Name: Elektrofysiologische methoden voor het meten van fotopigmentniveaus in Drosophila-fotoreceptoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Leer elektrofysiologische methoden om fotopigmentniveaus te meten in Drosophila-fotoreceptoren. Dit protocol detecteert subtiele afwijkingen in fototransductie en is ideaal voor genetische screening van visuele mutaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Israel Science Foundation (ISF) en de United States-Israel Binational Science Foundation (BSF). Wij danken de heer Anatoly Shapochnikov voor de bouw van de wasfilamentkachel.

1. Het meten van de intensiteitsresponsrelatie, langdurige depolariserende afterpotentiële (PDA) en de vroege receptorpotentiaal (ERP) met behulp van het elektroretinogram
<ol><li>Geschikte opfokomstandigheden voor D. melanogaster bereiding<ol>
<li>Raise D. melanogaster vliegt in flessen met standaard gele maïs bevattend voedsel in een incubator die op een temperatuur van 24 °C wordt gehouden en in een 12 uur donkere/lichte cyclus</li>
		<li>Houd de vliegenflessen ten minste 24 uur voorafgaand aan het experiment in het donker.</li>
	</ol></li>
	<li>Algemene installatie<ol>
<li>Bereid opnamepipetten voor door 1 mm x 0,58 mm (O.D x I.D) met vezels gevulde borosilicaatglascapillairen te trekken (figuur 6L, O). De weerstand van de pipetten moet 5-10 MΩ zijn; elke geschikte trekker kan worden gebruikt.</li>
		<li>Bekleed twee zilveren draden met AgCl2 en steek 0,25 mm zilverdraad in een 3 M KCl-oplossing die is aangesloten op een op maat gemaakte 5 V-voeding.</li>
		<li>Steek elke gecoate zilverdraad in de elektrodehouders (figuur 6N).</li>
		<li>Vul het glazen capillair met gefilterde Ringer's oplossing (zie tabel 1) met een langwerpige tipspuit (figuur 6M).</li>
		<li>Steek de draadelektrode in het glazen capillair. Zorg ervoor dat de oplossing in het capillair in contact komt met de zilverdraad.</li>
		<li>Plaats de elektrodehouders (figuur 7P, N) in de twee elektrodemicromanipators (figuur 7G).</li>
	</ol></li>
	<li>Procedure voor het voorbereiden van de vlieg op elektrische opnames OPMERKING: Om de vlieg onder aan het donker aangepaste omstandigheden te houden, gebruikt u alleen gedimde rode lichtverlichting tijdens de volgende stappen.<ol>
<li>Verdoof de vliegen in de fles met CO2-gas met behulp van het vliegenslapersysteem (figuur 6A, B) en giet ze in de slaapcontainer.</li>
		<li>Kies één vlieg en houd hem voorzichtig bij zijn vleugel met een scherp pincet. Bedek de rest van de vliegen met een petrischaaltje.</li>
		<li>Plaats de vlieg op de vlieghouder in de juiste richting liggend op zijn kant, met zijn rug naar de hand (figuur 6P).</li>
		<li>Zet de voeding van de soldeerbout AAN. Stel de stroom in op ~2,25 A. Deze stroom moet de 0,25 mm platina-iridiumfilament verwarmen tot ~55-56 °C (zie Aanvullend bestand).</li>
		<li>Plaats een druppel was met een lage smelttemperatuur (~55-56 °C) op de soldeerbout (figuur 6F).</li>
		<li>Til de vlieg met een pincet van zijn vleugels en bevestig zijn vleugels aan de vlieghouder (figuur 6I) met behulp van de soldeerbout.</li>
		<li>Verbind met behulp van de soldeerbout de rug van de vlieg met was op het standaardoppervlak (figuur 6P).</li>
		<li>Laat de punt van de soldeerbout op het verbindingspunt van de poten zakken en smelt de was om alle poten samen te bedekken (figuur 6P).</li>
		<li>Plaats een kleine druppel was tussen het hoofd en de rug in het nekgebied (figuur 6P). OPMERKING: Wees extra voorzichtig om oververhitting van de vliegenkop te voorkomen. Zorg ervoor dat de vlieg goed is gefixeerd en niet in staat is om te bewegen tijdens het experiment; kleine bewegingen kunnen artefacten in de opnames creëren. Zorg ervoor dat de luchtpijpopeningen (ademhalingsinlaten) in de thorax en buik niet bedekt zijn met was.</li>
		<li>Plaats de vliegenhouder (figuur 7Q) in een donkere kooi van Faraday op een magneetblok (figuur 7I) en zorg ervoor dat de vlieg zich op ~5 mm van het uiteinde van de lichtgeleider bevindt (figuur 7L).</li>
		<li>Plaats de opname-elektrode (figuur 7P) boven het oog van de vlieg en de grondelektrode (figuur 7N) over de bovenrug van de vlieg met behulp van de micromanipulators.</li>
		<li>Plaats de grondelektrode in de achterkant van de vlieg met behulp van de micromanipulators.</li>
		<li>Plaats de opname-elektrode in de buitenste periferie van het oog van de vlieg, bij voorkeur met behulp van de micromanipulators. OPMERKING: Na het inbrengen van de elektrode in het oog, zal een klein kuiltje worden waargenomen; trek de elektrode naar boven zonder deze uit het oog te verwijderen totdat het kuiltje verdwijnt. De elektroden kunnen ook worden ondergedompeld in kleine druppeltjes elektrodegelei die op de romp en het oog worden aangebracht.</li>
	</ol></li>
	<li>Intensiteit-respons protocol<ol>
<li>Plaats een oranje filter (590 edge filter) voor de hogedruk Xenon lamp. Gebruik een groot (zes ordes van grootte) dempend ND-filter (neutral density).</li>
		<li>Wacht 60 s in het donker en geef een 5 s lichtpuls.</li>
		<li>Vervang het ND-filter door een minder dempend ND-filter in stappen van één orde van grootte.</li>
		<li>Wacht 60 s in het donker en geef een tweede 5 s lichtpuls.</li>
		<li>Herhaal stap 1.4.1.-1.4.4, waarbij de lichtintensiteit geleidelijk wordt verhoogd met minder dempende ND-filters (de laatste puls moet worden gegenereerd zonder ND-filter). Zorg ervoor dat u de reeks ND-filters in de juiste richting gebruikt, beginnend bij grote demping en het bereiken van lage demping.</li>
	</ol></li>
	<li>PDA-protocol (dit protocol kan alleen worden uitgevoerd op witoogvliegen)<ol>
<li>Geef een 5 s lichtpuls van maximale intensiteit met behulp van een oranje filter (590 rand filter, om maximaal fotopigment om te zetten naar de R-toestand).</li>
		<li>Vervang het oranje filter door een breedband blauw (BP450/40 nm) filter en geef drie 5 s lichtpulsen op maximale intensiteit. OPMERKING: Het is ook mogelijk om een lange continue maximale intensiteit blauwe lichtpuls te geven totdat een steady-state spanningsrespons is bereikt.</li>
		<li>Wacht 60 s in het donker, vervang het blauwe filter door het vorige oranje filter en geef twee 5 s lichtpulsen met intervallen van 60 s.</li>
	</ol></li>
	<li>ERP/M-potentiaalprotocol voor het meten van het foto-evenwichtsspectrum van M (dit protocol kan alleen worden uitgevoerd op witoogvliegen10,25)<ol>
<li>Geef een continue blauwe (bandpass (BP) 450/40 nm) lichtpuls totdat een steady-state spanningsrespons wordt bereikt, die de maximale hoeveelheid fotopigment van de R-toestand omzet in de M-toestand van R1-6-cellen.</li>
		<li>Geef een korte (<3 ms) intense lichtflits van een golflengte tussen 350-700 nm (het bekende absorptiespectrum van R1-6 cellen fotopigment) met behulp van smalle (~ 20 nm) bandpassfilters en meet de piekamplitude van de M1-fase van de M-potentiaalrespons (die de metarhodopsineabsorptie bij deze specifieke golflengte bij foto-evenwicht 10,25 weerspiegelt). OPMERKING: Voor synchrone activering van een grote pool van fotopigmentmoleculen is een korte, intense lichtflits vereist, zodat het fotonengehalte in korte tijd wordt verpakt. De M-potentiaal bestaat uit twee componenten: M1 (corneanegatieve fase), die de ladingsverplaatsing van de metarhodopsine in de fotoreceptor weerspiegelt, en M2 (corneapositieve fase11,33), die de versterkte M1-respons van de fotoreceptoren in de lamina 9,10,11 weerspiegelt . Elk van deze componenten kan worden geïdentificeerd en gemeten. Het verdient echter de voorkeur om de M1-potentiaal te meten, omdat het een directe lineaire manifestatie is van de M-niveaus. Als M2 wordt gebruikt, zorg er dan voor dat de amplitude binnen het lineaire bereik ligt door milde carotenoïde deprivatie24,25 te gebruiken.</li>
		<li>Geef opnieuw een continue blauwe (BP450/40 nm) lichtpuls, gevolgd door een korte (<1 ms) intense lichtflits van een andere golflengte.</li>
		<li>Herhaal dit protocol totdat het volledige absorptiespectrum van M bij foto-evenwicht is gedekt.</li>
	</ol></li>
</ol>2. ERC-protocol voor het meten van het actiespectrum van R- en de M-toestanden van R1-6-cellen met behulp van spanningsklemregistraties voor hele cellen
OPMERKING: Voor een gedetailleerd protocol voor het gebruik van spanningsklemopnamen voor hele cellen, zie Katz et al.34. De M-potentiaal gebruikt de ERG alleen om de activering van de M-toestand te meten omdat de bijdrage van de R-toestand wordt onderdrukt door de membraancapaciteit. Daarentegen meet de ERC de activering van zowel R (positieve ERC) als M (negatieve ERC) toestanden omdat spanning-klemregistraties het effect van membraancapaciteit wegnemen (zie inleiding).
<ol><li>Converteer het fotopigment naar de gewenste toestand (R of M). Voor R naar M conversie, eerst, pas de vliegen aan door een korte (<1 ms) adaptieve blauwe (BP450/40 nm) flits. Geef voor M naar R-conversie een korte adaptieve oranje (OG590 edge filter) flitser.</li>
	<li>Geef een korte lichtflits (<1 ms) van een golflengte tussen 350-700 nm en meet de maximale negatieve of positieve amplitude van de ERC-respons, die de M/R-absorptie op deze specifieke golflengte weerspiegelt. OPMERKING: Voor synchrone activering van een grote pool van fotopigmentmoleculen is een korte, intense lichtflits vereist om het fotonengehalte in korte tijd te verpakken. De maximale fotopigmentconversie van R naar M door blauwe flits kan ~80% van de totale fotopigmentmoleculen bereiken vanwege de overlap in het absorptiespectrum van R en M (figuur 3A). Daarom heeft de ERC bij golflengten onder ~550 nm twee componenten: een negatieve fase die de respons van de metarhodopsine weerspiegelt en een positieve fase die de respons van de resterende rhodopsine weerspiegelt. De ERC is lineair afhankelijk van de lichtintensiteit (figuur 5D). Om de spectrale gevoeligheid van R- en M-toestanden af te leiden, moet elke fase van de ERC worden genormaliseerd op de verschillende golflengten voor gelijke energie29.</li>
	<li>Herhaal stap 2.1.-2.2. met behulp van flitsen van verschillende golflengten.</li>
	<li>Plot de genormaliseerde positieve en negatieve ERC als functie van de golflengte. OPMERKING: De sterke lichtflits induceert een enorme stroom door de lichtgevoelige kanalen, wat leidt tot metabole stress op de fotoreceptor, wat op zijn beurt lichtonafhankelijke kanaalopening veroorzaakt. De ERC wordt over deze constitutieve stroom heen gelegd.</li>
</ol>

<ol><li>Vogt, K., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+identity+of+the+chromophores+of+fly+visual+pigment%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Chemical identity of the chromophores of fly visual pigment.</a> Naturwissenschaften. 77, 211-213 (1984).</li>
<li>Hillman, P., Hochstein, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+in+invertebrate+photoreceptors%3A+role+of+pigment+bistability%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Transduction in invertebrate photoreceptors: role of pigment bistability.</a> Physiological Reviews. 63 (2), 668(1983).</li>
<li>Hamdorf, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHamdorf%2C+K+%22Handbook+of+Sensory+Physiology.+Comparative+Physiology+and+Evolution+of+Vision+in+Invertebrates%22">Handbook of Sensory Physiology. Comparative Physiology and Evolution of Vision in Invertebrates</a>. Autrum, H. 7, Springer-Verlag. 145-224 (1979).</li>
<li>Gagné, S., Roebroek, J. G., Stavenga, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enigma+of+early+receptor+potential+in+fly+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Enigma of early receptor potential in fly eyes.</a> Vision Research. 29 (12), 1663-1670 (1989).</li>
<li>Pak, W. L., Shino, S., Leung, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDA+%28prolonged+depolarizing+afterpotential%29-defective+mutants%3A+the+story+of+nina%27s+and+ina%27s--pinta+and+santa+maria%2C+too%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">PDA (prolonged depolarizing afterpotential)-defective mutants: the story of nina's and ina's--pinta and santa maria, too.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 216-237 (2012).</li>
<li>Wang, X., Wang, T., Jiao, Y., von, L. J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+an+enzymatic+visual+cycle+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Requirement for an enzymatic visual cycle in Drosophila.</a> Current Biology. 20 (2), 93-102 (2010).</li>
<li>Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+in+vision+research.+The+Friedenwald+lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Drosophila in vision research. The Friedenwald lecture.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).</li>
<li>Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPak%2C+WL+%22Neurogenetics%2C+Genetic+Approaches+to+the+Nervous+System%22">Neurogenetics, Genetic Approaches to the Nervous System</a>. Breakfield, X. , Elsevier, North-Holland. 67-99 (1979).</li>
<li>Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+reduction+in+excitation+efficiency+in+the+trp+mutant+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Light-induced reduction in excitation efficiency in the trp mutant of Drosophila.</a> The Journal of General Physiology. 79, 361-385 (1982).</li>
<li>Minke, B., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+electrical+potentials+arising+from+activation+of+metarhodopsin+in+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fast electrical potentials arising from activation of metarhodopsin in the fly.</a> The Journal of General Physiology. 75 (4), 381-402 (1980).</li>
<li>Stephenson, R. S., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogenic+components+of+a+fast+electrical+potential+in+Drosophila+compound+eye+and+their+relation+to+visual+pigment+photoconversion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Heterogenic components of a fast electrical potential in Drosophila compound eye and their relation to visual pigment photoconversion.</a> The Journal of General Physiology. 75 (4), 353-379 (1980).</li>
<li>Agam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+stress+reversibly+activates+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (15), 5748-5755 (2000).</li>
<li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trp+gene+is+essential+for+a+light-activated+Ca2%2B+channel+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 8, 643-651 (1992).</li>
<li>Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+light-activated+conductance+is+composed+of+the+two+channels+TRP+and+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL.</a> Cell. 85 (5), 651-659 (1996).</li>
<li>Phillips, A. M., Bull, A., Kelly, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Drosophila+gene+encoding+a+calmodulin-binding+protein+with+homology+to+the+trp+phototransduction+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Identification of a Drosophila gene encoding a calmodulin-binding protein with homology to the trp phototransduction gene.</a> Neuron. 8, 631-642 (1992).</li>
<li>Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+light-induced+response+of+the+central+retinular+cells+from+the+electroretinogram+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of light-induced response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila.</a> Journal of Comparative Physiology. 98, 345-355 (1975).</li>
<li>Selinger, Z., Doza, Y. N., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+genetics+of+photoreceptors+desensitization+in+Drosophila+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and genetics of photoreceptors desensitization in Drosophila flies.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1179, 283-299 (1993).</li>
<li>Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+the+prolonged+depolarizing+afterpotential+%28PDA%29+and+its+role+in+genetic+dissection+of+Drosophila+phototransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">The history of the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) and its role in genetic dissection of Drosophila phototransduction.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 106-117 (2012).</li>
<li>Satoh, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin+translocation+is+stoichiometric+to+rhodopsin+isomerization+and+accelerated+by+phototransduction+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Arrestin translocation is stoichiometric to rhodopsin isomerization and accelerated by phototransduction in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 67 (6), 997-1008 (2010).</li>
<li>Byk, T., Bar Yaacov, M., Doza, Y. N., Minke, B., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+arrestin+cycle+secures+the+fidelity+and+maintenance+of+the+fly+photoreceptor+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Regulatory arrestin cycle secures the fidelity and maintenance of the fly photoreceptor cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1907-1911 (1993).</li>
<li>Dolph, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin+function+in+inactivation+of+G+protein-coupled+receptor+rhodopsin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Arrestin function in inactivation of G protein-coupled receptor rhodopsin in vivo.</a> Science. 260, 1910-1916 (1993).</li>
<li>Belusic, G., Pirih, P., Stavenga, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+responses+of+fruitflies+with+normal+and+reduced+arrestin+content+studied+by+simultaneous+measurements+of+visual+pigment+fluorescence+and+ERG%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+A%2C+Neuroethology%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor responses of fruitflies with normal and reduced arrestin content studied by simultaneous measurements of visual pigment fluorescence and ERG.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 196 (1), 23-35 (2010).</li>
<li>Stavenga, D. G., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metarhodopsin+control+by+arrestin%2C+light-filtering+screening+pigments%2C+and+visual+pigment+turnover+in+invertebrate+microvillar+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+A%2C+Neuroethology%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Metarhodopsin control by arrestin, light-filtering screening pigments, and visual pigment turnover in invertebrate microvillar photoreceptors.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 197 (3), 227-241 (2011).</li>
<li>Stark, W. S., Zitzmann, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adaptation+mechanisms+and+photopigment+spectra+by+vitamin+A+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isolation of adaptation mechanisms and photopigment spectra by vitamin A deprivation.</a> Journal of Comparative Physiology. 105, 15-27 (1976).</li>
<li>Minke, B., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+a+sensitizing+pigment+to+the+photosensitivity+spectra+of+fly+rhodopsin+and+metarhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">The contribution of a sensitizing pigment to the photosensitivity spectra of fly rhodopsin and metarhodopsin.</a> The Journal of General Physiology. 73, 517-540 (1979).</li>
<li>Cone, R. A., Cobbs, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+cycle+in+the+living+eye+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin cycle in the living eye of the rat.</a> Nature. 221 (5183), 820-822 (1969).</li>
<li>Murakami, M., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellularly+recorded+early+receptor+potential+of+the+vertebrate+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Intracellularly recorded early receptor potential of the vertebrate photoreceptors.</a> Vision Research. 10 (10), 965-975 (1970).</li>
<li>Hodgkin, A. L., Obryan, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+recording+of+the+early+receptor+potential+in+turtle+cones%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Internal recording of the early receptor potential in turtle cones.</a> The Journal of Physiology. 267 (3), 737-766 (1977).</li>
<li>Yasin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+mouse+melanopsin+in+Drosophila+photoreceptors+reveals+fast+response+kinetics+and+persistent+dark+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of mouse melanopsin in Drosophila photoreceptors reveals fast response kinetics and persistent dark excitation.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3624-3636 (2017).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolysis+of+caged+Ca+2%2B+facilitates+and+inactivates+but+does+not+directly+excite+light-sensitive+channels+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Photolysis of caged Ca 2+ facilitates and inactivates but does not directly excite light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 15, 889-902 (1995).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recordings+of+the+light+induced+current+in+dissociated+Drosophila+photoreceptors%3A+evidence+for+feedback+by+calcium+permeating+the+light-sensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Containing+Papers+of+a+Biological+Character.+Royal+Society+%28Great+Britain%29%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing Papers of a Biological Character. Royal Society (Great Britain). 245, 203-210 (1991).</li>
<li>Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+mutant+defective+in+extracellular+calcium-dependent+photoreceptor+deactivation+and+rapid+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Drosophila mutant defective in extracellular calcium-dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization.</a> Nature. 354, 230-232 (1991).</li>
<li>Pak, W. L., Lidington, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+electrical+potential+from+a+long-lived%2C+long-wavelength+photoproduct+of+fly+visual+pigment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fast electrical potential from a long-lived, long-wavelength photoproduct of fly visual pigment.</a> The Journal of General Physiology. 63 (6), 740-756 (1974).</li>
<li>Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+method+for+whole-cell+voltage+clamp+recordings+from+drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627(2017).</li>
<li>Selinger, Z., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+lipid+cascade+of+vision+studied+in+mutant+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22%5BJournal%5D)">Inositol lipid cascade of vision studied in mutant flies.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 53, 333-341 (1988).</li>
<li>Minke, B., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspectrophotometric+evidence+for+two+photoconvertible+states+of+visual+pigments+in+the+barnacle+lateral+eye%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Microspectrophotometric evidence for two photoconvertible states of visual pigments in the barnacle lateral eye.</a> The Journal of General Physiology. 71, 37-45 (1978).</li>
<li>Ranganathan, R., Harris, W. A., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+genetics+of+invertebrate+phototransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The molecular genetics of invertebrate phototransduction.</a> Trends in Neurosciences. 14, 486-493 (1991).</li>
<li>Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+photon+responses+in+Drosophila+photoreceptors+and+their+regulation+by+Ca+2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2.</a> The Journal of Physiology. 524, 179-194 (2000).</li>
<li>Dimitracos, S. A., Tsacopoulos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recovery+from+a+transient+inhibition+of+the+oxidative+metabolism+of+the+photoreceptors+of+the+drone+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">The recovery from a transient inhibition of the oxidative metabolism of the photoreceptors of the drone (Apis mellifera).</a> Journal of Experimental Biology. 119, 165-181 (1985).</li>
<li>Agam, K., Frechter, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Drosophila+TRP+and+TRPL+channels+requires+both+Ca+2%2B+and+protein+dephosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca 2+ and protein dephosphorylation.</a> Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Het grote voordeel van het gebruik van de Drosophila-fotoreceptorvoorbereiding is de toegankelijkheid, het gemak en de nauwkeurigheid van lichtstimulatie en, belangrijker nog, het vermogen om de kracht van moleculaire genetica toe te passen7. Uitgebreide genetische studies hebben Drosophila vastgesteld als een uiterst nuttig modelsysteem voor de genetische dissectie van complexe biologische processen7. De relatief eenvoudige structuur van het Drosophil...

De lichtgeactiveerde rhodopsine (R), een G-eiwit-gekoppelde receptor (GPCR), bestaat uit een 7 transmembraaneiwit (opsine) en een chromofoor. In Drosophila melanogaster (fruitvlieg) induceert fotonabsorptie isomerisatie van de 11-cis-3-OH-retinale chromofoor tot all-trans-3-OH-retinal1, waardoor de conformationele verandering van de rhodopsine naar metarhodopsine wordt bevorderd (M, figuur 1A). In tegenstelling tot gewervelde rhodopsine dissocieert de overheersende fractie van ongewervelde chromofoor zich niet van het opsine, wat resulteert in de fysiologisch actieve donkerstabiele pigmenttoestand M. Op zijn beurt induceert extra fotonabsorptie door de all-trans-3-OH-retinale chromofoor isomerisatie van de chromofoor 2,3, waardoor de R-pigmenttoestand wordt gegenereerd met de 11-cis-3-OH-retinale chromofoor. De R-toestand is een donker, stabiel en fysiologisch niet-actief fotopigment. Naast de extreem snelle fotonregeneratieroute van de chromofoor4, net als gewervelde fotopigmenten, bestaat er een alternatieve enzymatische langzame route voor chromofoorregeneratie bij ongewervelde dieren, waarbij sommige stadia worden uitgevoerd in retinale cellen rond de fotoreceptorencellen 5,6.
Drosophila heeft grote voordelen als modelorganisme voor het bestuderen van ongewervelde fotoreceptoren. Met name de toegankelijkheid van het preparaat en het vermogen om moleculaire genetica toe te passen hebben Drosophila tot een krachtig modelsysteem gemaakt7. Daarom zijn er verschillende in vivo en ex vivo experimentele methoden vastgesteld voor het bestuderen van fototransductie in het algemeen en fotopigmentniveaus in het bijzonder. De eenvoudigste in-vivo methode maakt gebruik van de relatief grote extracellulair geregistreerde spanningsrespons op het licht van het Drosophila-oog. Dienovereenkomstig roept lichtstimulatie een elektrische spanningsrespons op in het hele oog die kan worden gemeten met behulp van extracellulaire elektroretinogram (ERG) -opname, die ~ 3 ordes van grootte groter is dan de ERG-respons op licht van gewervelde ogen 8,9. De Drosophila ERG-respons is robuust en gemakkelijk te verkrijgen, waardoor het een handige methode is voor het identificeren van afwijkingen in lichtrespons als gevolg van mutaties. De ERG-reactie op licht ontstaat voornamelijk uit de fotoreceptoren, pigmentcellen (glia) en secundaire neuronen van de lamina (zie figuur 1B). De belangrijkste componenten van de ERG zijn (i) de extracellulaire spanningsrespons van de fotoreceptoren, (ii) de "aan" en "uit" transiënten aan het begin en einde van de lichtprikkel die voortkomen uit de lamina neuronen (figuur 2A, inzet, AAN, UIT), (iii) de langzame respons van de gliacellen (figuur 2A, inzet, pijlen), en (iv) de korte en voorbijgaande respons, als gevolg van ladingsverplaatsing tijdens fotopigmentactivering die voorafgaat aan de ON-transiënte10 (figuur 2C [inzet], D, E). Deze korte respons bestaat uit twee fasen (M1 en M2, figuur 2C [inzet]) en kan alleen worden geïnduceerd door extreem sterke lichtstimulatie, die tegelijkertijd miljoenen fotopigmentmoleculen activeert. Het wordt niet waargenomen onder blauwe stimulatie (figuur 2D, blauw spoor) noch in mutanten met sterk verlaagde fotopigmentniveaus (figuur 2E, rood spoor), maar de amplitude is licht verbeterd in een mutant die plc-activiteit elimineert (figuur 2E, oranje spoor). De M1-fase is een typisch ERP van de vlieg die ontstaat door de activering van M in de fotoreceptoren. De M1-fase, die een positieve polariteit heeft (intracellulair), geeft een neurotransmitter op de normale manier vrij in een teken-omkerende synaps en activeert de lamina-neuronen, die reageren op de fotoreceptor-depolarisatie door de synaptisch versterkte M2-fase te genereren. Zowel de M1- als de M2-fase weerspiegelen dus M-activering10,11.
De depolarisatie van de fotoreceptor genereert de cornea-positieve "aan" transiënt, voortkomend uit de teken-omkerende synaps tussen het fotoreceptor axon en de monopolaire neuronen van de lamina 10,11 (figuur 1B). De langzame opkomst en het verval van de ERG ontstaan door de depolarisatie van de pigmentcellen (figuur 2A, inzet, pijlen) voornamelijk als gevolg van K+ efflux van de fotoreceptorcellen12 via de transiënte receptorpotentiaal (TRP) en TRP-achtige (TRPL) kanalen 13,14,15. Deze langzame kinetische componenten maskeren en vervormen grotendeels de golfvorm van de fotoreceptorrespons in vergelijking met intracellulaire of hele celopnamen van de fotoreceptorrespons op licht 9,10. Bovendien kan bij zeer sterke verlichting een extra transiënte respons worden waargenomen, die voorafgaat aan en gedeeltelijk fuseert met de transiënt "aan", (figuur 2C [inzet],D,E). Dit signaal is rechtstreeks afkomstig van de massale activering van het fotopigment10.
Verschillende lichtregimeprotocollen met behulp van neutrale dichtheid (ND) en kleurfilters, evenals sterke lichtgevende flitsen, zijn ontwikkeld om het oog in het algemeen en de fototransductiecascade in het bijzonder te onderzoeken. Deze protocollen zijn ook gebruikt om de eigenschappen van het fotopigment te onderzoeken.
Het intensiteitsresponsprotocol meet de piekamplitude van de ERG-spanningsrespons van het hele oog op toenemende lichtintensiteiten (figuur 2A,B). Dit protocol helpt bij het detecteren van veranderingen in de gevoeligheid van de fotoreceptorcellen voor licht9.
Het langdurige depolariserende afterpotentiële (PDA) protocol maakt gebruik van de verschillen in de absorptiespectra van rhodopsine en metarhodopsine dat in Drosophila een massale fotopigmentconversie van R naar zijn fysiologisch actieve en donkerstabiele intermediaire M-toestand2 mogelijk maakt. In de ERG-spanningsrespons wordt een relatief korte puls van verzadigingslicht gegeven en wordt de resulterende spanningsrespons geregistreerd. Onder deze voorwaarde wordt een plafond (omkeerpotentiaal) bereikt door het depolarisatiesignaal omdat activering van een fractie van een procent van de enorme hoeveelheid rhodopsinemoleculen (~ 1 x 108) voldoende is om het plafond te bereiken. De aanwezigheid van de fototransductiecomponenten in grote overvloed zorgt ervoor dat dit plafond zelfs in mutanten wordt bereikt met een aanzienlijke concentratievermindering of subtiele storing van de fototransductiecomponenten. Deze situatie sluit de isolatie van deze mutanten uit. Pak et al. introduceerden de PDA-screening7 op zoek naar een betrouwbare en onthullende test om visuele mutanten te isoleren. In Drosophila wordt de PDA-respons tot stand gebracht door het genetisch verwijderen van het rode screeningpigment, wat fotopigmentconversie mogelijk maakt, en de toepassing van blauw licht, dat bij voorkeur wordt geabsorbeerd door rhodopsine (figuur 3A) en dus resulteert in een grote nettoconversie van de R naar de M-fotopigmenttoestand. De beëindiging van de fototransductie wordt op het niveau van het fotopigment verstoord door een grote nettoconversie van R naar M, wat op zijn beurt resulteert in aanhoudende excitatie lang nadat het licht is uitgeschakeld (figuur 2C, figuur 4A [boven]). Tijdens de PDA-periode zijn de fotoreceptoren minder gevoelig voor volgende testlichten en gedeeltelijk ongevoelig (geïnactiveerd). De PDA detecteert zelfs kleine defecten in rhodopsinebiogenese en test de maximale capaciteit van de fotoreceptorcel om excitatie gedurende een langere periode te behouden. Omdat het strikt afhankelijk is van de aanwezigheid van hoge concentraties rhodopsine, scoort het gemakkelijk voor gebrekkige aanvulling van de fototransductiecomponenten. Opmerkelijk is dat het PDA-scherm veel nieuwe en zeer belangrijke visuele mutanten heeft opgeleverd (besproken in Pak et al.7). De PDA-mutanten geïsoleerd door Pak et al.7 zijn dus nog steeds uiterst nuttig voor het analyseren van het drosophila visuele systeem.
De PDA wordt geïnduceerd in Drosophila door blauw licht te verzadigen, wat resulteert in continue depolarisatie lang na lichtverschuiving (figuur 4A [boven]). Na het verzadigen van PDA-inducerend blauw licht, blijven de perifere fotoreceptoren (R1-6) continu actief in het donker met hun maximale capaciteit en bereiken ze verzadiging. Extra verzadigde blauwe lichten tijdens de PDA produceren gedurende vele seconden geen extra respons in R1-6-cellen, maar induceren een respons in R7-8-cellen die op de PDA wordt gesuperponeerd. De gesuperponeerde reacties worden verklaard door de verschillende absorptiespectra van de fotopigmenten die in deze cellen tot expressie komen (R7-8)16. De PDA kan worden onderdrukt door de fotoconversie van M terug naar R met verzadigingsoranje licht (figuur 4A [boven]). Het vermogen van de PDA om de fotoreceptorcellen naar hun maximale actieve capaciteit te brengen, een situatie die niet kan worden bereikt door intens wit licht, verklaart waarom het een belangrijk hulpmiddel is geweest om te screenen op visuele mutanten van Drosophila. Dit komt omdat het de detectie mogelijk maakt van zelfs kleine defecten in eiwitten die betrokken zijn bij de biogenese van normale fotopigmentniveaus17,18. Twee groepen PDA-defecte mutanten zijn geïsoleerd: noch inactivatie noch afterpotentiële (nina) mutanten en inactivatie, maar geen napotentiële (ina) mutanten. Het fenotype van de eerste is een gebrek aan een PDA en de bijbehorende inactivatie als gevolg van een grote verlaging van de fotopigmentspiegels (figuur 4A [midden]). Het fenotype van de laatste vertoont inactivatie, maar geen donkere depolarisatie na blauw licht als gevolg van een nog onbekend mechanisme in de mutant met normale rhodopsinespiegels maar zonder eiwitten die interageren met de TRP-kanalen (figuur 4A [onder]).
De PDA komt voort uit het verschil in de hoeveelheid fotopigment ten opzichte van arrestine (ARR2), dat M-activiteit 19,20,21 bindt en beëindigt (figuur 1A). Bij Drosophila-fotoreceptoren is de hoeveelheid van het fotopigment ongeveer vijf keer groter dan de hoeveelheid ARR219. ARR2-niveaus zijn dus onvoldoende om alle M-moleculen te inactiveren die worden gegenereerd door een grote netto fotoconversie van R naar M, waardoor een overmaat aan M constant actief is in het donker 17,19,20,22,23. Dit mechanisme verklaart de eliminatie van de PDA-respons door mutaties of door carotenoïddeprivatie24,25, waardoor het fotopigmentniveau afneemt, maar geen invloed heeft op de arrestinespiegels. Bovendien verklaart deze verklaring ook de fenotypen van null ARR2 (arr23) mutant allel21, waarin PDA kon worden bereikt bij ~10-voudige dimmer blauwlichtintensiteiten 19,20,21 (figuur 4B,C). De PDA is geen uniek kenmerk van vliegenfotoreceptoren en komt voor bij elke geteste soort met een donker stabiel M-spectrum met een absorptiespectrum dat verschilt van dat van de R-toestand, waardoor voldoende fotoconversie van het fotopigment van de R naar de M-toestand mogelijk is. Een grondig onderzochte soort waarbij de PDA-fenomenologie werd ontdekt, is de barnakel (Balanus) fotoreceptor, waarbij het absorptiespectrum van de R-toestand zich in een langere golflengte bevindt dan de M-toestand2 (figuur 3B). Dienovereenkomstig induceert oranjerood licht, in tegenstelling tot de situatie in de vlieg, oranjerood licht een PDA, terwijl blauw licht de PDA2 onderdrukt.
Het early receptor potential (ERP) protocol maakt gebruik van de ladingsverplaatsing die optreedt tijdens R- of M-activering. Het visuele pigment is een integraal onderdeel van het oppervlaktemembraan van het signaleringscompartiment van zowel gewervelde als ongewervelde membranen3. Dienovereenkomstig gaat het activeringsproces waarbij de fotopigmentmoleculen van de ene tussentoestand naar de volgende veranderen, gepaard met een ladingsverplaatsing 4,26. Omdat de fotopigmentmoleculen elektrisch parallel aan de membraancapaciteit4 zijn uitgelijnd, genereert een snelle gesynchroniseerde conformatieverandering een snelle polarisatieverandering van het oppervlaktemembraan, die bij vliegen optreedt in het signaleringscompartiment dat bestaat uit een stapel van ~ 30.000-50.000 microvilli genaamd rhabdomere. Deze polarisatie ontlaadt vervolgens passief door de membraancapaciteit van het cellichaam totdat het celmembraan even gepolariseerd is. Het ERP is de extracellulaire registratie van de ladingsverplaatsing. Het intracellulair geregistreerde ERP manifesteert het extracellulaire ERP geïntegreerd door de tijdconstante van het celmembraan 4,27,28. De stroom die wordt geactiveerd door de verplaatsing van de visuele pigmentlading kan ook worden gemeten in hele-cel spanningsklemopnamen29,30 (figuur 5A-D), met als groot voordeel (in vroege receptorstroom (ERC) opnames) van het minimaliseren van het effect van membraancapaciteit op de kinetiek van het signaal.
De protocolsectie beschrijft hoe ERG-metingen van Drosophila eye9 en ERC-metingen kunnen worden uitgevoerd door hele-celopnamen van Drosophila geïsoleerde ommatidia31,32. We beschrijven ook specifieke protocollen die worden gebruikt om fototransductie in het algemeen en fotopigmenten in het bijzonder te onderzoeken.

<table><tbody><tr><td>1 mL spuit met verlengde punt</td><td></td><td></td><td>Figuur 6M</td></tr><tr><td>1 ruwe pincet</td><td></td><td>Dumont #5, Standaard</td><td>0,1 mm x 0,06 mm, lengte 110 mm, Inox (Figuur 6H)</td></tr><tr><td>2 condensorlenzen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A/D converter</td><td>Molecular Device</td><td>Digidata 1200</td><td>Mogelijke vervanger: elke digidata van molecular devices (bijv. 1440A) - Figuur 7C</td></tr><tr><td>Versterker</td><td>Almost perfect electronics</td><td></td><td>Mogelijke vervanger: Warner instruments- IE251A of IE-210 (komt met headstage)- Figuur 7D</td></tr><tr><td>Anti-vibratie tafel</td><td>Newport</td><td>VW-3036-OPT-01</td><td>Figuur 7H</td></tr><tr><td>Kapillairen</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Borosilikatiet glas capillairen</td><td>1 mm x 0,58 mm (Figuur 6O)</td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Device</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>CO2 tank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koud lichtbron</td><td>Schott</td><td>KL1500 LCD</td><td>Figuur 6C</td></tr><tr><td>Delicate doekjes</td><td>Kimtech</td><td></td><td>Kimwipes (Figuur 6K)</td></tr><tr><td>Elektrode houder</td><td></td><td></td><td>Geschikt voor capillair O.D. 1 mm (Figuur 6N, Figuur 7N, en Figuur 7P)</td></tr><tr><td>Faraday kooi</td><td>Zelf gemaakt</td><td></td><td>Elektromagnetische ruis afscherming en zwarte voorkant gordijn (Figuur 7K)</td></tr><tr><td>Filter (Kleur)</td><td>Schott</td><td>OG590, Edge filter</td><td>Figuur 7S</td></tr><tr><td>Filter (Kleur)</td><td>Schott</td><td>BP450/40 nm</td><td>Figuur 7S</td></tr><tr><td>Filter (Kleur)</td><td>Blazers</td><td>550 nm</td><td>Figuur 7S</td></tr><tr><td>Filter (Kleur) voor koude lichtbron</td><td>Schott</td><td>RG630</td><td>Figuur 6C</td></tr><tr><td>Filter (Hitte)</td><td>Schott</td><td>KG3</td><td>Figuur 7S</td></tr><tr><td>Filters (Neutraal dichtheidsfilter)</td><td>Chroma</td><td>6,5,4,3,2,1,0,5,0,3</td><td>Figuur 7S</td></tr><tr><td>Flash Lamp systeem</td><td>Honeywell</td><td></td><td>Figuur 7U</td></tr><tr><td>Fly sleeper systeem met injector</td><td>Inject + matic</td><td></td><td>Figuur 6A-B</td></tr><tr><td>Lamp voeding</td><td>PTI</td><td>LPS-220</td><td>Figuur 7W</td></tr><tr><td>Licht detector</td><td>Zelf gemaakt</td><td></td><td>Fototransistor (Figuur 7O)</td></tr><tr><td>Lichtgeleider</td><td></td><td></td><td>3 mm diameter, 1,3 m lang (Figuur 7L,M)</td></tr><tr><td>Lichtbron</td><td></td><td></td><td>Hogedruk ozon-vrije 75 W Xenon lamp (werkend op 50 W), mogelijke vervanger: Cairn research- OptoLED (Figuur 7R)</td></tr><tr><td>Laag temperatuur smeltwas</td><td>Zelf gemaakt</td><td></td><td>Bestaat uit een mengsel van bijenwas (Tm&asymp;62 &deg;C) en paraffine op ~3:1 om een smelttemperatuur van ~55&ndash;56 &deg;C te bereiken (Figuur 6J)</td></tr><tr><td>Magnetische standaard voor vliegen</td><td>Zelf gemaakt</td><td></td><td>Figuur 6I en Figuur 7Q</td></tr><tr><td>Micro-elektrode voorversterker systeem met head-stage</td><td>Almost perfect electronics</td><td></td><td>Impedantie tester (Figuur 7G)</td></tr><tr><td>Micromanipulator (mechanisch grof)</td><td>Tritech Research, Narishige</td><td>M-2</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator (mechanisch fijn)</td><td>Leitz Microsystems</td><td>Leitz Mechanical Micromanipulator</td><td>Figuur 7F</td></tr><tr><td>pCLAMP</td><td>Molecular Device</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td></td><td></td><td>60 mm</td></tr><tr><td>Puls generator</td><td>AMPI</td><td>Master 8</td><td>Figuur 7A</td></tr><tr><td>Redux crème voor elektrocardiografie</td><td>Parker Laboratories</td><td>Redux Electrolyte Cr&egrave;me</td><td></td></tr><tr><td>Shutter driver</td><td>Uniblitz, Vincent Associates</td><td>VCM-D1 Single Channel Uni-stable</td><td>Figuur 7V</td></tr><tr><td>Shutter systeem</td><td>Uniblitz, Vincent Associates</td><td>LS2 2 mm Uni-stable Shutters</td><td>Figuur 7V</td></tr><tr><td>Zilverdraad</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td>0,25&ndash;1 mm diameter, moet gechloridiseerd worden</td></tr><tr><td>Soldeerbout samengesteld uit een platina-iridium gloeidraad</td><td></td><td></td><td>0,25 mm diameter (Figuur 6F)</td></tr><tr><td>Stereoscopische zoom Microscoop</td><td>Nikon</td><td>SMZ-2B</td><td>Figuur 6D</td></tr><tr><td>Stereoscopische zoom Microscoop</td><td>Wild</td><td>Wild M5</td><td>Met 6, 12, 25 en 50 vergrotingsstanden (Figuur 7E)</td></tr><tr><td>Spuit filters</td><td>Millex</td><td></td><td>22 &micro;m PVDF filter</td></tr><tr><td>Verticale pijpzetpuller</td><td>Sutter/ Narishige</td><td>Model P-97/PP-830</td><td>Gebruik ofwel verticale of horizontale puller, naar keuze (Figuur 6L)</td></tr><tr><td>Was filament verwarmer</td><td>Zelf gemaakt</td><td></td><td>Zie figuur S1 (Figuur 6E-G)</td></tr><tr><td>Xenon Flash Lamp systeem</td><td>Dr. Rapp OptoElectronic</td><td>JML-C2</td><td>Figuur 7X</td></tr></tbody></table>

elektrofysiologische methoden voor het meten van fotopigmentniveaus in drosophila-fotoreceptoren

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

Het Drosophila G-eiwit-gekoppelde fotopigment rhodopsine (R) bestaat uit een eiwit (opsine) en een chromofoor. Het activeringsproces van rhodopsine wordt geïnitieerd door fotonabsorptie-inducerende isomerisatie van de chromofoor, waardoor conformatieveranderingen van het opsine worden bevorderd en resulteert in een tweede donkerstabiele fotopigmenttoestand (metarhodopsine, M). Onderzoek van dit bi-stabiele fotopigment met behulp van willekeurige mutagenese vereist eenvoudige en robuuste methoden voor het screenen van gemuteerde vliegen. Daarom zijn verschillende methoden ontworpen voor het meten van verminderingen van functionele fotopigmentniveaus. Een dergelijke methode maakt gebruik van de ladingsverplaatsingen in het fotopigment na fotonabsorptie en de enorme hoeveelheden fotopigmentmoleculen die tot expressie komen in de fotoreceptoren. Dit elektrische signaal, genaamd de vroege receptorpotentiaal (of vroege receptorstroom), wordt gemeten met een verscheidenheid aan elektrofysiologische methoden (bijv. Elektroretinogram en hele celopnamen) en is lineair evenredig met functionele fotopigmentniveaus. De voordelen van deze methode zijn de hoge signaal-ruisverhouding, directe lineaire meting van fotopigmentniveaus en onafhankelijkheid van fototransductiemechanismen stroomafwaarts tot rhodopsine- of metarhodopsineactivering. Een aanvullende elektrofysiologische methode genaamd prolonged depolarizing afterpotential (PDA) maakt gebruik van de bi-stabiliteit van Drosophila fotopigment en de absorptie-spectrale verschillen van vlieg R- en M-pigmenttoestanden. De PDA wordt geïnduceerd door intens blauw licht, waarbij verzadigde hoeveelheden rhodopsine worden omgezet in metarhodopsine, wat resulteert in het falen van lichtresponsbeëindiging voor een langere tijd in het donker, maar het kan worden beëindigd door metarhodopsine naar rhodopsine conversie met behulp van intens oranje licht. Omdat de PDA een robuust signaal is dat een massale fotopigmentconversie vereist, leiden zelfs kleine defecten in de biogenese van het fotopigment tot gemakkelijk gedetecteerde abnormale PDA. Defecte PDA-mutanten leidden inderdaad tot de identificatie van nieuwe signaaleiwitten die belangrijk zijn voor fototransductie.

Figuur 2 illustreert de robuustheid en het gemak van het gebruik van de ERG-techniek. Het is robuust omdat het wordt opgenomen in de vrijwel intacte vlieg door een eenvoudige techniek van extracellulaire spanningsregistraties die een eenvoudige elektrofysiologische opstelling vereisen. De robuustheid manifesteert zich door het verkrijgen van opnames van lichtresponsen met relatief grote amplitudes (in het millivolt-bereik), zelfs wanneer mutaties de lichtrespons sterk verminderen of vervorme...

We presenteren een protocol om bi-stabiele fotopigmenten elektrofysiologisch te karakteriseren: (i) het benutten van de ladingsverplaatsingen binnen de fotopigmentmoleculen na fotonabsorptie en hun enorme hoeveelheid in de fotoreceptoren, en (ii) het benutten van de absorptie-spectraverschillen van rhodopsine en metarhodopsine fotopigmenttoestanden. Deze protocollen zijn nuttig om te screenen op mutaties die bi-stabiele fotopigmentsystemen beïnvloeden.

Elektrofysiologische methoden voor het meten van fotopigmentniveaus in Drosophila-fotoreceptoren

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

Dit protocol is met name geschikt voor genetische screening van visueel defecte Drosophila-mutanten. Dit komt omdat ze de detectie mogelijk maken voor zelfs kleine afwijkingen in Drosophila-fototransductie, met name in fotopigmentniveaus en tier peer-gerelateerde functies. Deze techniek is diepgaand in vivo, het is gemakkelijk uit te voeren en zeer robuust, waardoor de detectie van kleine veranderingen in de activiteit van fototransductie-eiwitten mogelijk is.Naar mijn mening is het repareren van de vliegen met behoud van de levensvatbaarheid waarschijnlijk het kritieke onderdeel van deze methode. Schakel de computer in en open de Clampex-software. Schakel de versterker en de Master-8-pulsgenerator in en schakel vervolgens de xenonlamp en sluitercontroller in.Zet de trekker aan en plaats een glazen capillair in de trekker en trek eraan. Verwijder het glazen capillair van de trekker. Vul het glazen capillair met een gefilterde ringeroplossing met behulp van een langwerpige tipspuit.Steek de draadelektrode in het glazen capillair. Zorg ervoor dat de oplossing in het capillair in contact komt met de zilverdraad. Plaats de elektrodehouders in de twee elektrodemicromanipulatoren.Schakel de voeding van de soldeerbout in. Stel de stroom in op ongeveer 2,25 ampère. Deze stroom moet het platina-iridiumfilament van 0,25 millimeter verwarmen tot ongeveer 55 tot 56 graden Celsius.Plaats een druppel was met een lage smelttemperatuur op de soldeerbout. Verdoof de vliegen in de fles. Giet de verdoofde vliegen in de slaapcontainer, kies één vlieg en bedek de rest van de vliegen met een petrischaaltje.Houd de vlieg voorzichtig bij zijn vleugels met behulp van een scherp pincet en plaats hem op de vlieghouder. Plaats de vlieg op de vlieghouder liggend op zijn zij met zijn rug naar de hand. Til de vlieg met een pincet van zijn vleugels en bevestig zijn vleugels aan de vlieghouder met behulp van de soldeerbout.Verbind de rug van de vlieg met het standaardoppervlak met was met behulp van de soldeerbout. Laat de punt van de soldeerbout zakken tot het verbindingspunt van de poten en smelt vervolgens de was om alle benen samen te bedekken. Plaats een kleine druppel was tussen het hoofd en de nek in het nekgebied.Plaats de vliegenhouder in een donkere kooi op een magneetblok en zorg ervoor dat de vlieg zich ongeveer vijf millimeter van het uiteinde van de lichtgeleider bevindt. Plaats de opname-elektrode boven het oog van de vlieg en de grondelektrode over de bovenrug van de vlieg met behulp van de micromanipulators. Plaats vervolgens de grondelektrode in de achterkant van de vlieg met behulp van de micromanipulators.Plaats de opname-elektrode in de buitenste periferie van het oog van de vlieg, bij voorkeur met behulp van de micromanipulatoren. Sluit de kooi van Faraday en doe de lichten in de kamer uit om vijf minuten lang aan te passen aan het donker. Voer de parameters in vanaf een pulsduur van 500 meter per seconde, een pulsinterval van 60 seconden en het aantal pulsen ingesteld op zes.Voor het meten van de PDA stelt u de Master-8-pulsgenerator in train-modus in en geeft u vervolgens een lichtpuls van vijf seconden van maximale intensiteit met behulp van een oranje filter. Controleer de spanningsrespons. Vervang het oranje filter door een breedbandblauw filter en geef drie lichtpulsen van 5 seconden met maximale intensiteit.Controleer de spanningsrespons. Wacht minstens 60 seconden in het donker. Vervang het blauwe filter door het vorige oranje filter.Geef vervolgens twee lichtpulsen van 5 seconden met intervallen van 60 seconden. Controleer de spanningsrespons. Geef voor het meten van de ERP M-potentiaal een continue blauwe lichtpuls totdat een steady state spanningsrespons is bereikt.Geef een korte intense lichtflits van een golflengte tussen 350 en 700 nanometer met behulp van een 20-nanometer band-pass filter. Meet vervolgens de piekamplitude van de M1-fase van de M-potentiaalrespons, die de metarhodopsineabsorptie op deze specifieke golflengte bij foto-onevenwichtigheid weerspiegelt. De PDA-responsen werden geëvalueerd voor verschillende mutante vliegen.Wild-type vliegen vertoonden een verzadigde depolarisatie in het donker die verscheen als langdurige cornea negatieve ERG, na intense blauwe lichtstimulatie. De volgende blauwe lichten produceerden kleine reacties bovenop de PDA, zonder de aan- en uit-transiënten. Bij gemuteerde vliegen met abnormale fotopigmentbiogenese zoals ninaE keerde de spanningsrespons terug naar de basislijn na intense stimulatie van blauw licht, en de reactie op een extra blauw licht werd niet onderdrukt en vertoonde normale aan- en uittransiënten.Het wild-type ERP van de vlieg wordt verkregen door hetzelfde protocol, maar een intense groene flits wordt toegepast tijdens de PDA. Deze groene flits lokt het ERP uit en onderdrukte de PDA. De M-potentiaal werd verkregen door de groene flits na blauwe verlichting, maar niet door een blauwe flits na blauwe verlichting in de wild-type vlieg.Dit protocol werd herhaald in wild type, in fotopigment hypomorfe mutant ninaE en in fototransductie-deficiënte mutant met normale fotopigmentspiegels norpA. Relatieve absorptiespectra van vliegen rhodopsine en metarhodopsine werden berekend op basis van fotometrische metingen van het verschillende spectrum en het foto-onevenwichtigheidsspectrum. Het is belangrijk voor de overleving van de vliegen om aandacht te besteden aan de viscositeit van de was door zich te onthouden van oververhitting.Deze procedure is geschikt voor genetische en via screening van defecte visuele mutanten. Methoden die willekeurig visuele mutaties isoleren en identificeren, kunnen de ontdekking van nieuwe eiwitten en mechanismen die betrokken zijn bij drosophila-fototransductie vergemakkelijken. Het PDA-protocol maakte de isolatie van belangrijke en nieuwe visuele mechanismen mogelijk.De deelname zou waarschijnlijk niet zijn ontdekt of zelfs anders zijn voorzien.

electrophysiological-methods-for-measuring-photopigment-levels

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video outlines the protocol for electrophysiological recording of photoreceptor activity in the eye of an immobilized Drosophila, enabling precise measurement of voltage changes in response to light stimuli.

Electrophysiological Recording of Voltage Responses of Drosophila Retinal Photoreceptors to Light Stimuli

The video demonstrates recording electrical activity in the photoreceptor neurons of Drosophila's ommatidium by establishing a whole-cell configuration. It highlights the activation of transient receptor potential channels by light pulses, resulting in measurable quantum bumps.

Whole-Cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

This video demonstrates an experimental protocol to investigate the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) in white-eyed Drosophila. The fly's eye is exposed to intense blue light pulses to convert the photopigment rhodopsin to metarhodopsin, initiating a signaling cascade that opens positive ion channels and causes membrane depolarization. Because blue light prevents the reconversion of metarhodopsin to rhodopsin, the continuous influx of positive ions results in sustained depolarization,...

Investigating Prolonged Depolarizing Afterpotential (PDA) in Drosophila Photoreceptors

Source: Wagner, K. et al., Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the visualization of membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells using eGFP-tagged TRPL proteins. It details the preparation of transgenic flies for imaging, the capture of fluorescence images of photoreceptor cells, and the quantification of TRPL trafficking by measuring relative eGFP fluorescence in the...

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells

De elektrofysiologische techniek van intracellulaire opname wordt gebracht en benut spectrale gevoeligheden van enkele fotoreceptorcellen bepalen het samengestelde oog van een vlinder.

Bepaling van fotoreceptorcel spectrale gevoeligheid hebben een Insect Model van<em&gt; In Vivo</em&gt; Intracellulaire Recordings

Scherpe micro-elektroden maken nauwkeurige elektrofysiologische karakterisering van fotoreceptor en visuele interneuron-output in levende Drosophila mogelijk. Hier laten we zien hoe je deze methode kunt gebruiken om hoogwaardige spanningsresponsen van individuele cellen op gecontroleerde lichtstimulatie op te nemen. Deze methode is ideaal voor het bestuderen van neurale informatieverwerking in samengestelde ogen van insecten.

Elektrofysiologische Methode voor opname intracellulaire Voltage Reacties van<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreceptoren en Interneurons naar Light Stimuli<em&gt; In Vivo</em

Hier laten we zien hoe het aantal en de ruimtelijke verdeling van synaptische actieve zones in Drosophila melanogaster fotoreceptoren te kwantificeren, gemarkeerd met een genetisch gecodeerde moleculaire marker, en hun modulatie na langdurige blootstelling aan licht.

Het analyseren van Synaptic Modulatie van<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotoreceptoren na blootstelling aan Langdurige Light

Whole-cell opnames van Drosophila melanogaster fotoreceptoren maken het mogelijk om spontaan donkere stoten, kwantumstoten, macroscopische reacties op licht en spanningsrelaties onder verschillende omstandigheden te meten. In combinatie met D. melanogaster genetische manipulatie instrumenten, deze methode maakt het mogelijk om de alomtegenwoordige inositol-lipide signalering weg en zijn doel, het TRP kanaal te onderzoeken.

Elektrofysiologische methode voor opname van volledige spanningsklemmen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Photoreceptors

Dit werk biedt een methode om de abdominale pigmentatie van Drosophila melanogaster snel en nauwkeurig te kwantificeren met behulp van digitale beeldanalyse . Deze methode stroomlijnt de procedures tussen fenotype-acquisitie en data-analyse en omvat voorbeeldmontage, beeldverzameling, pixelwaarde-extractie en eigenschappen van eigenschappen.

Kwantificering van buikpigmentatie in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Hier worden niet-invasieve methoden beschreven voor de lokalisatie van fotoreceptormembraaneiwitten en de beoordeling van retinale degeneratie in het drosophila samengestelde oog met behulp van eGFP-fluorescentie.

Onderzoek naar membraaneiwithandel in drosophila-fotoreceptorcellen met behulp van eGFP-gelabelde eiwitten

Leer elektrofysiologische methoden om fotopigmentniveaus te meten in Drosophila-fotoreceptoren. Dit protocol detecteert subtiele afwijkingen in fototransductie en is ideaal voor genetische screening van visuele mutaties.

Elektrofysiologische methoden voor het meten van fotopigmentniveaus in Drosophila-fotoreceptoren

Meer video's verkennen