Een high-throughput comet assay-benadering voor het beoordelen van cellulaire DNA-schade

De komeettest wordt veel gebruikt voor het beoordelen van genotoxiciteit. Ons protocol biedt een aantal methodologische voordelen ten opzichte van de standaard komeettest. Onze technologie is gericht op het verticaal vasthouden van de standaard komeetglijbanen en worden verwerkt in batches van 25 in een speciaal gemaakt rek.

Dit omvat elektroforese, dus de tank is kleiner, gebruikt minder buffer en heeft geïntegreerde koeling. Omdat ze in een rek worden gehouden, zijn de delicate gels op de dia's beter beschermd en gaan ze in 25 seconden van oplossing naar oplossing. Met behulp van ons bloedkomeetprotocol kunnen onderzoekers een speldenprik van bloed gebruiken om DNA-schade bij mensen, andere soorten en een breed scala aan potentieel genotoxische milieublootstellingen te bestuderen.

Elk van de verschillende formaten voor de komeettest die microscoopglaasjes gebruiken als de solide ondersteuning voor de komeetgels zijn vatbaar voor onze aanpak. Het cruciale onderdeel van deze techniek is het laden van monsters na het mengen met LMP agarose. Monsters moeten snel worden geladen zonder bubbels te maken en meteen worden bedekt met een afdekslip voordat ze stollen.

Bereid om te beginnen 0,6% laagsmeltpunt agarose in PBS en plaats het in een waterbad bij 37 graden Celsius. Label het matte uiteinde van de voorgecoate dia's met naam, datum en behandelingsinformatie met behulp van een permanente marker of potlood. Plaats een koelplaat op een platte bank en plaats twee bevroren koelpakketten in de schuiflade onder het metalen oppervlak.

Plaats vervolgens de dia's op de koelplaat om één tot twee minuten voor te koelen. Centrifugeer en verwijder het supernatant uit de monsterbuizen en plaats ze onmiddellijk weer op ijs. Resuspendeer de celpellet met 200 microliter van 0,6% laagsmeltpunt en meng door pipetteren.

Voeg vervolgens 80 microliter agarose-bevattende cellen toe aan een gekoelde dia en plaats snel een afdekslip op de gel. Laat de gel één tot twee minuten op de koelplaat zetten. Bereid ondertussen 500 milliliter werkoplossing van lysisbuffer en giet deze in de lysisschaal.

Nadat de gels zijn uitgehard, verwijdert u de afdekglijders snel door de schuif tussen duim en wijsvinger voorzichtig vast te houden en de afdekslip van de gel te schuiven. Plaats de dia's vervolgens in een diadrager met alle zwarte stippen op de dia's in dezelfde richting. Plaats de schuifdrager in de lysisschaal.

Sluit de deksel van de lysisschaal en zet deze voor incubatie. Verwijder voorzichtig de schuifdrager van de lysisschaal zonder de gels te storen. Plaats de schuifdrager voorzichtig in een voorgeladen afwasbak met ijskoud dubbel gedestilleerd water.

Zorg ervoor dat de dia's volledig ondergedompeld zijn en laat de installatie 30 minuten staan. Plaats een bevroren koelpakket onder de elektroforesetank om de optimale buffertemperatuur te behouden. Voeg vervolgens een ijskoude elektroforese-werkoplossing toe aan de tank en breng de schuifdrager erin over.

Oriënteer de dia's zodanig dat de celbevattende gels naar de kathode wijzen. Incubeer de dia's in de elektroforesetank gedurende 20 minuten om het DNA te laten afwikkelen. Schakel vervolgens de voeding in om gedurende 20 minuten elektroforese uit te voeren op 1,19 volt per centimeter.

Nadat de elektroforese is voltooid, schakelt u de voeding uit en verwijdert u de schuifdrager uit de elektroforesetank. Laat de schuifdrager 30 seconden uitlekken op tissuepapier. Plaats vervolgens de schuifdrager in een schaal met neutralisatiebuffer en laat deze 20 minuten staan.

Plaats het vervolgens in een wasschaal met ijskoud dubbel gedestilleerd water en laat het 20 minuten staan. Haal na het wassen de schuifdrager uit het water en laat de glaasjes een uur drogen in een couveuse bij 37 graden Celsius. Om de dia's te hydrateren, breng je de diadrager over naar een wasbak met ijskoud dubbel gedestilleerd water en laat je deze 30 minuten staan.

Plaats vervolgens de schuifdrager in een kleuringsschaal met 2,5 microgram per milliliter propidiumjodide-oplossing. Sluit het deksel van de vlekschaal en incubeer deze gedurende 20 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Breng na incubatie de schuifdrager over naar een aparte schaal en was deze gedurende 20 minuten met ijskoud dubbel gedestilleerd water.

Haal de schuifdrager uit de schaal en droog deze volledig in het donker, hetzij in een incubator van 37 graden Celsius of bij kamertemperatuur. Nadat de dia's volledig zijn opgedroogd, bewaar je ze in een diavak in het donker totdat ze klaar zijn voor beeldanalyse. Menselijke keratinocyten werden bestraald met verschillende doses UVA en UVB of behandeld met 50-micromolair waterstofperoxide om DNA-schade te induceren.

De optimale spanning was 1,19 volt centimeter, omdat het de meest gevoelige respons en het grootste percentage staart-DNA induceert. Menselijk volbloed werd bestraald met verschillende doses UVA en behandeld met verschillende concentraties Fpg. High-throughput alkalische komeettest onthulde dat de optimale niveaus van DNA-schade werden geïnduceerd met vier eenheden per milliliter Fpg.

De eierstokkankercellijn SK-OV-3 werd behandeld met een combinatie van cisplatine en waterstofperoxide. De onbelichte cellen vertoonden geen schade. Blootstelling aan waterstofperoxide alleen genereerde een significant gemiddeld Olive tail-moment in vergelijking met de cellen waarin DNA intrastrand-crosslinks werden geïnduceerd.

Na behandeling met 100-micromolair cisplatine namen DNA intrastrand crosslinks toe met een piek na 12 uur, waarna de niveaus na 30 uur tot nul daalden Het is essentieel om het ijspak in de elektroforesetank te plaatsen en dia's gedurende 20 minuten te incuberen om DNA te ontspannen vóór de elektroforese. Deze stap zal het beschadigde DNA helpen om per stroom te reizen. Door de test uit te voeren met verticaal geplaatste dia's konden we de komeettest automatiseren.

Bovendien heeft onze techniek de komeettest voor onderzoek vereenvoudigd.