Hsp90- en Cdc37-interactie. Hier worden de overeenkomstige warmte-evoluerende curven getoond die worden verkregen als gevolg van de opeenvolgende injecties van Cdc37 in Hsp90 bij 298,15 Kelvin. Het differentiële vermogen dat hier wordt gebruikt, is een functie van de tijd.De geïntegreerde gegevenspunten in deze grafiek geven de overeenkomstige genormaliseerde warmte aan versus de Mueller-verhouding van Hsp90 tot Cdc37. De open pipetteerbenadering die hier wordt gebruikt, vereist dat de gebruiker een basisbeheersing van handpipetters heeft, waarbij hij ervoor zorgt dat de biosensor niet met de punt wordt aangeraakt. De reproduceerbaarheid van de staptiming hangt volledig af van de gebruiker.Zodra de onderzoeker een interactie tussen twee biomoleculen karakteriseert, kunnen we een screeningsexperiment uitvoeren door potentiële remmers of modulatoren te ontwerpen die zich richten op de specifieke biomoleculaire interactie met behulp van het FEB-systeem. Deze procedure kan worden gebruikt om bekende en nieuwe interactie tussen eiwitten en kleine moleculen, waaronder geneesmiddelen en peptiden, te identificeren, verifiëren en kwantificeren.

exploring-biomolecular-interaction-between-molecular-chaperone-hsp90

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In this video, we demonstrate the amplified luminescent proximity homogeneous assay—a bead-based proximity assay. It utilizes homogeneously-sized acceptor and donor beads, immobilized with two proteins that tend to interact to screen potential small molecules inhibiting protein interactions.

Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay: A Bead-Based Proximity Assay to Screen Small Molecules Inhibiting Protein-Protein Interactions

In this video, we describe the field-effect biosensing (FEB) technology to detect and quantify protein-protein interactions. The target proteins immobilized on the graphene biosensor interact with analyte proteins in solution, resulting in electrical current alterations in the FEB system. This change in the electrical response indicates the binding affinity between the proteins.

Graphene Biosensor-Based Field-Effect Biosensing to Detect Protein-Protein Interactions

Met behulp van eiwit microarrays met bijna het hele S. cerevisiae proteoom wordt gesondeerd voor snelle onpartijdige ondervraging van duizenden proteïne-proteïne interacties in parallel. Deze werkwijze kan worden gebruikt voor eiwit-kleine molecule, posttranslationele modificatie, en andere assays high-throughput.

Probing hoge dichtheid functioneel eiwit Microarrays om eiwit-eiwit interacties Detect

Deze studie beschrijft biofysische, biochemische en moleculaire technieken om de chaperone activiteit van Escherichia coli HdeB karakteriseren onder zure pH-omstandigheden. Deze werkwijzen zijn met succes toegepast voor andere zuur-beschermende chaperones zoals HdeA en kan worden aangepast om te werken voor andere chaperones en stresscondities.

Detectie van de pH-afhankelijke activiteit van<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; en<em&gt; In Vivo</em

Hier presenteren we een protocol om gegevens van de drie kleuren smFRET en haar analyse met een 3D ensemble verborgen Markov Model te verkrijgen. Met deze benadering kunnen wetenschappers kinetische informatie ophalen uit complexe eiwit systemen, met inbegrip van Allosterie of gecorreleerde interacties.

Met behulp van 3 Single-molecuul FRET te bestuderen de correlatie van eiwitinteractie

Een van de meest uitdagende stress voorwaarden die organismen tijdens hun leven tegenkomen gaat de accumulatie van oxidanten. Tijdens oxidatieve stress afhankelijk cellen sterk zijn van moleculaire chaperones. Hier presenteren we methoden voor het onderzoeken van de redox-gereglementeerde anti-aggregatie activiteit, evenals het monitoren van de structurele veranderingen in het bestuur van de Chaperon-functie met behulp van HDX-MS.

Hsp33 de Redox-gereglementeerde Chaperone activiteit definiëren en in kaart brengen van de wijzigingen van de conformationele op Hsp33 met behulp van spectrometrie van de massa van de Exchange waterstof-deuterium

Cognate J-Domain eiwitten werken samen met de Hsp70 chaperonne om te helpen bij een groot aantal biologische processen, variërend van eiwit vouwen tot afbraak. Hier beschrijven we een in-situ proximity ligatie test, die het mogelijk maakt om deze transitieve gevormde chaperonne machinerie in bacteriële, gist en menselijke cellen te monitoren.

In situ monitoring van transitieve gevormde moleculaire Chaperone-assemblages in bacteriën, gist en menselijke cellen

Deze studie was gericht op het presenteren van een strategie voor het identificeren van drug-peptide interacties. De strategie omvat het biopanning van drug-herkennende korte peptiden op basis van een kwarts-kristal microbalans (QCM) biosensor, gevolgd door bioinformatica analyse voor het kwantitatief beoordelen van de informatie verkregen voor de drugherkenning en annotatie van de drug-bindende sites op eiwitten.

Biosensor-gebaseerde high throughput biopanning en bioinformatica analyse strategie voor de wereldwijde validatie van drug-eiwit interacties

Dit protocol presenteert een techniek voor het onderzoeken van eiwit-eiwitinteracties met behulp van glutathion-gekoppelde donorkralen met GST-gefuseerde TPR-motief co-chaperones en acceptor kralen in combinatie met een Hsp90-afgeleid peptide. We hebben deze techniek gebruikt om kleine moleculen te screenen om Hsp90-FKBP51- of Hsp90-FKBP52-interacties te verstoren en hebben krachtige en selectieve Hsp90-FKBP51-interactieremmers geïdentificeerd.

Studies van Chaperone-Cochaperone Interacties met behulp van Homogene Bead-Based Assay

Dit protocol demonstreert de chaperonne-activiteit van heat shock protein 70 (Hsp70). E. coli dnaK756-cellen dienen als model voor de test omdat ze een inheemse, functioneel gehandicapte Hsp70 herbergen, waardoor ze vatbaar zijn voor hittestress. De heterologe introductie van functioneel Hsp70 redt de groeideficiëntie van de cellen.

Op Escherichia coli gebaseerde complementatietest om de chaperonnefunctie van heat shock-eiwit te bestuderen 70

Hier presenteren we een protocol om het vastleggen en identificeren van ziektespecifieke eiwit-eiwitinteracties van natuurlijke cellen en weefsels mogelijk te maken met behulp van chemische sondes en massaspectrometrie. De resulterende interactiedatasets worden geanalyseerd via een speciaal webgebaseerd platform om dynamische netwerkdisfuncties en routeveranderingen die verband houden met ziekte aan het licht te brengen.

In kaart brengen van disfunctionele eiwit-eiwitinteracties bij ziekte

Leer de interactie tussen het moleculaire chaperon Hsp90 en het kinase Cdc37 met behulp van field-effect biosensing-technologie. Deze labelvrije methode biedt snelle en accurate metingen voor farmaceutisch onderzoek.

Onderzoek naar biomoleculaire interactie tussen de moleculaire chaperonne Hsp90 en zijn clienteiwit kinase Cdc37 met behulp van field-effect biosensing-technologie (Video) | JoVE Journal

Onderzoek naar biomoleculaire interactie tussen de moleculaire chaperonne Hsp90 en zijn clienteiwit kinase Cdc37 met behulp van field-effect biosensing-technologie

Meer video's verkennen