Beoordeling van energiesubstraatoxidatie in vitro met ¹⁴CO_2-vangst

Het gebruik van verschillende energiesubstraten is zowel celtypespecifiek als ziekte-indicatief. Het meten van het verbruik van de specifieke substraten kan licht werpen op zowel de normale biologie als de pathologie. De techniek heeft geen gespecialiseerde apparatuur nodig en is eenvoudig op te schalen.

Het is ook gemakkelijker te gebruiken dan eerdere gepubliceerde methoden. Inzicht in veranderingen in substraatoxidatiesnelheid zal de ontwikkeling van voedings- en farmacologische interventies voor metabole stoornissen mogelijk maken. Hoewel aangetoond met botweefsel, is deze techniek gemakkelijk aan te passen om metabole flexibiliteit in alle celtypen te bestuderen en inzicht te krijgen in zowel de oorzaken als de gevolgen van metabole verschuivingen.

Na het offeren van de pups van drie tot vijf postnatale dagen, breng ze over naar ijskoude D PBS met penicilline streptomycine dubbele antibiotische oplossing. Stel de calvaria bloot door de huid en het zachte weefsel te verwijderen. Verzamel het middelste gebied door de omliggende weefsels van achter naar voren in D PBS te snijden.

Kras de binnen- en buitenoppervlakken van de calvaria voorzichtig met een pincet om de cellen vrij te maken bij de daaropvolgende spijsvertering. Bereid 2 en 4 milligram per milliliter oplossingen van collagenase type twee in D PBS en filter elke oplossing met een vers filter van 0,22 micrometer. Verteer eerst de gereinigde calvaria met twee milligram per milliliter collagenase-oplossing gedurende 15 minuten en gooi vervolgens de digestieoplossing weg.

Verteer vervolgens de schone monsters in vier milligram per milliliter collagenase-oplossing driemaal gedurende 15 minuten per keer. Trek vervolgens de verteringsoplossing en bewaar deze. Filtreer de digestieoplossing door 70 micrometer celzeefjes en centrifugeer het filtraat bij 300 RCF gedurende vijf minuten.

Resuspensie van de celkorrel in volledig MEM-alfamedium met 10% FBS en penicilline streptomycine dubbele antibiotische oplossing. Tel en zaai de cellen in een plaat van 10 centimeter. Kweek de cellen in een incubator van 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende drie dagen.

Dissociëer vervolgens de cellen bij 37 graden Celsius met 0,25 Trypsine EDTA. Na de vertering, tel en zaai de cellen in een 24 well cel kweekplaat met een compleet MEM alfa medium met 10% FBS en penicilline streptomycine dual antibioticum oplossing. Zaai ten minste vier putjes per celtype per substraat en ten minste drie extra putjes voor elk celtype voor het tellen vóór de test.

Kweek de cellen 's nachts bij 37 graden Celsius. Na het verwijderen van de spier en het bindweefsel van acht weken oude muizen en het verzamelen van dijbenen en tibia's, knip en gooi beide uiteinden van de botten met een scherpe schaar weg. Spoel het beenmerg uit één dijbeen en één scheenbeen in een verse petrischaal van 10 centimeter met een spuit uitgerust met een naald van 23 gauge met 15 milliliter volledig MEM-alfamedium met 10% FBS penicilline streptomycine dubbele antibioticumoplossing en 10% CGM 14 12 geconditioneerd medium.

Kweek de cellen in de petrischaal in een incubator van 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Gooi na drie dagen de kweekmedia weg en spoel de cellen met D PBS. Dissociëer de aangehechte cellen bij 37 graden Celsius met 0,25% Trypsine EDTA gedurende vijf minuten.

Na het centrifugeren suspensie van de celkorrel opnieuw in het BMM-medium. Tel en zaai de cellen in een 24 put celkweekplaat volgens de eerder beschreven procedure. Cultuur bij 37 graden Celsius 's nachts in het BMM-medium voordat de testen worden gestart.

Was de cellen in de extra putjes twee keer met D PBS. Dissocieer de cellen met 0,25% Trypsine EDTA. Re suspensie 20 microliter verteerde cellen in D PBS.

Bepaal met 20 microliter acridine orange en propidiumjodidekleurstofoplossing het aantal levende cellen met een geautomatiseerde celteller en noteer het aantal. Was de cellen in de testputten tweemaal met D PBS. Voeg 500 microliter heet medium toe aan elke testput in de ram-aangewezen weefselkweekkap.

Na het afdichten van de plaat met parafilm, incubeer de cellen in een RAM-aangewezen incubator bij 37 graden Celsius gedurende 4 uur. Snijd tijdens de incubatie het filtreerpapier in cirkelvormige stukken, iets groter dan het gebied in de dop van de microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en steek het papier goed in de dop. Voeg 200 microliter van één 1 molair perchloorzuur toe aan elke buis en 20 microliter natriumhydroxide aan het filtreerpapier dat in de dop is aangebracht.

Breng na het uitbroeden van de cellen 400 microliter kweekmedium van elke put over naar de voorbereide buizen en sluit de doppen onmiddellijk. Laat de buizen een uur in een buizenrek op kamertemperatuur staan. Parallelae stelt tijdens de incubatie voor elke buis een scintillatieflacon op en vult deze met vier milliliter scintillatievloeistof.

Breng elk stuk filtreerpapier over in een injectieflacon met scintillatie en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voer veegtests uit op de weefselkweekkap, het waterbad, de koelkast, de incubator, de gootsteen, de grond en elk ander werkgebied op mogelijke RAM-verontreiniging. Doe de papieren doekjes in scintillatieflacons met scintillatievloeistof.

Meet de koolstof 14-radioactiviteit in de scintillatieflacons met een scintillatieteller en noteer de leesresultaten. Ontsmet de werkomgeving, indien nodig volgens stralingsveiligheidsrichtlijnen. De figuur vergelijkt substraatoxidatie door primaire calvaria pre-osteoblasten versus BMM's.

Nadat de primaire cellen 's nachts in volledig MEM-alfamedium zijn gepasseerd en gekweekt, bereiken ze meestal 80 tot 90% confluentie en vertonen ze hun karakteristieke morfologie. De calvariale pre-osteoblasten zijn aanzienlijk groter dan BMM's. De resultaten van substraatoxidatie toonden aan dat de oxidatiesnelheid voor elk substraat significant hoger is in calvariale pre-osteoblasten dan BMM's, wat waarschijnlijk wijst op een hogere energieproductie door oxidatieve fosforylering in de pre-osteoblasten.

Het ingebrachte derde papier moet iets groter zijn dan een 1,7 milliliter ebin bovenbuisdop. Deze methode kan worden gebruikt in combinatie met zuurstofverbruik en om de totale snelheid van oxidatieve fosforylering en lactatieve productie in de cellen te bepalen. Dit protocol kan worden gebruikt om het substraatgebruik te bepalen tijdens verschillende differentiatiestadia of ziekte-instellingen.

Met deze kennis kunnen we interventies ontwikkelen voor stofwisselingsstoornissen.