Name: Organische eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen voor robuuste proteoomzuivering vóór massaspectrometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Leer een op oplosmiddelen gebaseerde eiwitprecipitatiemethode voor robuuste proteoomzuivering vóór massaspectrometrie. Dit protocol maximaliseert eiwitterugwinning en zuiverheid in enkele minuten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. De auteurs bedanken Bioinformatics Solutions Inc. (Waterloo, Canada) en SPARC BioCentre (Molecular Analysis) van het Hospital for Sick Children (Toronto, Canada) voor hun bijdragen aan de verwerving van MS-gegevens.

1. Materiaaloverwegingen en monstervoorbereiding
<ol><li>Gebruik alleen oplosmiddelen met een hoge zuiverheidsgraad (aceton, chloroform, methanol) (>99,5%) en chemicaliën, vrij van overtollig vocht.</li>
	<li>Bereid natriumchloride- en zinksulfaatoplossingen (1 M) in water. OPMERKING: Zoutoplossingen kunnen voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur worden bewaard, zolang ze vrij zijn van verontreiniging of microbiële groei.</li>
	<li>Gebruik de kleinste polypropyleen (PP) microcentrifugeflacon die voldoende is om het vereiste volume monster en oplosmiddelen te behouden om precipitatie te induceren.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de SDS-concentratie in het te precipiteren monster niet hoger is dan 2% (g/v). Als de SDS hoger is, verdunt u het monster met water.</li>
	<li>Zorg voor een eiwitconcentratie tussen 0,01 en 10 g/l voor een optimale neerslagefficiëntie. OPMERKING: De optimale massa voor neerslag varieert tussen 1-100 μg eiwit.</li>
	<li>Zorg ervoor dat alle oplosmiddelen en oplossingen vrij zijn van deeltjes voor gebruik. Voer een filtratie (<0,5 μm) of centrifugatiestap (10.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur) uit om onopgeloste deeltjes te verwijderen.</li>
	<li>Als disulfidebindingsreductie en alkylering vereist zijn, voer deze stappen dan uit voorafgaand aan eiwitprecipitatie. Overtollige reducerende en alkylerende reagentia worden verwijderd door het precipitatieproces.</li>
	<li>Bespoedig de eiwitten door een van de protocollen te selecteren en uit te voeren (stap 2, 3, 4 of 5).</li>
</ol>2. Snelle (op injectieflacons gebaseerde) eiwitprecipitatie met aceton
<ol><li>Pipetteer 90 μL (deeltjesvrije) eiwit- of proteoomoplossing in een PP-microcentrifugebuis. Voeg vervolgens 10 μL van 1 M waterige NaCl toe. OPMERKING: Als de ionische sterkte van het proteoomextract al groter is dan 100 mM, is er geen extra zout nodig.</li>
	<li>Pipetteer 400 μL aceton in het monster. Sluit de injectieflacon af en tik zachtjes op de injectieflacon om de oplosmiddelen te combineren. Krachtig mengen is niet vereist. OPMERKING: Het volume van eiwitten, zout en aceton kan worden verhoogd zolang de relatieve verhouding van elk wordt gehandhaafd.</li>
	<li>Laat de injectieflacon ongestoord bij kamertemperatuur incuberen gedurende minimaal 2 minuten. OPMERKING: Langere incubaties, inclusief die bij lagere temperatuur (bijv. Conventionele acetonprecipitatie maakt gebruik van nachtelijke neerslag in de vriezer), kunnen leiden tot de vorming van grotere (zichtbare) geaggregeerde eiwitdeeltjes (figuur 1A), die over het algemeen de totale eiwitterugwinning niet verbeteren.</li>
	<li>Plaats na incubatie monsters in een centrifuge en noteer de oriëntatie van de injectieflacon. Draai minimaal 2 minuten, bij 10.000 x g of hoger bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Sluit de injectieflacon af en decanteer het supernatant voorzichtig door de injectieflacon langzaam om te keren naar een afvalcontainer. Raak de omgekeerde injectieflacon aan op een papieren handdoek om het resterende oplosmiddel uit de injectieflacon te halen. LET OP: Afvalmiddelen moeten worden bewaard en weggegooid volgens de juiste protocollen.</li>
	<li>Voor SDS-bevattende monsters moet u 400 μL verse aceton afgeven, waarbij u moet oppassen dat u de pellet niet verstoort. OPMERKING: Stap 2.6 is optioneel.<ol><li>Centrifugeer het monster onmiddellijk (10.000 x g of hoger gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur) en plaats de injectieflacon in dezelfde richting als de eerste spin in de rotor. Decanteer het wasmiddel zoals beschreven in stap 2.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Laat het monster volledig drogen met de dop open (~1 min). Vat de injectieflacon samen en ga verder met het oplossen van pellets (stap 6).</li>
</ol>3. Precipitatie van peptiden met laag molecuulgewicht (LMW) (ZnSO4 + aceton)
<ol><li>Doseer 54 μL proteoomextract aan een injectieflacon van 2 ml PP en voeg vervolgens 6 μL 1 M ZnSO4 toe. OPMERKING: Optimaal herstel van LMW-peptiden (≤5 kDa) wordt verkregen door aceton toe te voegen aan een laatste volumeprocent van 97. Uitgaande van een injectieflacon pp van 2 ml is het maximale initiële monstervolume 54 μl.</li>
	<li>Voeg 1940 μL aceton toe aan een laatste 97 volumeprocent. Draai zachtjes om te mengen en laat minimaal 2 minuten ongestoord op de benchtop staan.</li>
	<li>Centrifugeer (10.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur) en verwijder het supernatant door de injectieflacon om te keren en vervolgens de injectieflacon aan te raken op een papieren handdoek.</li>
	<li>Voor SDS-bevattende monsters moet u 400 μL verse aceton afgeven, waarbij u moet oppassen dat u de pellet niet verstoort. OPMERKING: Stap 3.4 is optioneel.<ol><li>Centrifugeer het monster onmiddellijk volgens stap 3.3 en plaats de injectieflacon in dezelfde richting als de eerste spin in de rotor. Decanteer het wasmiddel zoals beschreven in stap 3.3.</li>
	</ol></li>
	<li>Re-solubiliteer de resulterende droge pellet in een waterig oplosmiddel met korte vortexing of ultrasoonapparaat (~ 5 min).</li>
</ol>4. Eiwitprecipitatie door chloroform/methanol/water (CMW)
<ol><li>Doseer 100 μL van het eiwit of de proteoomoplossing in een injectieflacon PP. Voeg 400 μL methanol toe, gevolgd door 100 μL chloroform. Sluit de injectieflacon en vortex kort af om te mengen. OPMERKING: Voor CMW-neerslag heeft injectieflacons van 1,5 ml met smalle bodems de voorkeur (figuur 2A). LET OP: Chloroform-oplosmiddel moet in een geschikte ventilatiekap worden gehanteerd. Alle oplosmiddelen die in contact komen met chloroform moeten worden behandeld als gehalogeneerd afval wanneer ze worden verwijderd.</li>
	<li>Doseer snel 300 μL water rechtstreeks in het midden van de injectieflacon. Sluit de injectieflacon af. Laat het monster 1 minuut ongestoord op de benchtop zitten. OPMERKING: De oplossing ziet er onmiddellijk troebel wit uit. Vermijd het mengen van de injectieflacon na toevoeging van water.</li>
	<li>Plaats de injectieflacon PP in een centrifuge en draai gedurende minimaal 5 minuten (10.000 x g of hoger bij kamertemperatuur). OPMERKING: Eenmaal gecentrifugeerd, zullen zich twee zichtbare oplosmiddellagen vormen (bovenste laag = methanol / water; bodem = chloroform). Een vaste eiwitkorrel vormt zich op het oplosmiddelenoppervlak (figuur 2A).</li>
	<li>Gebruik een grote (1 ml) micropipettepunt en houd de injectieflacon op ~45° en verwijder ~700 μL van het oplosmiddel uit de bovenste laag met een uniforme snelheid.</li>
	<li>Gebruik een kleinere (200 μL) micropipettepunt om door te gaan met het verwijderen van de bovenste oplosmiddellaag uit de ~45° gekantelde injectieflacon. Pipetteer in één continue beweging totdat de bovenste oplosmiddellaag een kraal vormt in de injectieflacon.</li>
	<li>Voeg 400 μL verse methanol toe aan de monsterflacon, zonder de pellet te verstoren, door het oplosmiddel langs de zijkant van de injectieflacon af te geven.</li>
	<li>Sluit de injectieflacon af. Combineer de oplosmiddellagen door de injectieflacon voorzichtig te wiegen om de oplosmiddelen samen te draaien. OPMERKING: Het is essentieel om te voorkomen dat de pellet wordt verstoord. Draai de injectieflacon niet vortex.</li>
	<li>Let op de oriëntatie van de injectieflacon in de rotor, centrifugeer gedurende minimaal 10 minuten (10.000 x g bij kamertemperatuur). De eiwitpellet hecht zich aan de onderkant van de injectieflacon (figuur 2B).</li>
	<li>Zet de injectieflacon op 45°, met de pellet naar beneden gericht. Plaats de pipetpunt langs de bovenrand van de injectieflacon en verwijder het supernatant met een micropipettepunt van 1 ml met een langzame maar continue snelheid. Houd ~20 μL oplosmiddel in de injectieflacon.</li>
	<li>Was de eiwitkorrel voor SDS-bevattende monsters door langzaam 400 μL verse methanol af te geven. Draai de injectieflacon niet vortex.<ol><li>Ga direct verder met centrifugatie (10.000 x g gedurende 2 minuten bij temperatuur) en plaats de injectieflacon in de rotor met dezelfde oriëntatie als de initiële spin.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwijder het oplosmiddel volgens stap 4.9. Laat het monster in een rookkap aan de lucht drogen totdat het resterende oplosmiddel verdampt.</li>
	<li>Raadpleeg de aanbevolen resolubilisatieprocedures in stap 6.</li>
</ol>5. Eiwitprecipitatie met behulp van een wegwerpfiltratiepatroon
OPMERKING: Elk op oplosmiddelen gebaseerd precipitatieprotocol dat in stap 2-5 wordt beschreven, kan worden uitgevoerd in een tweetrapsfiltratie- en extractiepatroon (zie Materiaaltabel).
<ol><li>Met de plug bevestigd aan de bovenste filtratiecartridge (figuur 3A), doseer het gewenste volume van het geëxtraheerde proteoom, zout en oplosmiddel zoals beschreven in een van de drie onderstaande opties.<ol><li>(Optie 1) Voor eiwitprecipitatie met aceton combineert u 90 μL eiwit of proteoomoplossing, 10 μL 1 M waterige NaCl en 400 μL aceton. Incubeer minimaal 2 minuten op de benchtop. OPMERKING: Er zal een zichtbaar neerslag ontstaan voor geconcentreerde eiwitmonsters (1 g/l) (figuur 3B).</li>
		<li>(Optie 2) Combineer voor LMW-peptideprecipitatie 15 μL van het monster, 1,5 μL 1 M ZnSO4 en 485 μL aceton. Incubeer minimaal 2 minuten op de benchtop. OPMERKING: Een zoutconcentratie van 90 mM in het waterige monster heeft geen invloed op de terugwinning ten opzichte van de in stap 3 aanbevolen 100 mM.</li>
		<li>(Optie 3) Voeg voor CMW-precipitatie 50 μL proteoomextract, 200 μL methanol en 50 μL chloroform toe. Sluit de injectieflacon af en vortex kort om te combineren.<ol><li>Doseer snel 150 μL water rechtstreeks in het midden van de injectieflacon. Incubeer gedurende 1 minuut op de benchtop.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 2.500 x g bij kamertemperatuur met de plug nog steeds bevestigd aan de filtratiepatroon.</li>
	<li>Keer de cartridge om en schroef de stekker uit de cartridgebasis en verwijder deze.</li>
	<li>Plaats de filtratiepatroon in een schone injectieflacon en keer terug naar de centrifuge. Draai gedurende 3 minuten bij 500 x g bij kamertemperatuur. Gooi het doorstroomoplosmiddel uit de onderste injectieflacon weg. OPMERKING: Als er een oplosmiddel achterblijft in de bovenste filtratiepatroon, keer dan terug naar de centrifuge en voer een extra spin uit.</li>
	<li>Was de eiwitpellet door 400 μL aceton aan de filtratiepatroon toe te voegen (voor CMW-precipitatie, stap 5.1.3, voeg 400 μL methanol toe).</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 3 minuten bij 500 x g bij kamertemperatuur of totdat er geen oplosmiddel in de bovenste patroon achterblijft.</li>
	<li>Verzacht de neerslagkorrel opnieuw zoals beschreven in stap 6.</li>
</ol>6. Resolubilisatie van eiwitpellet
<ol><li>Maak het membraan aan de basis van de filtratiepatroon nat door 2-5 μL isopropanol rechtstreeks op het membraan af te geven onmiddellijk vóór de hieronder beschreven resolubilisatieprotocollen.</li>
	<li>Volg een van de volgende resolubilisatiemethoden.<ol><li>(Optie 1) Voeg minimaal 20 μL waterige buffer met ≥ 2% SDS toe aan de filtratiecartridge. Dop en vortex krachtig (~1 min). U kunt ook ultrasoonapparaat (>10 min) om de eiwitpellet te dispergeren.<ol><li>Verwarm het monster gedurende 5 minuten op 95 °C). Herhaal de mengstap na het verwarmen. OPMERKING: Laemmli gel laadbuffer kan de eiwitkorrel opnieuw oplossen. SDS-bevattende monsters zijn echter onverenigbaar met trypsinevertering en omgekeerde fase LC en MS.</li>
		</ol></li>
		<li>(Optie 2) Bereid een oplossing van 80% (v/v) mierenzuur in water. Prechill de zure oplossing (-20 °C), evenals de filtratiepatroon met neergeslagen eiwit.<ol><li>Doseer 50 μL koud mierenzuur in de patroon; dop en vortex gedurende 30 s. Terug naar de vriezer (-20 °C) gedurende 10 min.</li>
			<li>Vortex de cartridge opnieuw voor 30 s. Herhaal vervolgens de koel- en mengcyclus nog een keer (10 min, -20 °C, 30 s vortex).</li>
			<li>Voeg water toe aan een laatste 500 μL en verdun het mierenzuur tot 8%. OPMERKING: Het koude mierenzuurprotocol is onverenigbaar met de daaropvolgende trypsinevertering, maar is compatibel met LC-MS.</li>
		</ol></li>
		<li>(Optie 3) Voeg 50 μL vers bereid 8 M ureum in water toe aan de filterpatroon. Soniceer gedurende 30 minuten.<ol><li>Laat de patroon 1 uur (tot een nacht) incuberen op de benchtop.</li>
			<li>Verdun het ureum van 8 M minimaal 5 keer met water of een geschikte buffer. OPMERKING: Eenmaal verdund, is het ureumoplosbaarheidsprotocol compatibel met de daaropvolgende trypsinevertering, evenals LC-MS.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>7. Eiwitvertering
<ol><li>Voor bottom-up MS-analyse, onderwerp de opnieuw opgeloste eiwitten aan enzymatische spijsvertering met behulp van een van de twee onderstaande methoden.<ol><li>(Optie 1) Voor mierenzuurrelubilisatie verlaagt u het initiële volume van 80% mierenzuur in stap 6.2.2.1 tot 25 μL. Gebruik in stap 6.2.2.3 3 375 μL water om het mierenzuur te verdunnen tot 5% (v/v).</li>
		<li>Doseer pepsine in de patroon met een geschatte eiwit-enzymverhouding van 50:1. Met een plug bevestigd aan de filtratiecartridge, incubeer het monster 's nachts bij kamertemperatuur.</li>
	</ol></li>
	<li>(Optie 2) Voor resolubilisatie in ureum moet u zorgen voor een pH tussen 8 en 8,3 met inbegrip van 100 mM Tris of ammoniumbicarbonaat in stap 6.2.3.2.<ol><li>Voeg trypsine toe bij een geschatte verhouding tussen eiwit en enzymmassa van 50:1. Met een plug die aan de patroon is bevestigd, incubeer het monster een nacht in een warmwaterbad bij 37 °C.</li>
		<li>Beëindig de spijsvertering door de oplossing met 10% TFA te verzuren tot een laatste 1%.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstel het pepsine- of trypsine-verteerde eiwit door de plug van de basis van het filter te verwijderen en de patroon in een schone injectieflacon (2 min, 5000 x g, kamertemperatuur) te centrificeren.</li>
</ol>8. SPE opruimen
OPMERKING: Voor extra monsterontzouting na vertering of oplosmiddeluitwisseling kan het monster worden onderworpen aan omgekeerde fasereiniging zoals beschreven.
<ol><li>Primeer een SPE-patroon (zie materiaaltabel) door 300 μL methanol (2 min, 400 x g) door te geven, gevolgd door 300 μL 5% acetonitril/0,1% TFA (2 min, 400 x g).</li>
	<li>Sluit de geprimeerde SPE-cartridge aan op de basis van de filtratiecartridge met opnieuw opgelost of verteerd eiwit.</li>
	<li>Spin het eiwit door de SPE cartridge (5 min, 800 x g bij kamertemperatuur). Als er oplosmiddel in de bovenste patroon achterblijft, brengt u de patroon terug naar de centrifuge en herhaalt u de centrifuge. OPMERKING: Als u het monster een tweede keer door de SPE-cartridge laat gaan, kan het herstel worden verbeterd.</li>
	<li>Voeg 300 μL 5% acetonitril/0,1% TFA in water toe aan de patroon. Om te wassen, stroomt u door de SPE-cartridge (2 min, 2000 x g). Gooi de doorstroom weg.</li>
	<li>Voor LMW-eiwitten of verteerde peptiden elueert u het monster door 300 μL 50% acetonitril / 0,1% TFA (5 min, 2500 x g) te laten stromen.</li>
	<li>Volg voor intacte eiwitten stap 8,5 met een extra elutiestap met 300 μL van 75% acetonitril/0,1% TFA. Combineer de twee resulterende extracten. OPMERKING: Stap 8.6 is optioneel.</li>
</ol>

Het Doucette-laboratorium bedacht en patenteerde de ProTrap XG die in deze studie werd gebruikt. AAD is ook een van de oprichters van Proteoform Scientific, dat de monstervoorbereidingscartridge op de markt bracht.

Optimale MS-karakterisering wordt bereikt wanneer het resterende SDS onder 10 ppm wordt uitgeput. Terwijl alternatieve benaderingen, zoals FASP en on-bead digestion, kwantitatieve SDS-uitputting bieden met variabel herstel 31,32,33, is het primaire doel van neerslag om de zuiverheid en opbrengst tegelijkertijd te maximaliseren. Dit hangt af van het effectief isoleren van het supernatant (dat de SDS bevat) zonder de eiwitkorrel t...

Proteoomanalyse door massaspectrometrie is steeds rigoureuzer geworden, vanwege de verbeterde gevoeligheid, resolutie, scansnelheid en veelzijdigheid van moderne MS-instrumenten. Ms-vooruitgang draagt bij aan een grotere efficiëntie van eiwitidentificatie en nauwkeuriger kwantificering 1,2,3,4,5. Met verbeterde MS-instrumentatie eisen onderzoekers een overeenkomstig consistente front-end monstervoorbereidingsstrategie die in staat is tot kwantitatief herstel van zeer zuivere eiwitten in minimale tijd in alle stadia van de workflow 6,7,8,9,10,11 . Om de proteoomstatus van een biologisch systeem nauwkeurig weer te geven, moeten eiwitten op een efficiënte en onbevooroordeelde manier uit de inheemse monstermatrix worden geïsoleerd. Hiertoe zorgt het opnemen van een denaturerende oppervlakteactieve stof, zoals natriumdodecylsulfaat (SDS), voor efficiënte eiwitextractie en oplosbaarheid12. SDS interfereert echter sterk met elektrospray-ionisatie, waardoor ernstige MS-signaalonderdrukking ontstaat als het niet goed wordt geëlimineerd13.
Verschillende SDS-depletiestrategieën zijn beschikbaar voor daaropvolgende proteoomanalyse, zoals het vasthouden van eiwitten boven een moleculair gewichtsafsnijdingsfilter in wegwerpspinpatronen 14,15,16. De filterondersteunde monstervoorbereidingsmethode (FASP) heeft de voorkeur omdat het sds effectief onder 10 ppm uitput, waardoor optimale MS mogelijk wordt. Eiwitherstel met FASP is echter variabel, wat leidde tot de verkenning van andere technieken. Chromatografische benaderingen die selectief eiwitten (of oppervlakteactieve stoffen) vastleggen, zijn geëvolueerd naar verschillende handige cartridges of op kralen gebaseerde formaten 17,18,19,20,21. Gezien deze eenvoudige en (idealiter) consistente strategieën voor eiwitzuivering, wordt de klassieke benadering van eiwitprecipitatie met organische oplosmiddelen vaak over het hoofd gezien als een veelbelovende benadering van eiwitisolatie. Hoewel is aangetoond dat oplosmiddelprecipitatie SDS met succes onder kritieke niveaus uitput, is eiwitterugwinning al lang een zorg van deze aanpak. Meerdere groepen hebben een eiwitherstelbias waargenomen, met onaanvaardbaar lage neerslagopbrengsten als functie van eiwitconcentratie, molecuulgewicht en hydrofobiciteit 22,23. Vanwege de diversiteit aan neerslagprotocollen die in de literatuur worden gerapporteerd, werden gestandaardiseerde neerslagcondities ontwikkeld. In 2013 rapporteerden Crowell et al. voor het eerst de afhankelijkheid van ionische sterkte van de neerslagefficiëntie van eiwitten in 80% aceton24. Voor alle onderzochte eiwitten bleek de toevoeging van maximaal 30 mM natriumchloride essentieel om de opbrengsten te maximaliseren (tot 100% herstel). Meer recent toonden Nickerson et al. aan dat de combinatie van nog hogere ionische sterkte (tot 100 mM) met verhoogde temperatuur (20 °C) tijdens acetonprecipitatie bijna kwantitatief herstel gaf in 2-5 min25. Een lichte daling in het herstel van laagmoleculaire gewicht (LMW) eiwitten werd waargenomen. Daarom toonde een daaropvolgend rapport van Baghalabadi et al. de succesvolle terugwinning van LMW-eiwitten en peptiden (≤5 kDa) aan door specifieke zouten, met name zinksulfaat, te combineren met een hoger gehalte aan organisch oplosmiddel (97% aceton)26.
Terwijl het verfijnen van het neerslagprotocol een betrouwbaardere eiwitzuiveringsstrategie biedt voor op MS gebaseerde proteomics, is het succes van conventionele neerslag sterk afhankelijk van de gebruikerstechniek. Een primair doel van dit werk is om een robuuste precipitatiestrategie te presenteren die de isolatie van de eiwitpellet van het verontreinigende supernatant vergemakkelijkt. Een wegwerpfiltratiepatroon werd ontwikkeld om pipetteren te elimineren door geaggregeerd eiwit te isoleren boven een poreusPTFE-membraanfilter 27. MS-storende componenten in het supernatant worden effectief verwijderd in een korte, lage snelheid centrifugatiestap. Het wegwerpfilterpatroon biedt ook een verwisselbare SPE-cartridge, die het mogelijk maakt om monsters op te ruimen na resolubilisatie en optionele eiwitvertering, vóór massaspectrometrie.
Een reeks aanbevolen proteoomprecipitatieworkflows worden hier gepresenteerd, waaronder gemodificeerde aceton- en chloroform / methanol / water28-protocollen , in een conventioneel (op basis van flacons) en een semi-geautomatiseerd formaat in een wegwerp tweetoestandsfiltratie- en extractiepatroon. De resulterende eiwitterugwinningen en SDS-depletie-efficiënties worden benadrukt, samen met bottom-up LC-MS / MS-proteoomdekking, om de verwachte uitkomst van elk protocol aan te tonen. De praktische voor- en nadelen van elke aanpak worden besproken.

<table><tbody><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC177170010</td><td>&le;0,002 % aldehyde</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998-4</td><td>HPLC-kwaliteit</td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonaat</td><td>Millipore Sigma</td><td>A6141-1KG</td><td>vast</td></tr><tr><td>Bèta mercaptoethanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td>Moleculaire biologie kwaliteit</td></tr><tr><td>Bromofenolblauw</td><td>Millipore Sigma</td><td>B8026-5G</td><td>Bromofenolblauw natriumzout</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-400</td><td>Chloroform</td></tr><tr><td>Forminezuur</td><td>Honeywell</td><td>56302</td><td>Eluentadditief voor LC-MS</td></tr><tr><td>Fusion Lumos Mass Spectrometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>voor analyse van standaard eiwitmengsel</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Millipore Sigma</td><td>356352-1L-M</td><td>Voor moleculaire biologie, > 99%</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4641</td><td>HPLC-kwaliteit</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452SK-4</td><td>HPLC-kwaliteit</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-400-102</td><td>tot 21.000 xg</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisje (1,5 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-130</td><td>conische bodem</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisje (2 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-321</td><td>afgeronde bodem</td></tr><tr><td>Micropipettipjes (0,1-10 &micro;L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-197-28</td><td>Universele pipettip, niet-steriel</td></tr><tr><td>Micropipettipjes (1-200 &micro;L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-302</td><td>Universele pipettip, niet-steriel</td></tr><tr><td>Micropipettipjes (200-1000 &micro;L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-303</td><td>Universele pipettip, niet-steriel</td></tr><tr><td>Micropipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-710-903</td><td>Micropipet Trio-pakket</td></tr><tr><td>Pepsine</td><td>Millipore Sigma</td><td>P0525000</td><td>Gelyofiliseerd poeder, >3200 eenheden/ mg</td></tr><tr><td>ProTrap XG</td><td>Proteoform Scientific</td><td>PXG-0002</td><td>50 complete eenheden per doos</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888-1KG</td><td>ACS-reagens, >99 %</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28312</td><td>poedervormige vaste stof</td></tr><tr><td>timsTOF Pro Mass Spectrometer</td><td>Bruker</td><td></td><td>voor analyse van leverproteoomextract</td></tr><tr><td>Trifluorazijnzuur</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L06374.AP</td><td>99%</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>Moleculaire biologie kwaliteit</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Millipore Sigma</td><td>9002-07-7</td><td>Uit runderspeuzen, TPCK-behandeld</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Bio-Rad</td><td>1610731</td><td>vast</td></tr><tr><td>Water (de-ioniseerde)</td><td>Sartorius Arium Mini Waterzuiveringssysteem</td><td>76307-662</td><td>Type 1 ultrapuur (18,2 M&Omega; cm)</td></tr><tr><td>Zinksulfaat</td><td>Millipore Sigma</td><td>307491-100G</td><td>vast</td></tr></tbody></table>

organische eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen voor robuuste proteoomzuivering vóór massaspectrometrie

Organic Solvent-Based Protein Precipitation for Robust Proteome Purification Ahead of Mass Spectrometry

Hoewel meerdere ontwikkelingen in massaspectrometrie (MS) -instrumenten de kwalitatieve en kwantitatieve proteoomanalyse hebben verbeterd, zijn betrouwbaardere front-endbenaderingen om eiwitten te isoleren, verrijken en verwerken vóór MS van cruciaal belang voor succesvolle proteoomkarakterisering. Lage, inconsistente eiwitterugwinning en resterende onzuiverheden zoals oppervlakteactieve stoffen zijn schadelijk voor MS-analyse. Eiwitprecipitatie wordt vaak als onbetrouwbaar, tijdrovend en technisch uitdagend beschouwd om uit te voeren in vergelijking met andere monstervoorbereidingsstrategieën. Deze zorgen worden overwonnen door gebruik te maken van optimale eiwitprecipitatieprotocollen. Voor acetonprecipitatie is de combinatie van specifieke zouten, temperatuurregeling, oplosmiddelsamenstelling en precipitatietijd van cruciaal belang, terwijl de efficiëntie van chloroform / methanol / waterprecipitatie afhankelijk is van de juiste pipettering en flaconmanipulatie. Als alternatief zijn deze neerslagprotocollen gestroomlijnd en semi-geautomatiseerd in een wegwerpspincartridge. De verwachte resultaten van eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen in het conventionele formaat en met behulp van een wegwerp-, tweetrapsfiltratie- en extractiepatroon worden in dit werk geïllustreerd. Dit omvat de gedetailleerde karakterisering van proteomische mengsels door bottom-up LC-MS/MS-analyse. De superieure prestaties van sds-gebaseerde workflows worden ook aangetoond ten opzichte van niet-verontreinigde eiwitten.

Figuur 4 geeft een overzicht van de verwachte SDS-uitputting na injectieflacongebaseerde of patroongefaciliteerde precipitatie van eiwitten in een wegwerpfilterpatroon met behulp van aceton. Conventionele nachtelijke incubatie (-20 °C) in aceton wordt vergeleken met het snelle acetonprecipitatieprotocol bij kamertemperatuur (stap 2), evenals CMW-neerslag (stap 4). Residueel SDS werd gekwantificeerd door de methyleenblauwactieve stoffen (MBAS) assay29. In het kort werd...

Het huidige protocol beschrijft eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen onder gecontroleerde omstandigheden voor robuust en snel herstel en zuivering van proteoommonsters voorafgaand aan massaspectrometrie.

Organische eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen voor robuuste proteoomzuivering vóór massaspectrometrie

While multiple advances in mass spectrometry (MS) instruments have improved qualitative and quantitative proteome analysis, more reliable front-end ...

Deze protocollen zijn ontworpen om het herstel en de zuiverheid van eiwitten te maximaliseren door middel van op oplosmiddelen gebaseerde precipitatie. We gaan je een paar trucs laten zien om neerslag in flacons uit te voeren, evenals een semi-geautomatiseerde aanpak in een spincartridgeformaat. We hebben ook het neerslagprotocol geoptimaliseerd om consistent en snel te zijn.Het hele protocol duurt slechts een paar minuten. Deze protocollen tonen aan dat oplosmiddelprecipitatie van eiwitten ideaal is voor monstervoorbereiding voorafgaand aan massaspectrometrie. De protocollen passen naadloos in zowel bottom-up als top-down pro-workflows.Ziheng Dang en Victoria Miller, Senior scientist bij Proteoform Scientific in Halifax, Nova Scotia Pipette 90 microliter deeltjesvrije eiwitoplossing in een polypropyleen microcentrifugebuis, demonstreren voor ons vandaag. Voeg vervolgens 10 microliter van één mol waterig natriumchloride en 400 microliter aceton toe aan de monsteroplossing, dop en tik zachtjes op de injectieflacon om de oplosmiddelen te combineren. Laat de injectieflacon het uitbroeden.Kamertemperatuur ongestoord gedurende minimaal twee minuten na incubatie, centrifugeer de monsters met inachtneming van de oriëntatie van de injectieflacon en draai gedurende minimaal twee minuten bij 10.000 RCF of hoger bij kamertemperatuur. Na de centrifugatie wordt een zichtbare witte pellet waargenomen aan de onderkant van de buis. Maak op dit punt de buis los en decanteer het superaat in een afvalcontainer door de buis om te keren.Gebruik een papieren handdoek om eventuele resterende oplosmiddelen uit de injectieflacon te halen. Voor SDS met monsters. Doseer voorzichtig 400 microliter verse aceton zonder de pellet te verstoren.Centreer het monster onmiddellijk gedurende één minuut op 10.000 maal G of hoger bij kamertemperatuur door de injectieflacon in dezelfde richting als de eerste spin in de rotor te plaatsen. Tel het wasmiddel zoals eerder beschreven. Droog het monster met de dop open gedurende ongeveer één minuut.In een zuurkast, voor een pelletoplosbaarheid. Doseer 100 microliter van de eiwitoplossing in een polypropyleen injectieflacon. Voeg in de zuurkast een 400 microliter methanol toe, gevolgd door 100 microliter chloroform.Sluit de injectieflacon en vortex kort af om te mengen. Doseer snel 300 microliter water rechtstreeks in het midden van de injectieflacon. Sluit de injectieflacon af en laat deze een minuut ongestoord op het bankblad zitten, nadat u de polypropyleenflacon in een centrifuge hebt geplaatst en deze gedurende vijf minuten op 10.000 maal G of hoger bij kamertemperatuur hebt laten draaien.De injectieflacon heeft twee oplosmiddellagen en een zichtbare witte pellet tot de injectieflacon op ongeveer 45 graden. Verwijder ongeveer 700 microliter van het oplosmiddel uit de bovenste laag met een uniforme snelheid met behulp van een grote micropipetpunt van één milliliter in eerste instantie en later met een pipetpunt van 200 microliter totdat deze een kraal vormt in de injectieflacon. Voeg 400 microliter verse methanol toe aan de monsterflacon zonder de pellet te verstoren door het oplosmiddel langs de zijkant van de injectieflacon af te geven.Sluit de injectieflacon af en combineer de oplosmiddellagen door de injectieflacon voorzichtig te wiegen om de oplosmiddelen samen te draaien. Om de witte eiwitkorrel te observeren die de oriëntatie van de injectieflacon in de rotorcentrifuge noteert gedurende minimaal 10 minuten bij 10.000 keer G of hoger bij kamertemperatuur. Zet de injectieflacon schuin met de pellet naar beneden gericht.Plaats een pipetpunt langs de bovenrand van de injectieflacon en verwijder het supernatant met een micropipetpunt van één milliliter in een langzame maar uniforme snelheid. Met behoud van ongeveer 20 microliter oplosmiddel. Laat het resterende oplosmiddel drogen in de zuurkast.Om het eiwit neer te slaan. Bevestig met behulp van een wegwerpfiltratiepatroon de stekker aan de bovenste filtratiecartridge. Combineer 90 microliter eiwitoplossing 10 microliter van één mol aquas, natriumchloride en 400 microliter aceton.Incubeer gedurende minimaal twee minuten op de bovenkant van de bank, centrifugeer het bereide eiwitmonster met de plug nog steeds bevestigd aan de filtratiecartridge gedurende twee minuten bij 2.500 keer G.At kamertemperatuur, keer de patroon om en schroef los en verwijder de plug van de cartridgebasis. Plaats de filtratiepatroon in een schone injectieflaconcentrifugeer het eiwitmonster gedurende drie minuten bij 500 maal G bij kamertemperatuur. Gooi de stroom door oplosmiddel uit de onderste injectieflacon weg.Was de eiwitpellet door 400 microliter aceton aan de filtratiepatroon toe te voegen, centrifugeer gedurende drie minuten op 500 maal G bij kamertemperatuur of totdat er geen oplosmiddel in de bovenste patroon achterblijft. Volgens de eerder gedemonstreerde eiwitprecipitatieprotocollen. Relubiliteer het eiwit door het membraan aan de basis van de filtratiecartridge te bevochtigen door twee tot vijf microliter ISO-propanol rechtstreeks aan het membraan te geven onmiddellijk voordat u overgaat tot het oplosbaarheidsprotocol voor oplosbaarheid van de eiwitpellet bereid 80 volume-volume oplossing van mierenzuur in water.Koel deze zure oplossing af op min 20 graden Celsius en de filtratiepatroon met neergeslagen eiwit. Doseer 50 microliter koud verdund mierenzuur in de gekoelde cartridgedop en vortex gedurende 30 seconden. Breng de filtratiepatroon gedurende 10 minuten terug naar de vriezer bij min 20 graden Celsius.Herhaal de vorige vortex- en incubatiestappen. Voeg 450 microliter water toe aan een eindvolume van 500 microliter. Verdun het mierenzuur tot 8%Draai de patroon om, schroef de patroon los en verwijder de stekker uit de cartridgebasis en bevestig de SPE-cartridge aan de injectieflacon.Draai het eiwit door de SPE-patroon in een centrifuge bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten bij 800 maal G.Als het oplosmiddel in de bovenste patroon blijft, breng dan de patroon terug naar de centrifuge en herhaal de spin. Spoel door 300 microliter 5% acetonitril met 0,1% TFA in water aan de SPE-patroon toe te voegen, stroom gedurende twee minuten door de SPE-cartridge bij 2000 keer G.Voor eiwitten met een laag molecuulgewicht of verteerde peptiden elueert u het monster door 300 microliter te laten stromen. Een 50%acetonitril met 0,1% TFA gedurende vijf minuten bij 2.500 keer G.Voor intacte eiwitten.Volg met een extra elusiestap met behulp van 300 microliter 75% acetonitril met 0,1% trifluor ascetinezuur. Combineer de twee resulterende extracten. De figuur vergelijkt de SDS-uitputting na injectieflacon op basis van of precipitatie van eiwitten in een wegwerpfilterpatroon.Het gebruik van aceton met de conventionele rapid- en CMW-protocollen. Alle benaderingen verminderen SDS om optimale massaspectrometrie-analyse mogelijk te maken. Deze figuur toont kwantitatief eiwitherstel door snelle acetonprecipitatie en CMW-precipitatie te volgen door middel van SDS-paginaanalyse van een verwerkt gisttotaalcellysaat.Consistent herstel werd verkregen met alle neerslagprotocollen. Precipitatie in een wegwerpfiltratiepatroon elimineert de noodzaak om SDS met supernatant zorgvuldig te pipetteren met behoud van de geaggregeerde eiwitten boven een membraanfilter. Er werden dus geen zichtbare banden gedetecteerd in de supernatantfracties over drie onafhankelijke replicaties.De op cartridges gebaseerde eiwitprecipitatie toont een superieur herstel van een pepsine verteerd monster van runderplasma ten opzichte van precipitatie op basis van injectieflacons. Meer significante verschillen in opbrengst worden opgemerkt in de cartridge bij het gebruik van natriumchloride, terwijl het gebruik van zinkoplosmiddel resulteerde in de hoogste opbrengst. Dit cijfer kwantificeert de piekintensiteit van het peptide van elk peptidemonster met een verhouding boven één die een hogere peptide-abundantie weerspiegelt voor monsters die zijn verwerkt in de wegwerpfilterpatronen.De figuur vergelijkt het aantal geïdentificeerde peptiden per eiwit over de drie replicaat monsterpreparaten. De correlatiecoëfficiënten van 0,94 tot 0,95 in deze grafieken tonen de hoge consistentie aan van de monstervoorbereidingsbenadering voor bottom-up massaspectrometrieanalyse. Dus als die pellet eenmaal is gevormd, wil je echt voorkomen dat je hem stoort.Als je het als een intacte pellet bewaart, krijg je een hogere opbrengst. Vergeet dus niet om die pellet te wassen met extra aceton. Dit zorgt ervoor dat we het SDS verwijderen en ons monster zo schoon mogelijk houden en dat geeft ons de beste massaspectrometrie-analyse.Dus we ontdekten dat het verwijderen van het overtollige oplosmiddel door het om te keren een stuk eenvoudiger is dan proberen het monster te pipetteren. Je krijgt op deze manier consistentere opbrengsten. Het uitvoeren van acetonprecipitatie bij kamertemperatuur resulteerde in een consistenter en sneller herstel dan traditionele neerslag in de vriezer.

organic-solvent-based-protein-precipitation-for-robust-proteome

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Digitale Microfluidics is een techniek die gekenmerkt wordt door de manipulatie van discrete druppels (~ nL - ml) op een reeks van elektroden door de toepassing van elektrische velden. Het is goed geschikt voor het uitvoeren van een snelle, sequentiële, geminiaturiseerde geautomatiseerde biochemische assays. Hier melden wij een platform in staat is het automatiseren van een aantal proteoomanalyse processtappen.

Digitale Microfluidics voor Geautomatiseerde Proteoom verwerking

Wij presenteren een variatie van de QUICK (kwantitatieve Immunoprecipitatie combinatie met Knockdown) benadering die eerder werd onderscheid te maken tussen echte en valse eiwit-eiwit interacties. Onze aanpak is gebaseerd...

Een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling, Immunoprecipitatie, kwantitatieve Massaspectrometrie en Affiniteit Modulatie

Een gemeenschappelijke eiwitextractie protocol met behulp van ureum / thioureum / SDS buffer voor menselijke en muizen hersenweefsel maakt het identificeren van eiwitten door 2D-DIGE en de daaropvolgende karakterisering door mini 2DE immunoblotting. Deze methode maakt een meer reproduceerbare en betrouwbare resultaten te verkrijgen van menselijke biopsies en experimentele modellen.

Consensus Brain-afgeleide eiwit, Extraction Protocol voor de studie van mensen en muizen Brain Proteome behulp Zowel 2D-DIGE en Mini 2DE Immunoblotting

Stabiele isotoop labeling van peptiden door reductieve dimethylering (Redi etikettering) is een snelle, goedkope strategie voor nauwkeurige massa-spectrometrie gebaseerde kwantitatieve proteomics. Hier laten we een robuuste werkwijze voor de bereiding en analyse van eiwitmengsels met de Redi aanpak die kan worden toegepast op vrijwel elk type monster.

Kwantitatieve Proteomics behulp Reductieve dimethylering voor stabiele isotopen Labeling

De betrouwbaarheid van de resultaten in metabolomics experimenten afhankelijk van de effectiviteit en de reproduceerbaarheid van de monstervoorbereiding. Beschreven is een strenge en diepgaande methode die extractie van metabolieten van biologische vloeistoffen maakt met de mogelijkheid om later te analyseren tot duizenden verbindingen, of gewoon de verbinding klassen van belang.

Multi-step Voorbereiding Techniek om meerdere Metabolite Compound Klassen voor In-diepte en Informatieve Metabolomic Analyse Recover

Dit protocol is voor de extractie en concentratie van eiwitten en DNA uit microbiële biomassa die is verzameld uit zeewater, gevolgd door de generatie van tryptische peptiden die geschikt zijn voor proteomische analyse op basis van tandem massaspectrometrie.

Een Aquatic Microbial MetaProteomics Workflow: Van cellen tot Tryptic Peptiden geschikt voor Tandem massaspectrometrie-gebaseerde Analyse

Eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet interacties zijn cruciaal voor alle cellulaire functies. Hierin beschrijven we een protocol waarmee parallelle analyse van deze interacties met een eiwit van keuze. Ons protocol is geoptimaliseerd voor de plant celculturen en affiniteit zuivering combineert met massa spectrometrie gebaseerde eiwitten en metaboliet detectie.

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

Beschreven is een proteomica-workflow voor het identificeren van eiwit interactie partners uit een nucleaire subcellulaire fractie met behulp van immunoaffinity verrijking van een gegeven proteïne van belang en label-vrije massaspectrometrie. De workflow omvat subcellulaire fractionering, immunoprecipitatie, filter aided monstervoorbereiding, offline opruimen, massaspectrometrie, en een downstream bioinformatica pijpleiding.

Label-vrije Immunoprecipitation massaspectrometrie workflow voor grootschalige nucleaire interactome profilering

Het huidige protocol beschrijft de extractie van niet-eiwitaminozuren uit biologische matrices via trichloorazijnzuur (TCA) eiwitprecipitatie en zure hydrolyse vóór analyse met behulp van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie.

Extractie van niet-eiwit aminozuren uit cyanobacteriën voor vloeistofchromatografie- tandem massaspectrometrieanalyse

Dit protocol beschrijft een methode voor het verzamelen van traanmonsters met behulp van Schirmer-strips en een geïntegreerde kwantitatieve workflow voor het ontdekken van niet-invasieve traaneiwitbiomarkers. De workflow voor de voorbereiding van het suspensievangmonster maakt een snelle en robuuste traanmonstervoorbereiding en massaspectrometrische analyse mogelijk, wat resulteert in hogere peptideterugwinningsopbrengsten en eiwitidentificatie dan standaard procedures in de oplossing.

Een monstervoorbereiding voor het vangen van eiwitten voor traanproteomics door middel van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie

Hier stellen we een op massaspectrometrie gebaseerde proteomische methode op met behulp van geïsoleerde interessegebieden in formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties. Dit protocol wordt gebruikt om proteoom te analyseren van specifieke weefselgebieden in gearchiveerde, in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties.

Een gestroomlijnde aanpak voor proteomics op basis van massaspectrometrie met behulp van geselecteerde weefselregio's

Leer een op oplosmiddelen gebaseerde eiwitprecipitatiemethode voor robuuste proteoomzuivering vóór massaspectrometrie. Dit protocol maximaliseert eiwitterugwinning en zuiverheid in enkele minuten.

Organische eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen voor robuuste proteoomzuivering vóór massaspectrometrie

Meer video's verkennen