Interview: glycolipide antigeen presentatie door CD1d en het therapeutisch potentieel van NKT-cel activatie

Hallo, mijn naam is Mitchell Cronenberg en ik ben verbonden aan het La Jolla Institute for Allergy and Immunology. Ik ben eigenlijk de president en wetenschappelijk directeur, maar ik heb ook een zeer actief onderzoekslaboratorium en dat is waar we het over zullen hebben: een van de technologieën die we gebruiken, namelijk CD 1D-tetrameren. Het grootste deel van het werk in mijn lab heeft betrekking op CD 1D-reactieve T-cellen.

En deze cellen zijn uniek omdat ze glycolipiden herkennen in plaats van peptiden. Een andere tak van mijn laboratorium houdt zich bezig met een geheel ander onderwerp, het mucosale immuunsysteem en de regulatie daarvan. CD1-moleculen zijn antigeenpresenterende moleculen, wat betekent dat ze antigenen of fragmenten van eiwitten of andere moleculen binden en deze presenteren voor herkenning door T-cellen.

Er zijn in feite twee verschillende soorten antigeenpresenterende moleculen. Er zijn moleculen die peptiden vasthouden of presenteren, en er zijn moleculen die lipiden en glycolipiden vasthouden. De CD1-moleculen houden lipiden en glycolipiden vast.

Dat is hun functie en zij ondersteunen of presenteren deze lipiden en glycolipiden aan T-cellen. Er zijn eigenlijk vier verschillende soorten CD1-moleculen: CD1A, B, C en D. We richten ons specifiek op CD1D; CD1D is waarschijnlijk het best bestudeerd, mede vanwege de beschikbaarheid van muismodellen. CD1D presenteert glycolipiden aan een specifiek type T-cel, genaamd de natural killer T-cel, een ongebruikelijke witte bloedcel die kenmerken heeft van zowel de aangeboren als de adaptieve immuunrespons.

De gepresenteerde glycolipiden kunnen eigen glycolipiden zijn, hoewel deze op dit moment nog niet zeer goed gekarakteriseerd zijn, of ze kunnen microbiële glycolipiden zijn. De glycolipiden waarvan we weten dat ze worden gepresenteerd, zijn afkomstig van twee bronnen. Ten eerste zijn er de zogenaamde FMS-bacteriën, die waarschijnlijk de meest voorkomende bacteriën in de biosfeer zijn.

Ze leven in de oceaan, ze leven in planten, ze leven in de bodem. Ze maken echter niet veel mensen ziek. Ik vermoed dat we er zeer aan gewend zijn om met deze bacteriën samen te leven.

En de tweede categorie die we kennen, een ander type glycolipide genaamd diacylglycerol-bevattende glycolipiden. Deze komen voor in Borrelia burgdorferi, die de ziekte van Lyme veroorzaakt, en waarschijnlijk in veel andere pathogenen. We zijn momenteel nog aan het ontdekken welke verschillende typen bacteriën deze glycolipiden hebben.

We hebben dus zogenaamde glycosphingolipiden van SMS en diacylglycerolipiden van Borrelia en waarschijnlijk veel andere die echt pathogeen zijn. Deze lipiden worden geladen op CD1D-moleculen op dendritische cellen, voornamelijk, hoewel het ook B-lymfocyten, ER-cellen in de lever en wellicht andere celtypen kunnen zijn. Deze CD1D-moleculen passeren lysosomen en endosomen waar ze deze lipiden waarschijnlijk binden, waarna ze het lipide naar het celoppervlak transporteren voor herkenning door T-cellen, waaronder de Natural Killer T-cellen die ik eerder noemde.

Een van de dingen die gebeuren wanneer u wordt blootgesteld aan een bacterie die glycolipiden bevat, is dat de NK T-cellen zeer snel worden geactiveerd. Conventionele T-cellen, oftewel peptide-reactieve T-cellen, hebben doorgaans drie of vier dagen nodig om een goede immuunrespons op gang te brengen, vooral als ze geen ervaring hebben met het antigeen.

Met andere woorden, ze zijn naïef. Daarentegen kunnen NK T-cellen binnen enkele uren worden geactiveerd en beginnen ze in een zeer korte tijd cytokines te produceren, zoals gamma-interferon, die belangrijk zijn voor de klaring van bacteriën. Op die manier vertonen ze kenmerken van de aangeboren immuunrespons uit het model.

Uit onderzoek naar modelantigenen weten we dat CD 1D terechtkomt in late endosomen en lysosomen, zeer zure intracellulaire compartimenten waar glycolipide-antigenen in CD 1 worden geladen; er zijn in feite speciale transfereiwitten aanwezig in antigeenpresenterende cellen, zoals dendritische cellen, die helpen bij het laden van de lipiden in het CD 1D-molecuul. Bij deze fona-bacteriën, borrelia-bacteriën en anderen hebben we te maken met extracellulaire bacteriën. De lipide-antigenen moeten dus op een of andere manier de cel in worden getransporteerd, waarschijnlijk naar een lysosoom, om daar in het CD 1-molecuul te worden geladen.

Vervolgens vindt er een onmiddellijke activering van de NKT-cel plaats en dit alles moet gebeuren binnen enkele uren in de sinusoïden, in de lever, in de milt, mogelijk in het beenmerg en op andere plaatsen waar NKT-cellen worden aangetroffen. De tetramere structuur is echt cruciaal voor het onambigüe definiëren van deze natural killer T-cellen, die deze aangeboren eigenschappen hebben die hen onderscheiden van andere T-cellen. De andere beschikbare markers zijn simpelweg te ambigu, maar deze tetrameren stellen u in staat de cellen te identificeren op basis van hun antigeenreceptorspecificiteit, wat op een bepaalde manier het sleutelfact is dat hen definieert; de vervaardiging van tetrameren gaat al ver terug.

Het werd uitgevonden door Mark Davis en John Alman, en het idee was dat de T-celreceptor een lage affiniteit heeft. Als je cellen wilt definiëren of identificeren op basis van hun specificiteit, hebben de peptiden die ze herkennen of de complexen van peptiden en antigeenpresenterende moleculen onvoldoende affiniteit of bindingssterkte om de cel te kunnen identificeren. Wat Mark Davis en John Alman vervolgens uitvonden, was deze tetrameertechnologie: een manier om tetrameren, en in sommige gevallen OCR's, te maken van het antigeenpresenterende molecuul plus het molecuul dat ze presenteren, wat in essentie de affiniteit van de interactie verhoogt. Hierdoor kun je de cel zien die specifiek is voor een grippeptide en een bepaald antigeenpresenterend molecuul, of welk antigeen er ook is waar je in geïnteresseerd bent.

Zeer belangrijke technologie omdat het u bijvoorbeeld in staat stelt om te zien hoe effectief een vaccinatieschema zou kunnen zijn. Wat we eind jaren negentig zijn begonnen, oorspronkelijk in een artikel dat in 2000 is gepubliceerd en inmiddels ongeveer 500 keer is geciteerd: we hebben die technologie simpelweg toegepast op lipiden.

We hebben dus oplosbare CD1-moleculen gemaakt en we waren, via methoden die ik zo direct zal beschrijven, in staat om deze te dimeriseren; met andere woorden, ze te dimeriseren en te koppelen aan specifieke glycolipiden. Op die manier konden we ze gebruiken als reagentia om specifieke T-celreceptoren aan te tonen, namelijk diegene die het glycolipide waar we in geïnteresseerd zijn in combinatie met CD1d herkennen. De tetrameren kunnen worden gebruikt in elke situatie waarin u het aantal NKT-cellen, hun activatietoestand en hun functie wilt analyseren.

En in ons laboratorium kan dit voortkomen uit een van de verschillende projecten. Wanneer u bijvoorbeeld wilt onderzoeken of een specifieke mutant en een signaleringsroute de ontwikkeling van NK T-cellen beïnvloeden, kunnen we dat met onze tetrameren doen door te kijken naar het aantal NKT-cellen. Daarnaast zijn er andere markers, andere celoppervlakte-eiwitten die we kunnen bestuderen om vast te stellen of de NKT-cellen matuur zijn of dat ze geactiveerd zijn. Door gebruik te maken van de tetrameren kunnen we na een antigenische stimulatie niet alleen vaststellen of ze geactiveerd zijn, maar ook welke cytokinen ze produceren.

We kunnen tetrameerkleuring combineren met bijvoorbeeld intracellulaire cytokinekleuring om met multiparameter flowcytometrie te bepalen welk percentage van de NKT-cellen interferon-gamma produceert, welk percentage IL-4 produceert en welk percentage beide produceert; we kunnen dus diverse vragen stellen over de cytokineproductie direct ex vivo door deze cellen. Daarnaast kunnen we verdere experimenten uitvoeren. Zo kunnen we de tetrameren gebruiken om NKT-cellen te zuiveren voor in vitro kweek om te onderzoeken hoe ze interageren met andere celtypen, of zelfs voor overdracht naar een recipientdier dat bijvoorbeeld om genetische redenen geen NKT-cellen heeft.

We willen die functie herstellen. Dat kunnen we doen en vervolgens onderzoeken waar de cellen zich vestigen en hoe ze functioneren. Tot slot weet ik dat mensen in het geval van menselijke NKT-cellen tetrameren hebben gebruikt om cellijnen in vitro uit te breiden, om cellen te kweken voor analytische doeleinden en potentieel zelfs voor therapeutische doeleinden.

We maken gebruik van een Bao-virusexpressiesysteem voor het genereren van CD 1D-tetrameren. Het proces begint met een gangbaar DNA-construct dat de promotor en de expressie van het β2-microglobuline en de CD 1D-zware keten bevat. Dit CD 1-molecuul is een heterodimeer van twee polypeptiden.

We maken gebruik van dit expressiesysteem met twee promotors en infecteren insecten-weefselkweekcellen met vao-virussen, die zorgvuldig zijn getitreerd zoals in ons kanaal is uitgelegd. Vervolgens infecteren we de cellen en oogsten we het door de cellen tot expressie gebrachte eiwit uit het weefselkweekmedium. De CD 1D zware keten is specifiek ontworpen voor de productie van tetrameren.

Er zijn twee dingen, of eigenlijk drie dingen die ik moet noemen, die we doen. Ten eerste verwijderen we het transmembraandeel. We brengen dus een oplosbaar eiwit tot expressie.

Ten tweede hebben we een hexa-histidine-tag toegevoegd, zodat het eiwit kan worden gezuiverd via metaalionchromatografie. En ten derde hebben we wat een biotinyleringsplaats voor enzymatische biotinylering wordt genoemd. En dit is de innovatie.

Het was van groot belang toen Davis en Alman voor het eerst de technologie voor de productie van tetrameren uitvonden. Nadat we het eiwit hebben geoogst, wordt het gezuiverd via nikkelkolomchromatografie. Soms voeren we daarna nog grootte-uitsluitingschromatografie uit.

Vervolgens kan het eiwit enzymatisch worden gebiotinyleerd en geïncubeerd; zodra het enzymatisch gebiotinyleerd is en wordt geïncubeerd met strep ab, zullen er tetrameren worden gevormd. Het oplosbare CD1-eiwit dat is verkregen, kan in principe gedurende de nacht worden geïncubeerd in een oplossing van een glycolipide van belang. Het is zeer belangrijk dat het glycolipide niet is opgelost in DMSO, wat gebruikelijk is als verdunner of oplosmiddel voor glycolipiden, omdat CD1 daar zeer gevoelig voor is.

Meestal gebruiken we een buffer die een kleine hoeveelheid Tween en PBS bevat. Deze buffer is zeer effectief voor het oplossen van de meeste van onze glycolipiden. Voor het laden in CD 1D, wat spontaan lijkt te gebeuren, gebruiken we streptavidine van diverse fabrikanten.

En wanneer dit wordt gekoppeld aan pe, fico, eryn of PC-phycocyanine-kleurstoffen, lijkt elk van deze zeer goed te werken en een zeer goede kleuring te geven. Over het algemeen is de procedure dus niet heel anders dan de goed gekarakteriseerde procedures voor het maken van MHC-klasse I-tetrameren, behalve dat we geen bacteriële expressie gebruiken, maar bacteriële virus-expressie, en we hebben natuurlijk lipide antigenen in plaats van peptiden. Eén punt dat ik wil benadrukken is dat mensen NK T-cellen hebben en dat deze dezelfde specificiteit hebben als de NK T-cellen van muizen.

De specificiteit bestaat dus al minstens 60 miljoen jaar, sinds we ons hebben afgesplitst van de knaagdieren, en we maken menselijke CD 1D-tetrameren overigens met dezelfde technieken als u in deze video kunt zien. In feite werken menselijke NK T-cellen zeer goed met muis-tetrameren en vice versa. Daarom maken we menselijke tetrameren niet zo vaak, simpelweg omdat we onze muis-tetrameren kunnen gebruiken voor onderzoek bij mensen.

Er zijn veel muismodellen waarin is aangetoond dat NK T-cellen kritieke determinanten zijn voor de uitkomst van de immuunrespons. Dit varieert van de respons op kanker en de regulatie van auto-immuunziekten tot de klaring van infectieuze agentia en zelfs de ontwikkeling van sclerotische plaques. Dat is een chronisch ontstekingsproces dat optreedt in de slagaders.

Er zijn enkele vragen over het belang van deze cellen bij mensen, waar ze minder overvloedig aanwezig zijn; er zijn veel rapporten die erop wijzen dat ze veranderd zijn bij auto-immuuntoestanden, en er zijn ook rapporten dat ze sterk verrijkt zijn in de longen van astmapatiënten. Hoewel dit rapport in the New England Journal of Medicine is gepubliceerd, bestaat daarover enige controverse. Maar er zijn een aantal studies bij mensen die suggereren dat deze cellen belangrijk zouden kunnen zijn.

Wat betreft klinische studies is de stimulatie van NKT-cellen getest in vier fase 1-studies bij patiënten met gevorderde kanker. Er zijn aanwijzingen voor werkzaamheid; uiteraard zijn deze patiënten zeer ziek en de studies lopen nog in verschillende soorten kanker. Er zijn mensen die geïnteresseerd zijn in het gebruik van NKT-celmediatherapie ook bij auto-immuunziekten, hoewel dat nog niet van de grond is gekomen.

Tetrameren kunnen in deze studies voornamelijk een rol spelen bij het analyseren van wat er met de NKT-cellen is gebeurd na de agonisttherapie. Het idee is doorgaans om glycolipide agonisten of in sommige gevallen zelfs glycolipide antagonisten te gebruiken, die door andere groepen worden ontwikkeld, afhankelijk van de respons en de conditie. Vervolgens wordt beoordeeld wat er met de NKT-cellen gebeurt, wat men normaal gesproken met tetrameren zou doen.

Een ander potentieel gebruik zou de in vitro expansie van humane NKT-cellen zijn. Het is zeer haalbaar en mogelijk om grote aantallen humane NKT-cellen in vitro te kweken door bijvoorbeeld antigenische stimulatie, wat kan worden gedaan met tetrameren of met cellen die over de juiste glycolipiden beschikken. In aanvulling op het gebruik van de tetrameer of de cellen, moeten er cytokinen worden toegevoegd.

Onder die omstandigheden kunnen grote aantallen menselijke NK T-cellen worden gekweekt. Daarnaast is er ten minste één groep in Boston die geïnteresseerd is in dat type therapie, in tegenstelling tot de glycolipidengebaseerde therapie. Een ander deel van mijn laboratorium houdt zich bezig met het bestuderen van mucosale immuniteit.

De meeste immunologen richten zich op de lymfocyten of witte bloedcellen in de lymfeklieren en de milt. Toch bevindt de meerderheid die in ons lichaam wordt aangetroffen zich waarschijnlijk in het darmslijmvlies, een plek waar we waarschijnlijk tussen de 10¹⁴ en 10¹⁵ bacteriën hebben. Vanuit een microbiologisch oogpunt zijn we dus grotendeels steriel, maar niet in onze darmen.

Ook in de darm bevindt zich een zeer grote verzameling witte bloedcellen. Deze cellen hebben unieke eigenschappen en zijn feitelijk nog onvoldoende bestudeerd. Daarom voeren we enkele fundamentele wetenschappelijke onderzoeken naar deze cellen uit.

Maar we bestuderen ook een proces van wat ik immuun-dysregulatie zou noemen, waarbij de darm leidt tot inflammatoire darmziekten. Dit zijn in feite immuunge medieerde ziekten van respectievelijk de dunne of dikke darm, die bekendstaan als de ziekte van Crohn of colitis ulcerosa. Hoewel we ook onderzoek bij mensen doen, vindt het grootste deel van ons werk plaats in muismodellen. We hebben wat ik beschouw als zeer goede muismodellen voor de dysregulatie van het mucosale immuunsysteem die leidt tot symptomen die lijken op de ziekte van Crohn.

We bestuderen dat proces en manieren om daarmee in te grijpen, in de hoop uiteindelijk betere therapieën te ontwikkelen voor patiënten die lijden aan deze immuun-gemedieerde ziekten. Ter conclusie kunnen we nadenken over de richting waarin de immunologie de komende 10 jaar zal bewegen, al is het werkelijk moeilijk om 10 jaar vooruit te kijken. Hoe verrassend dat ook mag klinken.

Ik denk dat het mucosale immuunsysteem eigenlijk een van de belangrijkste onontdekte gebieden van de immunologie is. Hoewel steeds meer mensen en steeds meer prominente onderzoeksgroepen geïnteresseerd raken in studies naar mucosale immunologie. Ik denk dat een ander gebied dat een enorme impact zal hebben de genetica is, en in het bijzonder de humane genetica; naarmate we overgaan naar, of liever gezegd, vorderen naar de sequentie van 1.000 menselijke genomen, zal het echt mogelijk worden om studies op individuen uit te voeren en te beoordelen hoe DNA-variabiliteit de immuunrespons beïnvloedt.

Op dit moment maken de meeste van de beste onderzoeken naar basispaden gebruik van knaagdieren. Knaagdieren, en in het bijzonder muizen, zijn essentieel voor onze studies. Maar ik denk dat we in de toekomst, wanneer we complexe auto-immuunfenomenen of andere processen bij individuen beschouwen, dit zullen kunnen doen op basis van menselijke genetische polymorfismen.

We zullen in staat zijn om de polymorfismen te beoordelen en die informatie vervolgens te gebruiken om te proberen te voorspellen hoe dit de immuunrespons zal beïnvloeden, om uiteindelijk toe te werken naar wat ik, en wat anderen, gepersonaliseerde immunotherapieën of, in bredere zin, gepersonaliseerde geneeskunde noemen. Genetica zal dus een enorme impact hebben. We beschikken al over uitstekende instrumenten in de muisgenetica.

We kunnen elk gewenst gen uitschakelen. We kunnen de expressie van genen in specifieke celtypen uitschakelen. We kunnen geweldige dingen bereiken.

Maar ik denk dat we ons in de toekomst zullen richten op het begrijpen van de immuunrespons en immuniteit vanuit het perspectief van menselijke reacties.