Organische eiwitprecipitatie op basis van oplosmiddelen voor robuuste proteoomzuivering vóór massaspectrometrie

Deze protocollen zijn ontworpen om het herstel en de zuiverheid van eiwitten te maximaliseren door middel van op oplosmiddelen gebaseerde precipitatie. We gaan je een paar trucs laten zien om neerslag in flacons uit te voeren, evenals een semi-geautomatiseerde aanpak in een spincartridgeformaat. We hebben ook het neerslagprotocol geoptimaliseerd om consistent en snel te zijn.

Het hele protocol duurt slechts een paar minuten. Deze protocollen tonen aan dat oplosmiddelprecipitatie van eiwitten ideaal is voor monstervoorbereiding voorafgaand aan massaspectrometrie. De protocollen passen naadloos in zowel bottom-up als top-down pro-workflows.

Ziheng Dang en Victoria Miller, Senior scientist bij Proteoform Scientific in Halifax, Nova Scotia Pipette 90 microliter deeltjesvrije eiwitoplossing in een polypropyleen microcentrifugebuis, demonstreren voor ons vandaag. Voeg vervolgens 10 microliter van één mol waterig natriumchloride en 400 microliter aceton toe aan de monsteroplossing, dop en tik zachtjes op de injectieflacon om de oplosmiddelen te combineren. Laat de injectieflacon het uitbroeden.

Kamertemperatuur ongestoord gedurende minimaal twee minuten na incubatie, centrifugeer de monsters met inachtneming van de oriëntatie van de injectieflacon en draai gedurende minimaal twee minuten bij 10.000 RCF of hoger bij kamertemperatuur. Na de centrifugatie wordt een zichtbare witte pellet waargenomen aan de onderkant van de buis. Maak op dit punt de buis los en decanteer het superaat in een afvalcontainer door de buis om te keren.

Gebruik een papieren handdoek om eventuele resterende oplosmiddelen uit de injectieflacon te halen. Voor SDS met monsters. Doseer voorzichtig 400 microliter verse aceton zonder de pellet te verstoren.

Centreer het monster onmiddellijk gedurende één minuut op 10.000 maal G of hoger bij kamertemperatuur door de injectieflacon in dezelfde richting als de eerste spin in de rotor te plaatsen. Tel het wasmiddel zoals eerder beschreven. Droog het monster met de dop open gedurende ongeveer één minuut.

In een zuurkast, voor een pelletoplosbaarheid. Doseer 100 microliter van de eiwitoplossing in een polypropyleen injectieflacon. Voeg in de zuurkast een 400 microliter methanol toe, gevolgd door 100 microliter chloroform.

Sluit de injectieflacon en vortex kort af om te mengen. Doseer snel 300 microliter water rechtstreeks in het midden van de injectieflacon. Sluit de injectieflacon af en laat deze een minuut ongestoord op het bankblad zitten, nadat u de polypropyleenflacon in een centrifuge hebt geplaatst en deze gedurende vijf minuten op 10.000 maal G of hoger bij kamertemperatuur hebt laten draaien.

De injectieflacon heeft twee oplosmiddellagen en een zichtbare witte pellet tot de injectieflacon op ongeveer 45 graden. Verwijder ongeveer 700 microliter van het oplosmiddel uit de bovenste laag met een uniforme snelheid met behulp van een grote micropipetpunt van één milliliter in eerste instantie en later met een pipetpunt van 200 microliter totdat deze een kraal vormt in de injectieflacon. Voeg 400 microliter verse methanol toe aan de monsterflacon zonder de pellet te verstoren door het oplosmiddel langs de zijkant van de injectieflacon af te geven.

Sluit de injectieflacon af en combineer de oplosmiddellagen door de injectieflacon voorzichtig te wiegen om de oplosmiddelen samen te draaien. Om de witte eiwitkorrel te observeren die de oriëntatie van de injectieflacon in de rotorcentrifuge noteert gedurende minimaal 10 minuten bij 10.000 keer G of hoger bij kamertemperatuur. Zet de injectieflacon schuin met de pellet naar beneden gericht.

Plaats een pipetpunt langs de bovenrand van de injectieflacon en verwijder het supernatant met een micropipetpunt van één milliliter in een langzame maar uniforme snelheid. Met behoud van ongeveer 20 microliter oplosmiddel. Laat het resterende oplosmiddel drogen in de zuurkast.

Om het eiwit neer te slaan. Bevestig met behulp van een wegwerpfiltratiepatroon de stekker aan de bovenste filtratiecartridge. Combineer 90 microliter eiwitoplossing 10 microliter van één mol aquas, natriumchloride en 400 microliter aceton.

Incubeer gedurende minimaal twee minuten op de bovenkant van de bank, centrifugeer het bereide eiwitmonster met de plug nog steeds bevestigd aan de filtratiecartridge gedurende twee minuten bij 2.500 keer G.At kamertemperatuur, keer de patroon om en schroef los en verwijder de plug van de cartridgebasis. Plaats de filtratiepatroon in een schone injectieflaconcentrifugeer het eiwitmonster gedurende drie minuten bij 500 maal G bij kamertemperatuur. Gooi de stroom door oplosmiddel uit de onderste injectieflacon weg.

Was de eiwitpellet door 400 microliter aceton aan de filtratiepatroon toe te voegen, centrifugeer gedurende drie minuten op 500 maal G bij kamertemperatuur of totdat er geen oplosmiddel in de bovenste patroon achterblijft. Volgens de eerder gedemonstreerde eiwitprecipitatieprotocollen. Relubiliteer het eiwit door het membraan aan de basis van de filtratiecartridge te bevochtigen door twee tot vijf microliter ISO-propanol rechtstreeks aan het membraan te geven onmiddellijk voordat u overgaat tot het oplosbaarheidsprotocol voor oplosbaarheid van de eiwitpellet bereid 80 volume-volume oplossing van mierenzuur in water.

Koel deze zure oplossing af op min 20 graden Celsius en de filtratiepatroon met neergeslagen eiwit. Doseer 50 microliter koud verdund mierenzuur in de gekoelde cartridgedop en vortex gedurende 30 seconden. Breng de filtratiepatroon gedurende 10 minuten terug naar de vriezer bij min 20 graden Celsius.

Herhaal de vorige vortex- en incubatiestappen. Voeg 450 microliter water toe aan een eindvolume van 500 microliter. Verdun het mierenzuur tot 8%Draai de patroon om, schroef de patroon los en verwijder de stekker uit de cartridgebasis en bevestig de SPE-cartridge aan de injectieflacon.

Draai het eiwit door de SPE-patroon in een centrifuge bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten bij 800 maal G.Als het oplosmiddel in de bovenste patroon blijft, breng dan de patroon terug naar de centrifuge en herhaal de spin. Spoel door 300 microliter 5% acetonitril met 0,1% TFA in water aan de SPE-patroon toe te voegen, stroom gedurende twee minuten door de SPE-cartridge bij 2000 keer G.Voor eiwitten met een laag molecuulgewicht of verteerde peptiden elueert u het monster door 300 microliter te laten stromen. Een 50%acetonitril met 0,1% TFA gedurende vijf minuten bij 2.500 keer G.Voor intacte eiwitten.

Volg met een extra elusiestap met behulp van 300 microliter 75% acetonitril met 0,1% trifluor ascetinezuur. Combineer de twee resulterende extracten. De figuur vergelijkt de SDS-uitputting na injectieflacon op basis van of precipitatie van eiwitten in een wegwerpfilterpatroon.

Het gebruik van aceton met de conventionele rapid- en CMW-protocollen. Alle benaderingen verminderen SDS om optimale massaspectrometrie-analyse mogelijk te maken. Deze figuur toont kwantitatief eiwitherstel door snelle acetonprecipitatie en CMW-precipitatie te volgen door middel van SDS-paginaanalyse van een verwerkt gisttotaalcellysaat.

Consistent herstel werd verkregen met alle neerslagprotocollen. Precipitatie in een wegwerpfiltratiepatroon elimineert de noodzaak om SDS met supernatant zorgvuldig te pipetteren met behoud van de geaggregeerde eiwitten boven een membraanfilter. Er werden dus geen zichtbare banden gedetecteerd in de supernatantfracties over drie onafhankelijke replicaties.

De op cartridges gebaseerde eiwitprecipitatie toont een superieur herstel van een pepsine verteerd monster van runderplasma ten opzichte van precipitatie op basis van injectieflacons. Meer significante verschillen in opbrengst worden opgemerkt in de cartridge bij het gebruik van natriumchloride, terwijl het gebruik van zinkoplosmiddel resulteerde in de hoogste opbrengst. Dit cijfer kwantificeert de piekintensiteit van het peptide van elk peptidemonster met een verhouding boven één die een hogere peptide-abundantie weerspiegelt voor monsters die zijn verwerkt in de wegwerpfilterpatronen.

De figuur vergelijkt het aantal geïdentificeerde peptiden per eiwit over de drie replicaat monsterpreparaten. De correlatiecoëfficiënten van 0,94 tot 0,95 in deze grafieken tonen de hoge consistentie aan van de monstervoorbereidingsbenadering voor bottom-up massaspectrometrieanalyse. Dus als die pellet eenmaal is gevormd, wil je echt voorkomen dat je hem stoort.

Als je het als een intacte pellet bewaart, krijg je een hogere opbrengst. Vergeet dus niet om die pellet te wassen met extra aceton. Dit zorgt ervoor dat we het SDS verwijderen en ons monster zo schoon mogelijk houden en dat geeft ons de beste massaspectrometrie-analyse.

Dus we ontdekten dat het verwijderen van het overtollige oplosmiddel door het om te keren een stuk eenvoudiger is dan proberen het monster te pipetteren. Je krijgt op deze manier consistentere opbrengsten. Het uitvoeren van acetonprecipitatie bij kamertemperatuur resulteerde in een consistenter en sneller herstel dan traditionele neerslag in de vriezer.