Onderzoek naar biomoleculaire interactie tussen de moleculaire chaperonne Hsp90 en zijn clienteiwit kinase Cdc37 met behulp van field-effect biosensing-technologie

Het VBO is een labelvrij en kosteneffectief _______ ________ interactiedetectieplatform dat snelle en nauwkeurige metingen biedt. Deze methode biedt validatie van bekende of onbekende interacties en een eenvoudige manier om te testen op potentiële remmers van de biomoleculaire interacties. Het belangrijkste voordeel van het VBO is de geautomatiseerde, gebruiksvriendelijke software die de gebruiker gedurende het hele experiment beschermt met een open, handpipettersplatform, waardoor gebruikers met weinig of zelfs geen training kunnen werken.

FEB-technologie biedt ook toepassingen op verschillende gebieden van farmaceutica, biomoleculaire analyse van kleine moleculen, peptiden en eiwitten, medicijnvalidatie door in vitro biologische activiteit gemakkelijk te vertalen in in vivo werkzaamheid. Als beginner kunt u uitdagingen tegenkomen bij het kiezen van de juiste analytconcentraties om het experiment te optimaliseren om een betrouwbare KD-waarde te krijgen. Wij adviseren om aandacht te besteden aan het chip functionalisatie proces en een goede buffer uitwisseling.

Begin met het mengen van gelijke volumes EDC en sulfo-NHS-oplossing door op en neer te pipetteren. Plaats de door het bedrijf geleverde biosensorchip in een glazen petrischaaltje met een deksel. Alle functionalisatiestappen die betrokken zijn bij chipactivering worden voorgesteld om in de petrischaal te worden uitgevoerd.

Breng 50 microliter mes-buffer met één kies aan op de biosensorchip. Incubeer gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Aspiraleer vervolgens de buffer en breng onmiddellijk 50 microliter EDC sulfo-NHS-oplossing aan op de sensorchip.

Dek de petrischaal af en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Zuig de EDC sulfo-NHS-oplossing uit de chip en breng 50 microliter mes-buffer met één kies aan. Zuig mes-buffer op en spoel de chip twee keer met 50 microliter 1x PBS.

Zuig de PBS uit de chip en voeg het doelmolecuul Hsp90 toe. Bedek de glazen petrischaal en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Zuig vervolgens de oplossing met het doelmolecuul aan en spoel drie keer met 50 microliter 1x PBS.

Zuig de 1X PBS-oplossing uit de chip en voeg 50 microliter van de blusoplossing toe. Dek de glazen petrischaal af en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Zuig de blusoplossing één oplossing uit de chip en voeg 50 microliter van de bluss twee-oplossing toe.

Dek de glazen petrischaal af en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Zuig daarna de blusoplossing twee uit de chip en spoel de chip vijf keer met 50 microliter 1X PBS waardoor de laatste PBS-druppel op de sensor achterblijft. Bereid de analytverdunningsreeks voor Cdc37 voor in het gewenste concentratiebereik.

Ontwerp het experiment om ten minste acht verschillende analytconcentraties op te nemen om een betrouwbare dissociatieconstante of KD-waarde te verkrijgen en bereid deze verschillende verdunningen voor in dezelfde buffer die wordt gebruikt voor kalibratie en doeleiwit. Plaats de chip voorzichtig op het instrument. Zorg ervoor dat de software is ingeschakeld en dat het LED-lampje groen wordt.

Druk vervolgens op de module Experiment uitvoeren op de geautomatiseerde software en kies 10 punten met regeneratie of een ander gewenst protocol. Vul de details in zoals operatornaam, experimentnaam, datum, regeneratiebuffer, geïmmobiliseerd doel en de analyt in oplossing. Druk op de knop Experiment beginnen die in de software wordt weergegeven en volg de instructies die door de geautomatiseerde software worden weergegeven.

Om de instrumentkalibratie uit te voeren, zuigt u de resterende PBS-oplossing uit de chip aan en brengt u 50 microliter van de kalibratiebuffer aan. Druk op de knop Doorgaan en wacht vijf minuten totdat de kalibratiestap is voltooid. De software geeft het eindpunt weer dat is bepaald voor de kalibratiestap met een waarschuwingsalarm om op te volgen.

Voer vervolgens een analytassociatie uit door de kalibratiebuffer van de chip aan te zuigen en 50 microliter van de laagste analytconcentratie toe te passen. Druk op de knop Doorgaan en wacht vijf minuten totdat de koppelingsstap is voltooid. De software geeft het eindpunt weer voor de koppelingsstap met een waarschuwingsalarm om door te gaan.

Om een analytdissociatie uit te voeren, zuigt u de analytoplossing uit de chip en brengt u 50 microliter van de dissociatiebuffer aan. Druk op de knop Doorgaan. Na de duur van de dissociatiestap geeft de software het eindpunt voor de dissociatiestap weer met een waarschuwingsalarm.

Voer vervolgens chipregeneratie uit door de dissociatieoplossing van de chip aan te zuigen en 50 microliter van de regeneratiebuffer aan te brengen. Druk vervolgens op de knop Doorgaan. De regeneratiestap duurt meestal ongeveer 30 seconden om te voltooien.

Daarna geeft de software het eindpunt voor de regeneratiestap weer met een waarschuwingsalarm om op te volgen. Ten slotte, om de chip te wassen, zuigt u de regeneratieoplossing uit de chip en brengt u 50 microliter van de wasbuffer aan. Zuig de oplossing uit de chip en herhaal dit vijf keer.

Laat de laatste druppel van de wasbuffer op de chip zitten. Druk vervolgens op de knop Doorgaan en wacht 30 seconden totdat de duur van de wasstap is voltooid in het softwaredisplay. Herhaal de stappen voor elke gebruikte analytconcentratie.

De vijf stappen van de kalibratie, analytassociatie, dissociatie, regeneratie en vijf keer wassen vormen één cyclus. Druk op de knop Analyse in de geautomatiseerde analysesoftware aan het einde van het experiment. Er verschijnt een weergavevenster met alle experimentele punten.

Zorg ervoor dat de analytconcentraties die voor het voorgeschreven protocol worden gebruikt, correct zijn. Druk op de knop Analyse uitvoeren om de KD-waarde automatisch te genereren. De software genereert een hill fit plot door de analytconcentraties uit te zetten tegen de overeenkomstige I-responsen waaruit de dissociatieconstante bij evenwicht wordt berekend.

Het doeleiwit Hsp90 werd geïmmobiliseerd naar de chip en voor het eerste experiment werden 10 concentraties van het analyteiwit Cdc37, variërend van 25 nanomolars tot 5.000 nanomolars, bereid. De gegevensbestanden die zijn gegenereerd uit experiment één zijn hier weergegeven. De experimentele gegevens die in realtime worden gemonitord, worden hier weergegeven.

De Y-as komt overeen met de I-respons in de biosensoreenheden en de X-as komt overeen met de verschillende tijdspunten en concentraties van de analyt in het experiment. De hier getoonde grafische afbeelding geeft de hill fit plot weer die is gegenereerd door de geautomatiseerde analysesoftware. De Y-as komt overeen met de I-respons in de biosensoreenheden en de X-as komt overeen met de verschillende analytconcentraties in het experiment.

De hier getoonde grafische afbeelding vertegenwoordigt de associatieplot die is gegenereerd met behulp van de statistische analysesoftware. De Y-as komt overeen met de I-respons aan het einde van de associatiefase en de X-as komt overeen met de verschillende concentraties van de analyt Cdc37. In experiment twee werd een verschillende reeks concentraties gebruikt, variërend van 0,4 nanomolair tot 200 nanomolair, en de gegenereerde gegevensbestanden worden hier weergegeven.

De grafische afbeeldingen vertegenwoordigen het ITC-thermogram van Hsp90- en Cdc37-interactie. Hier worden de overeenkomstige warmte-evoluerende curven getoond die worden verkregen als gevolg van de opeenvolgende injecties van Cdc37 in Hsp90 bij 298,15 Kelvin. Het differentiële vermogen dat hier wordt gebruikt, is een functie van de tijd.

De geïntegreerde gegevenspunten in deze grafiek geven de overeenkomstige genormaliseerde warmte aan versus de Mueller-verhouding van Hsp90 tot Cdc37. De open pipetteerbenadering die hier wordt gebruikt, vereist dat de gebruiker een basisbeheersing van handpipetters heeft, waarbij hij ervoor zorgt dat de biosensor niet met de punt wordt aangeraakt. De reproduceerbaarheid van de staptiming hangt volledig af van de gebruiker.

Zodra de onderzoeker een interactie tussen twee biomoleculen karakteriseert, kunnen we een screeningsexperiment uitvoeren door potentiële remmers of modulatoren te ontwerpen die zich richten op de specifieke biomoleculaire interactie met behulp van het FEB-systeem. Deze procedure kan worden gebruikt om bekende en nieuwe interactie tussen eiwitten en kleine moleculen, waaronder geneesmiddelen en peptiden, te identificeren, verifiëren en kwantificeren.