Een op fluorescentie gebaseerde test van membraanpotentiaal voor functionele studie met hoge doorvoer van twee endogene ionkanalen in twee epitheelcellijnen

Op fluorescentie gebaseerde membraanpotentiaaltests bieden robuuste methoden voor het bestuderen van de effecten van modulatoren op ionkanalen die endogeen tot expressie komen in epitheelcellen. Als proof of concept meten we de functie van twee ionkanalen in bekende epitheelcellijnen. Deze test is veelzijdig, omdat het een exogene chemische sonde gebruikt om de ionkanaalfunctie te meten, waardoor de behoefte aan genetisch gecodeerde sondes wordt omzeild.

Deze high-throughput assays kunnen de effecten van kleine molecuulmodulatoren op ionkanalen identificeren en karakteriseren, die het potentieel hebben om therapieën voor cystische fibrose te bevorderen. Kweek om te beginnen Calu-3- en Caco-2-cellen in een T75-kolf met EMEM met 20% foetaal runderserum en 1% penicillinestreptomycine. Zuig het medium uit de T75-kolf nadat de cellen 80 tot 100% confluentie hebben bereikt.

Was de cellen voorzichtig met 10 milliliter fosfaat-gebufferde zoutoplossing. Voeg vervolgens 2 milliliter voorverwarmd 0,25% trypsine, met 0,1% EDTA, toe aan de celmonolaag. Zet de kolf ongeveer vijf minuten op 37 graden Celsius.

Zorg er in deze stap voor dat de cellen van het kolfoppervlak worden opgetild en zich losmaken van de suspensie met één cel. Voeg 8 milliliter kweekmedium toe om de reactie te neutraliseren. Wanneer de cellen 30 tot 40% confluentie bereiken, voegt u 1,5 milliliter van de celsuspensie toe aan 18,5 milliliter kweekmedium in een conische buis en mengt u.

Voeg 200 microliter van deze celsuspensie toe aan elke put van een 96-putplaat om ongeveer 140.000 cellen per put te krijgen. Om een volledige plaat met 384 putten te plaatsen, voegt u 1 milliliter van de celsuspensie toe aan 17 milliliter van het kweekmedium in een conische buis om ongeveer 50.000 cellen per put te krijgen. Voeg na het mengen 50 microliter van de celsuspensie toe aan elk putje.

Verander het medium om de twee dagen en zorg ervoor dat de cellen binnen drie tot vijf dagen in alle putten tegelijk 100% confluentie bereiken. Verander het medium 24 uur voorafgaand aan de functionele studies. Bereid eerst de natriumvrije, chloridevrije bufferoplossing met de reagentia die in het tekstprotocol worden vermeld.

Voeg de reagentia toe aan dubbel gedestilleerd water van weefselkweekkwaliteit. Laat de reagentia oplossen door een nacht op kamertemperatuur te roeren. Nadat de oplossing stabiel is, stelt u de pH in op 7,4 door druppelsgewijs 1 molaire NMDG-oplossing toe te voegen.

Meng gedurende 30 minuten en pas de osmolariteit van de oplossing aan tot een bereik van 300 plus of min 5 millimol per kilogram. Filtreer en bewaar de bufferoplossing in steriele flessen. Los vervolgens 0,5 milligram van de membraanpotentiaalkleurstof op in 1 milliliter natriumvrije, chloridevrije buffer en verwarm de oplossing tot 37 graden Celsius.

Verwijder het kweekmedium uit Calu-3 en Caco-2 cel monolagen. Voeg 195 microliter van de kleurstofoplossing per put toe voor de 96-putplaat en 95 microliter per put voor een plaat met 384 putten. Laat de cellen de kleurstof 35 minuten laden bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Neem vervolgens fluorescentiemetingen met excitatie op 530 nanometer en emissie op 560 nanometer. Neem in eerste instantie continue basislijnmetingen gedurende vijf minuten met intervallen van 30 seconden. Voeg vervolgens 5 microliter 400 micromolaire Forskolin-oplossing toe aan elke put van de 96-putplaat om een uiteindelijke Forskolin-concentratie van één micromolar te krijgen.

Voeg voor de 384-putplaat vijf microliter 20 micromolaire Forskolin-oplossing toe. Neem een stimulatiebeoordeling gedurende 20 minuten met metingen met intervallen van 15 seconden. Voeg vervolgens 5 microliter van een 400 micromolaire oplossing van CFTR-remmer toe aan de 96-well-plaat om een uiteindelijke concentratie van 10 micromolair te krijgen.

Voeg aan de 384-putplaat 5 microliter 200 micromolaire CFTR-remmer toe. Neem een remmingsmeting gedurende 15 minuten met metingen met intervallen van 30 seconden. Kwantificeer de fluorescentie-intensiteitsmetingen van elke put en exporteer de waarden als een spreadsheet.

in kolomformaat, met afzonderlijke putjes. Om forskolin-geïnduceerde veranderingen te berekenen, deelt u de relatieve fluorescentie-eenheidsmetingen van elke put van de 96-putplaat door de laatste fluorescentie-intensiteitsmeting van de basislijnmeting en plot u ze. Meet de piekresponsen als de maximale fluorescentie-intensiteit gemeten vanaf baseline tijdens Forskolin-stimulatie.

Gebruik deze meting, of het gebied onder de curve, om de CFTR-respons te kwantificeren. CFTR-functie werd gedetecteerd als membraandepolarisatie na Forskoline-stimulatie in Caco-2-cellen. Fluoride-efflux werd gedetecteerd als een sterke toename van fluorescentie in vergelijking met DMSO als voertuigbesturing.

Na Forskoline-stimulatie werd het fluorescerende signaal gehandhaafd tot de toevoeging van CFTR-remmer, waarna er een snelle afname van de fluorescentie-intensiteit was. Dit fenomeen was reproduceerbaar in zowel Caco-2- als Calu-3-cellen. CFTR-activiteit werd berekend als het verschil in de maximale verandering in fluorescentie na Forskoline- of DMSO-stimulatie.

Individuele punten varieerden tussen plus of min 3 standaardafwijkingen van het gemiddelde in het geval van Forskolin-stimulatie en de DMSO-controle, wat de reproduceerbaarheid van de test aangeeft. Om de specificiteit van functionele responsen te bevestigen, kunnen deze membraanpotentiaaltests verder worden gevalideerd met behulp van conventionele elektrofysiologische methoden, zoals ussingkamer. Dit platform is in staat om de kloof te overbruggen tussen high-throughput modulatorschermen en heterologe expressiesystemen en tijdrovende bio-elektrische metingen in moeilijk toegankelijke primaire weefsels.