Name: Beoordeling van energiesubstraatoxidatie in vitro met 14CO2-vangst (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Leer een gebruiksvriendelijke methode voor het meten van substraatoxidatie in vitro via 14CO2-vangst. Deze techniek is toepasbaar op diverse celtypen en helpt onderzoekers bij het bestuderen van metabole stoornissen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-subsidie R01 AR060456 (FL). We bedanken Dr. Michael Robinson en Elizabeth Krizman (The Children's Hospital of Philadelphia) voor hun genereuze hulp bij de sprankelende teller.

Het gebruik van radioactieve materialen (RAM) vereist voorafgaande goedkeuring door een aangewezen veiligheidscomité bij elke instelling. RAMs die in dit protocol worden gebruikt, zijn goedgekeurd door Environmental Health & Radiation Safety (EHRS) aan de Universiteit van Pennsylvania. Het gebruik van dieren vereist voorafgaande goedkeuring door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) in de thuisinstelling. De volgende studie werd goedgekeurd door IACUC in het Children's Hospital van Philadelphia.
1. Bereiding van stamoplossingen voor 14C-gelabelde substraten
<ol><li>Maak 4 mM runderserumalbumine (BSA) stamoplossing door 11 g BSA en 33,1 ml Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) te mengen en voorzichtig te schudden bij kamertemperatuur gedurende ~ 3 uur totdat BSA volledig is opgelost. Verwarm de BSA-stamoplossing voor gebruik in een waterbad van 70 °C.</li>
	<li>Droog 50 μCi 14C-oleaat (50 μCi/μmol in ethanol) aan de lucht in de injectieflacon met het deksel er gedurende 8 uur af in een speciale RAM-werkkap. Voeg 312,5 μl H2O en vervolgens 3,5 mg (11,5 μmol) natriumoleaat toe. Meng.</li>
	<li>Verwarm de resulterende oplossing tot 70 °C in een waterbad. Voeg 0,9375 ml van de voorgewarmde BSA-stamoplossing toe tot een 10 mM hot oleate stock-oplossing (met een verhouding van 1:11,5 van 14C-oleaat tot ongelabeld oleaat). Vul de stamoplossing toe en bewaar deze bij -20 °C voor langdurig gebruik.</li>
	<li>Gebruik 14C-glucose en 14C-glutamine direct na het ontdooien.</li>
</ol>2. Bereiding van medium dat 14C-gelabelde substraten bevat
OPMERKING: Om betrouwbare concentraties van energiesubstraten in de media te garanderen, moeten op maat gemaakte media worden gebruikt met verse substraten die kort voor gebruik worden toegevoegd. Hier wordt een op maat gemaakt Minimum Essential Medium (MEMα) zonder glucose, pyruvaat, glutamine, fenolrood of natriumbicarbonaat gebruikt. Voor elk celtype moet echter een optimaal medium worden bepaald.
<ol><li>Reconstitueer 8,67 g van het medium poeder in 1 L gezuiverd water. Voeg 2,2 g natriumbicarbonaat toe om een pH van 7,4 te bereiken en filtreer de oplossing met behulp van vacuümfiltratie van 0,22 μm.</li>
	<li>Voeg verse ingrediënten toe om het volledige medium (cMEMα) te verkrijgen met eindconcentraties van 5,5 mM glucose, 2 mM glutamine, 1 mM pyruvaat en 10% foetaal runderserum (FBS). Verder supplement cMEMα met 100 mM L-carnitine en 10 μM HEPES om vetzuuroxidatie te vergemakkelijken.</li>
	<li>Voeg vlak voor gebruik 14C-gelabelde substraten toe aan vers bereide cMEMα om hete media te maken. Om het oleaathete medium te maken, voegt u de 10 mM hete oleaatvoorraadoplossing toe aan cMEMα voor een eindconcentratie van 100 μM oleaat (1:100 verdunning, uiteindelijke radioactiviteit 0,4 μCi/ml). OPMERKING: De 10 mM hete oleaatvoorraad met een verhouding van 1:11,5 warm:koud oleaat (zie stap 1.3) wordt gebruikt om een fysiologisch niveau van 100 μM totaal oleaat in de media te bereiken en tegelijkertijd de hoeveelheid radioactief materiaal te minimaliseren.</li>
	<li>Maak 10 mM ongelabelde oleaatbouillon door 24,36 mg natriumoleaat toe te voegen aan 2 ml H2O in een waterbad bij 70 °C gedurende ~ 20 minuten totdat het volledig is opgelost voordat het snel wordt gemengd met 6 ml van de 4 mM BSA-stamoplossing voorgewarmd tot 70 °C. Breng gedurende 1 uur over in een waterbad van 37 °C en filtreer door een filter van 0,22 μm. Aliquot en bewaren bij -20 °C voor langdurig gebruik.</li>
	<li>Om glucose heet medium te maken, voegt u 14C-glucose toe aan een eindconcentratie van 1,333 μM (1:4.125 verdunning, uiteindelijke radioactiviteit 0,4 μCi/ml). Om glutamine heet medium te maken, voegt u 14C-glutamine toe aan de eindconcentratie van 2 μM (1:1.000 verdunning, uiteindelijke radioactiviteit 0,4 μCi/ml).</li>
	<li>Vul het glucose- en glutaminehete medium aan met een 10 mM stockoplossing van ongelabeld oleaat uit stap 2.4 om de uiteindelijke concentratie van 100 μM oleaat te bereiken, dezelfde als die in het oleaathete medium.</li>
</ol>3. Bereiding van cellen
OPMERKING: Calvariale preosteoblasten en beenmergmacrofagen worden hier als voorbeelden gebruikt. Gebruikers moeten hun celtype naar keuze voorbereiden volgens de juiste protocollen. Optimaliseer de concentratie van collagenase II voor gebruik voor de spijsvertering in proefexperimenten, omdat de enzymatische activiteit tussen verschillende partijen kan variëren.
<ol><li>Isolatie en cultuur van calvariale preosteoblasten<ol>
<li>Offer postnatale dag 3-5 (P3-5) pups door onthoofding en breng ze over naar ijskoude DPBS met penicilline-streptomycine (P / S).</li>
		<li>Stel de calvaria bloot door de huid en het zachte weefsel te verwijderen. Verzamel het middelste gebied door de omliggende weefsels van achter naar voren weg te snijden in DPBS (figuur 1A). Kras de binnen- en buitenoppervlakken van de calvaria voorzichtig met een pincet om de cellen vrij te maken bij de daaropvolgende spijsvertering.</li>
		<li>Bereid een 2 mg/ml en een 4 mg/ml oplossing van Collagenase type II in DPBS en filtreer elke oplossing met een vers filter van 0,22 μm. Verteer de gereinigde calvaria eerst met de 2 mg/ml collagenase-oplossing gedurende 15 minuten en gooi de digestieoplossing weg. Verteer de gereinigde monsters in 4 mg / ml collagenase-oplossing 3 keer gedurende 15 minuten per keer, bundel en bewaar de verteringsoplossing.</li>
		<li>Filtreer de digestieoplossing door 70 μm cel strainers en centrifugeer het filtraat bij 300 × g gedurende 5 minuten. Resuspend de celkorrel in cMEMα (zie stap 2.2) met 10% FBS en P/S.</li>
		<li>Tel en zaai de cellen op 4 × 104 cellen/cm2 in 10 cm platen. Kweek de cellen in een incubator van 37 °C met 5% CO2 gedurende 3 dagen.</li>
		<li>Dissocieer de cellen bij 37 °C met 0,25% trypsine-EDTA. Tel en zaai de cellen in 24-well celkweekplaten met cMEMα die 10% FBS en P/S bevatten bij 7,5 × 105/cm2. Zaai ten minste 4 putjes per celtype per substraat en minstens drie extra putjes voor elk celtype voor celtelling vóór de test.</li>
		<li>Kweek de cellen bij 37 °C 's nachts vóór de oxidatietests van het substraat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolatie en cultuur van BMM's OPMERKING: Cultuur van BMM's vereist macrofaag koloniestimulerende factor (M-CSF), die commercieel kan worden gekocht als een recombinant eiwit. Geconditioneerd medium uit de cellijn CMG14-12 ontworpen om M-CSF uit te drukken is een economisch alternatief dat hier wordt gebruikt13.<ol>
<li>Verzamel dijbenen en tibia's van 8 weken oude muizen na het verwijderen van de spier en bindweefsels. Knip en gooi beide uiteinden van de botten weg met een scherpe schaar.</li>
		<li>Spoel het beenmerg uit één dijbeen en één scheenbeen in een petrischaaltje van 10 cm met een spuit voorzien van een naald van 23 G met 15 ml cMEMα met 10% FBS, P/S en 10% CMG14-12 geconditioneerd medium (BMM-medium). Kweek de cellen in de petrischaal in een incubator van 37 °C met 5% CO2.</li>
		<li>Gooi na 3 dagen de kweekmedia weg en spoel af met DPBS. Dissocieer de aangehechte cellen bij 37 °C met 0,25% trypsine-EDTA gedurende 5 minuten. Centrifugeer en resuspend de celkorrel in het BMM-medium.</li>
		<li>Tel en zaai de cellen in 24-well celkweekplaten op 7,5 × 105/cm2 op dezelfde manier als beschreven in 3.1.6. Kweek bij 37 °C 's nachts in het BMM-medium voordat met de testen wordt begonnen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Substraatoxidatietest met CO2-val
OPMERKING: Voor elk celtype moet een geschikte zaaidichtheid worden bepaald om 80-90% samenvloeiing te bereiken vóór het begin van de test. Merk op dat celdichtheid de metabole toestand van de cellen kan beïnvloeden.
<ol><li>Was de cellen in de extra putjes twee keer met DPBS. Dissociëer de cellen met 0,25% trypsine-EDTA en gemengde 20 μL cellen geresuspendeerd in DPBS met 20 μL acridine sinaasappel/propidiumjodide (AO/PI) kant-en-klare commerciële kleurstofoplossing. Bepaal het aantal levende cellen met een geautomatiseerde celteller en noteer het aantal voor de uiteindelijke berekeningen.</li>
	<li>Was de cellen in de testputten tweemaal met DPBS. Voeg 500 μL heet medium toe aan elke testput in de door RAM aangewezen weefselkweekkap. Sluit de platen af met parafilm en incubeer de cellen in een door RAM aangewezen incubator bij 37 °C gedurende 4 uur.</li>
	<li>Snijd tijdens de incubatie het filtreerpapier in cirkelvormige stukken die iets groter zijn dan het gebied in de dop van microcentrifugebuizen van 1,5 ml en steek het papier goed in de dop (figuur 1B). Voeg 200 μL 1 M perchloorzuur toe aan elke buis en 20 μL natriumhydroxide aan het filtreerpapier dat in de dop is aangebracht.</li>
	<li>Breng na incubatie van de cellen 400 μL kweekmedium van elke put over naar de voorbereide buizen en sluit de doppen onmiddellijk. Laat de buizen gedurende 1 uur in een buizenrek op kamertemperatuur.</li>
	<li>Stel tijdens de incubatie een scintillatieflacon in voor elke buis en vul deze met 4 ml scintillatievloeistof. Breng elk stuk filtreerpapier over in een injectieflacon met scintillatie en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voer veegtests uit op de weefselkweekkap, het waterbad (gebruikt voor 14C-oleaatbereiding), koelkast, incubator, gootsteen, grond en elk ander werkgebied voor mogelijke RAM-verontreiniging. Doe de papieren doekjes in scintillatieflacons met scintillatievloeistof.</li>
	<li>Meet 14C radioactiviteit in de scintillatieflacons met een scintillatieteller. Noteer de leesresultaten. Ontsmet de werkomgeving indien nodig volgens de richtlijnen voor stralingsveiligheid.</li>
</ol>5. Data-analyse
OPMERKING: Ervan uitgaande dat elk substraat volledig is geoxideerd om CO2 vrij te maken, kan de oxidatiesnelheid van het substraat worden berekend op basis van de opgesloten CO2-radioactiviteit .
<ol><li>Bereken de oxidatiesnelheid van het substraat met behulp van Eq (1) en de X-, Y- en Z-waarden in tabel 1 voor verschillende substraten. Substraat oxidatiesnelheid (μmol/cel/h) = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63568/63568eq01.jpg">   (1)<ol>
<li>Bereken de totale desintegraties per min (DPM) voor elke reactie goed. Gebruik voor X de DPM-waarde (scintillatietelleraflezing) van 0,4 ml van het reactiemedium dat wordt gebruikt voor CO2-opvang van 0,5 ml van het totale reactiemedium. Daarom is de totale DPM van elke reactieput X × 1,25.</li>
		<li>Deel de totale DPM door een factor 2.220.000 om te converteren naar μCi.</li>
		<li>Converteer de radioactiviteit in μCi naar het aantal van 14C-gelabelde moleculen. Deel de μCi-waarde door de specifieke activiteit (Y) van elk gelabeld substraat. Gebruik de volgende Y-waarden (tabel 1): 14C-glucose: 300 mCi/mmol; 14 C-glutamine: 200 mCi/mmol; 14 C-oleaat: 50 mCi/mmol.</li>
		<li>Bereken het totale aantal geoxideerde moleculen van de geoxideerde 14C-gelabelde moleculen door deze laatste te vermenigvuldigen met de hot-to-total verdunningsfactor (Z). Gebruik de volgende Z-waarden (tabel 1): Glucose: 4.125; glutamine: 1.000; oleaat: 12,5.</li>
		<li>Deel het resulterende product door het celnummer (cel#) en 4 (voor de reactietijd van 4 uur) om de oxidatiesnelheid van het substraat per cel te bepalen. Gebruik de cel# bepaald in de parallelle putjes aan het begin van de test.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hargreaves, M., Spriet, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+energy+metabolism+during+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle energy metabolism during exercise.</a> Nature Metabolism. 2 (9), 817-828 (2020).</li>
<li>Jeukendrup, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fat+metabolism+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of fat metabolism in skeletal muscle.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 967, 217-235 (2002).</li>
<li>Randle, P. J., Garland, P. B., Hales, C. N., Newsholme, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glucose+fatty-acid+cycle.+Its+role+in+insulin+sensitivity+and+the+metabolic+disturbances+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus.</a> Lancet. 1 (7285), 785-789 (1963).</li>
<li>Randle, P. J., Newsholme, E. A., Garland, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucose+uptake+by+muscle.+8.+Effects+of+fatty+acids%2C+ketone+bodies+and+pyruvate%2C+and+of+alloxan-diabetes+and+starvation%2C+on+the+uptake+and+metabolic+fate+of+glucose+in+rat+heart+and+diaphragm+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucose uptake by muscle. 8. Effects of fatty acids, ketone bodies and pyruvate, and of alloxan-diabetes and starvation, on the uptake and metabolic fate of glucose in rat heart and diaphragm muscles.</a> Biochemical Journal. 93 (3), 652-665 (1964).</li>
<li>Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+energy-providing+substrates+in+the+isolated+working+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart.</a> Biochemical Journal. 186 (3), 701-711 (1980).</li>
<li>Cha, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+fatty+acid+metabolism+in+type+2+diabetic+skeletal+muscle+cells+is+reversed+by+PPARgamma+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Impaired fatty acid metabolism in type 2 diabetic skeletal muscle cells is reversed by PPARgamma agonists.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 289 (1), 151-159 (2005).</li>
<li>Lee, W. C., Guntur, A. R., Long, F., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+the+osteoblast%3A+implications+for+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of the osteoblast: implications for osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 38 (3), 255-266 (2017).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+aerobic+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+are+required+for+osteoclast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Both aerobic glycolysis and mitochondrial respiration are required for osteoclast differentiation.</a> FASEB Journal. 34 (8), 11058-11067 (2020).</li>
<li>Lee, W. C., Ji, X., Nissim, I., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malic+enzyme+couples+mitochondria+with+aerobic+glycolysis+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Malic enzyme couples mitochondria with aerobic glycolysis in osteoblasts.</a> Cell Reports. 32 (10), 108108(2020).</li>
<li>Kim, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+oxidation+by+the+osteoblast+is+required+for+normal+bone+acquisition+in+a+sex-+and+diet-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Fatty acid oxidation by the osteoblast is required for normal bone acquisition in a sex- and diet-dependent manner.</a> JCI Insight. 2 (16), 92704(2017).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+metabolism+regulates+proliferation+and+lineage+allocation+in+skeletal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells.</a> Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).</li>
<li>Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glutamine+catabolism+mediates+bone+anabolism+in+response+to+WNT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).</li>
<li>Takeshita, S., Kaji, K., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+new+osteoclast+progenitor+with+macrophage+phenotypes+being+able+to+differentiate+into+mature+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the new osteoclast progenitor with macrophage phenotypes being able to differentiate into mature osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 15 (8), 1477-1488 (2000).</li>
<li>Itoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dichloroacetate+effects+on+glucose+and+lactate+oxidation+by+neurons+and+astroglia+in+vitro+and+on+glucose+utilization+by+brain+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dichloroacetate effects on glucose and lactate oxidation by neurons and astroglia in vitro and on glucose utilization by brain in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4879-4884 (2003).</li>
<li>Oba, M., Baldwin, R. L. 4th, Bequette, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+glucose%2C+glutamate%2C+and+glutamine+by+isolated+ovine+enterocytes+in+vitro+is+decreased+by+the+presence+of+other+metabolic+fuels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Oxidation of glucose, glutamate, and glutamine by isolated ovine enterocytes in vitro is decreased by the presence of other metabolic fuels.</a> Journal of Animal Science. 82 (2), 479-486 (2004).</li>
<li>Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTH+promotes+bone+anabolism+by+stimulating+aerobic+glycolysis+via+IGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).</li>
<li>Huynh, F. K., Green, M. F., Koves, T. R., Hirschey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+fatty+acid+oxidation+rates+in+animal+tissues+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines.</a> Methods in Enzymology. 542, 391-405 (2014).</li>
<li>Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+composition+of+adipose+tissue+and+blood+in+humans+and+its+use+as+a+biomarker+of+dietary+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake.</a> Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).</li>
<li>Abdelmagid, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+profiling+of+plasma+fatty+acid+concentrations+in+young+healthy+Canadian+adults%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive profiling of plasma fatty acid concentrations in young healthy Canadian adults.</a> PLoS One. 10 (2), 0116195(2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Het protocol biedt een eenvoudig te gebruiken methode om de oxidatiesnelheid van belangrijke energiesubstraten te bepalen. Het is een eenvoudiger alternatief voor andere protocollen die kolven gebruiken die een centrale put bevatten en afgedekt zijn met rubberen stoppen 14,15,16. Hoewel de voorbeeldstudie hier wordt uitgevoerd met celkweek, kan de methode gemakkelijk worden aangepast voor weefselexplantaten of weefselhomogenaten...

Oxidatieve fosforylering (OXPHOS) in eukaryoten is het proces waarbij voedingsstoffen worden afgebroken in mitochondriën om chemische energie vrij te maken in de vorm van ATP door zuurstofverbruik.  Katabolisme van verschillende substraten in mitochondriën via de tricarbonzuur (TCA) cyclus genereert weinig ATP-moleculen direct, maar slaat eerder energie op door reductie van de elektronendragers nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +) en flavine adenine dinucleotide (FAD +). De gereduceerde dragers worden vervolgens geoxideerd door ETC op het binnenmembraan van mitochondriën om een protonconcentratiegradiënt over het membraan te genereren. De protonen stromen uiteindelijk hun gradiënt terug naar de mitochondriale matrix via ATP-synthase om ATP te produceren. OXPHOS is de meest efficiënte manier van ATP-productie uit energiesubstraten en heeft over het algemeen de voorkeur in aerobe omgevingen. Eerder werd gedacht dat aerobe glycolyse - productie van lactaat uit glucose terwijl zuurstof aanwezig is - pathofysiologisch was, vaak een kenmerk van kankercellen. Meer en meer wordt ontdekt dat sommige normale celtypen aerobe glycolyse gebruiken om redenen die nog niet volledig zijn ontcijferd.
Metabole flexibiliteit is het vermogen van cellen of organismen om zich aan te passen aan veranderende energiebehoeften en beschikbare brandstofbronnen. Aan de energetische vraag naar skeletspieren wordt bijvoorbeeld voornamelijk voldaan door OXPHOS in steady state, maar door anaerobe glycolyse tijdens intensieve training1. Naarmate de inspanningsduur toeneemt, dragen glucose- en vetzuuroxidatie meer bij aan de algehele energieproductie2. Substraatgebruik is echter niet alleen afhankelijk van beschikbaarheid, omdat substraten antagonistisch concurreren tijdens oxidatie. Met name is aangetoond dat vetzuuroxidatie het glucosegebruik door skeletspieren remt in een fenomeen dat bekend staat als het Randle-effect3. Een wederkerig effect werd aangetoond door latere studies 4,5. Bovendien worden veel ziekten geassocieerd met een verandering in substraatvoorkeur en de ontwikkeling van metabole inflexibiliteit in cellen. Vetzuuroxidatie is bijvoorbeeld verminderd in de skeletspieren van type II diabetespatiënten in vergelijking met normale controlepersonen6. De metabole veranderingen in ziekte-instellingen zijn een onderwerp van intensief onderzoek omdat ze kunnen bijdragen aan de pathogenese.
Het energiemetabolisme in skeletceltypen is relatief onderbelicht, maar heeft de laatste jaren aandacht gekregen7. Eerder werk heeft aangetoond dat aerobe glycolyse de dominante energieroute is in calvariale osteoblasten, terwijl glucose-oxidatie via de TCA-cyclus een rol speelt bij osteoclastenvorming 8,9. Anderen hebben bewijs geleverd voor vetzuren als energiebron voor osteoblasten10. Glutaminekatabolisme heeft ook aangetoond dat het osteoblastdifferentiatie van de voorlopersondersteunt 11,12. Een uitgebreid begrip van substraatgebruik door verschillende skeletceltypen ontbreekt echter nog steeds. Bovendien wordt verwacht dat veranderingen in het cellulaire metabolisme tijdens celdifferentiatie of als reactie op pathologische signalen het gebruik van brandstofsubstraat zullen veranderen. Hieronder wordt een eenvoudig te gebruiken protocol beschreven voor het testen van substraatoxidatie in vitro.

<table><tbody><tr><td>0.22 &micro;m filters</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGVM33RS</td><td>Worden gebruikt om BSA-oplossing te filteren</td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Dissociëren van cellen van celkweekplaten</td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf tubes</td><td>PR1MA</td><td>PR MCT17 RB</td><td>Worden gebruikt voor reactie-incubatie</td></tr><tr><td>10 cm plates</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>Worden gebruikt voor celkweek</td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>BD</td><td>302995</td><td>Worden gebruikt om beenmerg uit lange botten te spoelen</td></tr><tr><td>10% FBS</td><td>Atlanta biologicals</td><td>S11550</td><td>Voor de bereiding van celkweekmedium</td></tr><tr><td>14C-Glucose</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC042X050UC</td><td>Worden gebruikt om heet medium te maken</td></tr><tr><td>14C-glutamine</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC451050UC</td><td>Worden gebruikt om heet medium te maken</td></tr><tr><td>14C-oleaat</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC317050UC</td><td>Worden gebruikt om heet medium te maken</td></tr><tr><td>23 G naald</td><td>BD</td><td>305120</td><td>Worden gebruikt om beenmerg uit lange botten te spoelen</td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>TPP</td><td>92024</td><td>Worden gebruikt voor celkweek</td></tr><tr><td>70 &mu;m celstrainers</td><td>MIDSCI</td><td>70CELL</td><td>Worden gebruikt om supernatant te filteren tijdens cavariale vertering</td></tr><tr><td>Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) kleurstof</td><td>Nexcelom Biosciences</td><td>CS2-0106</td><td>Kleurt levende cellen om de zaaddichtheid te bepalen</td></tr><tr><td>Bovine Serum Ablumin</td><td>Proliant Biologicals</td><td>68700</td><td>Worden gebruikt voor vetzuurconjugatie</td></tr><tr><td>Cellometer Auto 2000</td><td>Nexcelom Biosciences</td><td></td><td>Bepaalt het aantal levensvatbare cellen</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Fisher</td><td>Legend Micro 21R</td><td>Worden gebruikt om cellen te pellen</td></tr><tr><td>Collageenase type II</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>Dissociëren van cellen uit weefsel</td></tr><tr><td>Custom MEM alpha</td><td>GIBCO</td><td>SKU: ME 18459P1</td><td>Worden gebruikt om aangepast heet medium te maken</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Worden gebruikt om reagentia op te lossen en te verdunnen, en kweekschalen te wassen</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Millipore-Sigma</td><td>WHA1001090</td><td>Vang CO2 met natriumhydroxide</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>g7528</td><td>Worden gebruikt om aangepast medium te maken</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Vang CO2 tijdens celkweek</td></tr><tr><td>L-carnitine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0283</td><td>Aangevuld voor vetzuuroxidatie</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>g3126</td><td>Worden gebruikt om aangepast medium te maken</td></tr><tr><td>MEM alpha</td><td>Thermo</td><td>A10490</td><td>Celkweekmedium</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pecheney Plastic Packaging</td><td>PM998</td><td>Worden gebruikt om celkweekschalen te verzegelen</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>Voorkomt besmetting in celkweek</td></tr><tr><td>Perchlorazuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244252</td><td>Geeft CO2 vrij tijdens metabolisch onderzoek</td></tr><tr><td>Pyrofeenzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p5280</td><td>Worden gebruikt om aangepast medium te maken</td></tr><tr><td>Scintillatieteller</td><td>Beckman Coulter</td><td>LS6500</td><td>Bepaalt de radioactiviteit van het filterpapier</td></tr><tr><td>Scintillatievloeistof</td><td>MP Biomedicals</td><td>882453</td><td>Absorbeert de energie die wordt uitgezonden door RAM's en geeft deze opnieuw uit als lichtflitsen</td></tr><tr><td>Scintillatieglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-1</td><td>Reactiecontainers voor scintillatievloeistof</td></tr><tr><td>Natriumcarbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Balansbuffer voor medium</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>58045</td><td>Vang CO2 tijdens metabole bepaling</td></tr><tr><td>Natriumoleaat</td><td>SANTA CRUZ</td><td>SC-215879</td><td>BSA-geconjugeerd vetzuurpreparaat</td></tr><tr><td>Vacuumfiltratie 1000</td><td>TPP</td><td>99950</td><td>Filter cMEM&alpha;</td></tr></tbody></table>

beoordeling van energiesubstraatoxidatie in vitro met 14co2-vangst

Assessing Energy Substrate Oxidation In Vitro with 14CO2 Trapping

Mitochondriën herbergen de machines voor de tricarbonzuur (TCA) cyclus en elektronentransportketen (ETC), die adenosinetrifosfaat (ATP) genereren om de energiehomeostase te behouden. Glucose, vetzuren en aminozuren zijn de belangrijkste energiesubstraten die mitochondriale ademhaling in de meeste somatische cellen voeden. Er zijn aanwijzingen dat verschillende celtypen een duidelijke voorkeur kunnen hebben voor bepaalde substraten. Substraatgebruik door verschillende cellen in het skelet is echter niet in detail bestudeerd. Bovendien, aangezien het cellulaire metabolisme is afgestemd op fysiologische en pathofysiologische veranderingen, kunnen directe beoordelingen van substraatafhankelijkheid in skeletcellen belangrijke inzichten verschaffen in de pathogenese van botziekten.
Het volgende protocol is gebaseerd op het principe van kooldioxide-afgifte uit substraatmoleculen na oxidatieve fosforylering. Door substraten te gebruiken die radioactief gelabelde koolstofatomen (14C) bevatten, biedt de methode een gevoelige en eenvoudig te gebruiken test voor de snelheid van substraatoxidatie in celkweek. Een casestudy met primaire calvariale preosteoblasten versus beenmerg-afgeleide macrofagen (BMM's) toont een verschillend gebruik van de belangrijkste substraten tussen de twee celtypen.

In dit voorbeeld wordt de CO 2-vangmethode gebruikt om substraatoxidatie door primaire calvariale preosteoblasten te vergelijken met BMM's, die vaak worden gebruikt voor respectievelijk in vitro osteoblasten- of osteoclastendifferentiatie. Nadat de primaire cellen 's nachts in cMEMα zijn gepasseerd en gekweekt, bereiken ze meestal 80-90% van de samenvloeiing en vertonen ze hun karakteristieke morfologie. De calvariale preosteoblasten zijn opvallend groter dan BMM's (figuur 2</stro...

Dit protocol beschrijft een eenvoudig te gebruiken methode om substraatoxidatie te onderzoeken door 14CO2-productie in vitro te volgen.

Beoordeling van energiesubstraatoxidatie in vitro met 14CO2-vangst

Mitochondria host the machinery for the tricarboxylic acid (TCA) cycle and electron transport&#160;chain (ETC), which generate adenosine triphosphate ...

Het gebruik van verschillende energiesubstraten is zowel celtypespecifiek als ziekte-indicatief. Het meten van het verbruik van de specifieke substraten kan licht werpen op zowel de normale biologie als de pathologie. De techniek heeft geen gespecialiseerde apparatuur nodig en is eenvoudig op te schalen.Het is ook gemakkelijker te gebruiken dan eerdere gepubliceerde methoden. Inzicht in veranderingen in substraatoxidatiesnelheid zal de ontwikkeling van voedings- en farmacologische interventies voor metabole stoornissen mogelijk maken. Hoewel aangetoond met botweefsel, is deze techniek gemakkelijk aan te passen om metabole flexibiliteit in alle celtypen te bestuderen en inzicht te krijgen in zowel de oorzaken als de gevolgen van metabole verschuivingen.Na het offeren van de pups van drie tot vijf postnatale dagen, breng ze over naar ijskoude D PBS met penicilline streptomycine dubbele antibiotische oplossing. Stel de calvaria bloot door de huid en het zachte weefsel te verwijderen. Verzamel het middelste gebied door de omliggende weefsels van achter naar voren in D PBS te snijden.Kras de binnen- en buitenoppervlakken van de calvaria voorzichtig met een pincet om de cellen vrij te maken bij de daaropvolgende spijsvertering. Bereid 2 en 4 milligram per milliliter oplossingen van collagenase type twee in D PBS en filter elke oplossing met een vers filter van 0,22 micrometer. Verteer eerst de gereinigde calvaria met twee milligram per milliliter collagenase-oplossing gedurende 15 minuten en gooi vervolgens de digestieoplossing weg.Verteer vervolgens de schone monsters in vier milligram per milliliter collagenase-oplossing driemaal gedurende 15 minuten per keer. Trek vervolgens de verteringsoplossing en bewaar deze. Filtreer de digestieoplossing door 70 micrometer celzeefjes en centrifugeer het filtraat bij 300 RCF gedurende vijf minuten.Resuspensie van de celkorrel in volledig MEM-alfamedium met 10% FBS en penicilline streptomycine dubbele antibiotische oplossing. Tel en zaai de cellen in een plaat van 10 centimeter. Kweek de cellen in een incubator van 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende drie dagen.Dissociëer vervolgens de cellen bij 37 graden Celsius met 0,25 Trypsine EDTA. Na de vertering, tel en zaai de cellen in een 24 well cel kweekplaat met een compleet MEM alfa medium met 10% FBS en penicilline streptomycine dual antibioticum oplossing. Zaai ten minste vier putjes per celtype per substraat en ten minste drie extra putjes voor elk celtype voor het tellen vóór de test.Kweek de cellen 's nachts bij 37 graden Celsius. Na het verwijderen van de spier en het bindweefsel van acht weken oude muizen en het verzamelen van dijbenen en tibia's, knip en gooi beide uiteinden van de botten met een scherpe schaar weg. Spoel het beenmerg uit één dijbeen en één scheenbeen in een verse petrischaal van 10 centimeter met een spuit uitgerust met een naald van 23 gauge met 15 milliliter volledig MEM-alfamedium met 10% FBS penicilline streptomycine dubbele antibioticumoplossing en 10% CGM 14 12 geconditioneerd medium.Kweek de cellen in de petrischaal in een incubator van 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Gooi na drie dagen de kweekmedia weg en spoel de cellen met D PBS. Dissociëer de aangehechte cellen bij 37 graden Celsius met 0,25% Trypsine EDTA gedurende vijf minuten.Na het centrifugeren suspensie van de celkorrel opnieuw in het BMM-medium. Tel en zaai de cellen in een 24 put celkweekplaat volgens de eerder beschreven procedure. Cultuur bij 37 graden Celsius 's nachts in het BMM-medium voordat de testen worden gestart.Was de cellen in de extra putjes twee keer met D PBS. Dissocieer de cellen met 0,25% Trypsine EDTA. Re suspensie 20 microliter verteerde cellen in D PBS.Bepaal met 20 microliter acridine orange en propidiumjodidekleurstofoplossing het aantal levende cellen met een geautomatiseerde celteller en noteer het aantal. Was de cellen in de testputten tweemaal met D PBS. Voeg 500 microliter heet medium toe aan elke testput in de ram-aangewezen weefselkweekkap.Na het afdichten van de plaat met parafilm, incubeer de cellen in een RAM-aangewezen incubator bij 37 graden Celsius gedurende 4 uur. Snijd tijdens de incubatie het filtreerpapier in cirkelvormige stukken, iets groter dan het gebied in de dop van de microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en steek het papier goed in de dop. Voeg 200 microliter van één 1 molair perchloorzuur toe aan elke buis en 20 microliter natriumhydroxide aan het filtreerpapier dat in de dop is aangebracht.Breng na het uitbroeden van de cellen 400 microliter kweekmedium van elke put over naar de voorbereide buizen en sluit de doppen onmiddellijk. Laat de buizen een uur in een buizenrek op kamertemperatuur staan. Parallelae stelt tijdens de incubatie voor elke buis een scintillatieflacon op en vult deze met vier milliliter scintillatievloeistof.Breng elk stuk filtreerpapier over in een injectieflacon met scintillatie en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Voer veegtests uit op de weefselkweekkap, het waterbad, de koelkast, de incubator, de gootsteen, de grond en elk ander werkgebied op mogelijke RAM-verontreiniging. Doe de papieren doekjes in scintillatieflacons met scintillatievloeistof.Meet de koolstof 14-radioactiviteit in de scintillatieflacons met een scintillatieteller en noteer de leesresultaten. Ontsmet de werkomgeving, indien nodig volgens stralingsveiligheidsrichtlijnen. De figuur vergelijkt substraatoxidatie door primaire calvaria pre-osteoblasten versus BMM's.Nadat de primaire cellen 's nachts in volledig MEM-alfamedium zijn gepasseerd en gekweekt, bereiken ze meestal 80 tot 90% confluentie en vertonen ze hun karakteristieke morfologie. De calvariale pre-osteoblasten zijn aanzienlijk groter dan BMM's. De resultaten van substraatoxidatie toonden aan dat de oxidatiesnelheid voor elk substraat significant hoger is in calvariale pre-osteoblasten dan BMM's, wat waarschijnlijk wijst op een hogere energieproductie door oxidatieve fosforylering in de pre-osteoblasten.Het ingebrachte derde papier moet iets groter zijn dan een 1,7 milliliter ebin bovenbuisdop. Deze methode kan worden gebruikt in combinatie met zuurstofverbruik en om de totale snelheid van oxidatieve fosforylering en lactatieve productie in de cellen te bepalen. Dit protocol kan worden gebruikt om het substraatgebruik te bepalen tijdens verschillende differentiatiestadia of ziekte-instellingen.Met deze kennis kunnen we interventies ontwikkelen voor stofwisselingsstoornissen.

assessing-energy-substrate-oxidation-in-vitro-with-14co2-trapping

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Elektronen paramagnetische resonantie (EPR) spectroscopie werd gebruikt om stikstofoxide te detecteren van runderen aorta endotheelcellen en superoxide radicaal anion van menselijke neutrofielen met behulp van ijzer (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamaat, Fe...

Detectie van stikstofoxide en superoxide radicaal anion door Electron Paramagnetische Resonantie Spectroscopie van cellen met behulp van Spin Traps

This video demonstrates a quantification technique for CO2 released during substrate oxidation using 14C-radiolabeled substrates. The released 14CO2 is trapped in an alkaline solution and quantified by a scintillation counter. The oxidation of different substrates varies between tissues and reflects the pathophysiological condition of the tissue.

Substrate Oxidation Assay in Cultured Cells: An In Vitro Assay to Quantify Substrate Oxidation in Cells by Measuring Radioactive Signals from Trapped CO2

Methoden voor biopsie van vastus lateralis, de voorbereiding van gezuiverde mitochondria, en respirometrische profilering worden beschreven. Het gebruik van kleine spiermassa maakt deze techniek geschikt voor onderzoekstoepassingen.

Voorbereiding en Respirometrische Beoordeling van Mitochondriën geïsoleerd van spierweefsel Verkregen door percutane naaldbiopsie

In dit document wordt een methode voor het meten van zuurstofverbruik met behulp van hoge-resolutie respirometrie in permeabel thoraxes van Drosophila beschreven. Deze techniek vereist een minimale hoeveelheid weefsel in vergelijking met de klassieke mitochondriale isolatie-techniek en de verkregen resultaten meer fysiologisch relevant zijn.

Meting van mitochondriale zuurstofverbruik in permeabel vezels van Drosophila met minimale hoeveelheden weefsel

Het doel van dit protocol is spectrophotometrically trans-plasma membraan elektronentransport met behulp van extracellulaire elektronen acceptoren controleren en analyseren van enzymatische interacties die bij deze extracellulaire elektronen acceptoren optreden kunnen.

Meten van Trans-Plasma membraan elektronentransport door C2C12 Myotubes

Dit protocol beschrijft calorespirometry, de directe en gelijktijdige meting van zowel warmteafvoer en ademhaling, waarmee een noninvasive aanpak om te beoordelen van de energie-stofwisseling. Deze techniek wordt gebruikt ter beoordeling van de bijdrage van zowel aerobe en anaerobe emissieroutes naar energie gebruik door toezicht op de totale cellulaire energiestroom.

Calorespirometry: Een krachtige, Noninvasive benadering onderzoeken van cellulaire energiemetabolisme

Elektron paramagnetisch resonantie (EPR) spectroscopie is een eenduidige methode voor het meten van vrije radicalen. Het gebruik van selectieve spin sondes zorgt voor detectie van vrije radicalen in andere cellulaire compartimenten. Presenteren we een praktische, efficiënte methode voor het verzamelen van biologische monsters die behandeling, opslaan en overzetten van monsters voor EPR metingen te vergemakkelijken.

Gebruik van Electron paramagnetisch resonantie in biologische monsters bij kamertemperatuur en 77 K

Dit protocol beschrijft de beoordeling van de subcellulaire compartimentspecifieke redox-status in de cel. Een redoxgevoelige fluorescerende sonde maakt een handige ratiometrische analyse in intacte cellen mogelijk.

Beoordeling van cellulaire oxidatie met behulp van een subcellulair compartiment-specifieke Redox-gevoelige groene fluorescerende eiwitten

Het beoordelen van oxidatieve fosforylering met behulp van respirometers met hoge resolutie is een integraal onderdeel geworden van de functionele analyse van mitochondriën en cellulair energiemetabolisme. Hier presenteren we protocollen voor de analyse van cellulair energiemetabolisme met behulp van kamer- en microplaatgebaseerde respirometers met hoge resolutie en bespreken we de belangrijkste voordelen van elk apparaat.

Respirometrie met hoge resolutie om bio-energetica in cellen en weefsels te beoordelen met behulp van respirometers op basis van kamer en platen

Hoge resolutie respirometrie gekoppeld aan fluorescentiesensoren bepaalt mitochondriaal zuurstofverbruik en reactieve zuurstofsoorten (ROS) generatie. Het huidige protocol beschrijft een techniek om mitochondriale ademhalingssnelheden en ROS-productie in de gepermeabiliseerde heupzenuw te beoordelen.

Beoordeling van mitochondriale functie in heupzenuw door middel van hoge resolutie respirometrie

We presenteren een protocol om plasmamembraan selectief te permeabiliseren, waardoor gerichte toediening van substraten en remmers mogelijk is om mitochondriale oxidatieve fosforylering (OXPHOS) in gekweekte cellen te beoordelen, waarmee plasmamembraantransportbarrières worden overwonnen die dergelijke analyse doorgaans belemmeren. Met deze techniek hebben we aangetoond hoe de werking van OXPHOS wordt gemoduleerd door muscarinische agonisten en antagonisten.

Cholinerge ligandafhankelijke modulatie van oxidatieve fosforyleringskoppeling in digonine-permeabiliseerde BE(2)-C neuroblastoomcellen

Leer een gebruiksvriendelijke methode voor het meten van substraatoxidatie in vitro via 14CO2-vangst. Deze techniek is toepasbaar op diverse celtypen en helpt onderzoekers bij het bestuderen van metabole stoornissen.

Beoordeling van energiesubstraatoxidatie in vitro met ¹⁴CO_2-vangst

Meer video's verkennen