Mycorrhiza-kaarten als hulpmiddel om kolonisatiepatronen en schimmelstrategieën in de wortels van Festuca rubra en Zea mays te verkennen

MycoPatt-methode maakt een diepgaande verkenning van arbusculaire mycorrhiza-kolonisatie in wortels mogelijk. Mycorrhiza-kaarten wijzen op schimmeluitdijing en presenteren de werkelijke positie van elke structuur als een specifiek patroon. Mycorrhiza-kolonisatie wordt objectief geanalyseerd met een resolutie van 1%.

Elk rootsegment wordt automatisch omgezet naar een digitale matrix en genereert een uitgebreide database met kolonisatieparameters. Verwijder om te beginnen de wortels uit de koelkast en plaats ze op een werkplatform om te ontdooien bij kamertemperatuur. Om wortelzuivering uit te voeren, plaatst u alle wortels van één plant in een pot van 30 tot 50 milliliter, bereidt u vervolgens een 10% natriumhydroxideoplossing met kraanwater en giet u deze in de pot totdat deze de wortels volledig bedekt.

Schud de pot krachtig gedurende één tot twee minuten voor homogene dispersie van de opruimoplossing in de wortels. Laat de wortels 48 uur in de opruimoplossing blijven. Voor het spoelen van wortels, passeer de inhoud van de pot door een zeef.

Spoel de wortels meerdere keren in leidingwater totdat de opruimoplossing volledig is verwijderd. Plaats vervolgens de gespoelde wortels in een schone pot voor vlekken. Bereid vervolgens een vijf tot vijf procent inktazijnoplossing met kraanwater.

Giet het in de pot totdat het de wortels bedekt en schud het gedurende één tot twee minuten. Spoel na 48 uur voor gedeeltelijke onthouding de gekleurde wortels gedurende één tot twee minuten in leidingwater. Schud de pot krachtig om de extra vlekkenoplossing te verwijderen.

Herhaal de procedure totdat de wortels vrij zijn voor microscopische evaluatie. Voor wortelsegmentatie plaatst u de gekleurde wortels op een geschubde snijplank. Snijd de wortels in segmenten van één centimeter.

Kies 15 segmenten voor elke variant. Spreid vervolgens de wortels op een glijbaan voor segmentvoorbereiding, gebruik een lamineerzakje om de wortels te bedekken en verpletter ze voorzichtig, beginnend vanaf een rand. Gebruik een zacht plastic gereedschap om de wortels op de dia weer te geven.

Verwijder voorzichtig het lamineerzakje en bedek het monster met een afdekslip. Voeg met een pipet water toe aan een hoek van de glijbaan en laat het water zich langzaam op de glijbaan verspreiden. Verwijder het extra water met een papieren handdoek.

Gebruik voor microscopische analyse een microscoop die is uitgerust met een camera met een goede resolutie. Analyseer de dia's vanaf een extremiteit. Leg elk microscopisch veld vast.

Gebruik 10 of 40x vergroting voor dikke wortels en 40x voor dunne wortels. Na het vastleggen hernoemt u elke afbeelding met een code die de echte post-assemblage van root-onderdelen toestaat. Gebruik presentatiesoftware om een tekentafel te ontwerpen voor het samenstellen van afbeeldingen, stel de breedte in die twee tot drie centimeter breder is dan de afbeeldingsbreedte.

Nadat u 15 foto's hebt gemaakt, voegt u alle vastgelegde afbeeldingen uit één segment toe in de volgorde van hun opname, te beginnen met één tot 15, en reconstrueert u de volledige lengte van het hoofdsegment. Gebruik vervolgens de verticale uitlijning om de afbeeldingen in het midden uit te lijnen en ervoor te zorgen dat elke afbeelding de vorige volgt. Plaats een raster van 10 bij 150 cellen op alle afbeeldingen om het hele hoofdsegment te bedekken.

Plaats bovendien een raster van 10 bij 10 op elke afbeelding en voeg in elke cel van dit raster een getal van één tot zes in als een arbusculaire mycorrhiza- of AM-structuur zichtbaar is, of laat leeg als er geen AM-structuur aanwezig is. Voeg een tabel toe voor een raster van 10 cellen in de breedte en 150 cellen in lengte. Wijzig de tabel met afmetingen in de breedte van de afbeeldingen en wijzig vervolgens de lengte van de tabel zodat deze alle afbeeldingen omvat.

Voor het scoren van mycorrhiza-kolonisatie gebruikt u het unieke nummer om elk type structuur te scoren zoals beschreven in de mycorrhiza-patroonmethode. Gebruik er een voor schimmeldraden, twee voor arbuscules, drie voor blaasjes, vier voor sporen, vijf voor hulpcellen en zes voor toegangspunten. Scoor elke waargenomen mycorrhizastructuur van elke cel van de eerder toegepaste rasters.

Na het scoren voert u alle verkregen scores in de MycoPatt-spreadsheet in. Gebruik de kopieerpastafunctie om alle scores van de presentatie over te zetten naar het eerste blad met de naam Onbewerkte gegevens. Gebruik voor de primaire analyse het derde blad met de naam Parameters om de resultaten als percentages afzonderlijk in drie vormen te visualiseren.

Gebruik de kolommen A tot en met K om het horizontale beeld van kolonisatie te analyseren, de kolommen M tot W voor het verticale beeld van kolonisatie en de kolommen Y tot AI om de transversale kolonisatie te analyseren voor elk van de 15 10 bij 10 vierkanten en de uiteindelijke gemiddelde kolonisatie. Pas vervolgens de definities en formules toe die specifiek zijn voor elke parameter. Voor de productie en extractie van mycorrhiza-kaarten visualiseert u de afbeelding die is verkregen door de conversie van mycorrhizastructuurcode in kleuren in het tweede blad met de naam Grafieken.

Exporteer vervolgens de resulterende afbeelding in het grafiekblad als een afbeelding en gebruik de kleurcode in de legenda om mycorrhizapatronen te analyseren. Identificeer voor mycorrhizale kaartanalyse de belangrijkste structuren en hun assemblage. Beschrijf vervolgens het mycorrhiza-kolonisatiepatroon waargenomen in de geanalyseerde wortels, gevolgd door een kolonisatiestrategie op basis van waargenomen structurele ontwikkeling in de wortel, het vertakkingspatroon en arbusculaire blaasjesontwikkeling.

Dit protocol biedt de details van mycorrhizastructuren met een goed contrast tussen mycorrhizastructuren en wortelcellen voor Zea mays en Festal rubra. De mislukte opruim- en kleuringsprocedures resulteerden in onduidelijke microscopische beelden van mycorrhizastructuren in Festal rubra en Zea mays. Mycorrhiza kolonisatiepatronen maakten een volledige verkenning van het kolonisatiemechanisme mogelijk, deze methode biedt een diepe, kleinschalige verkenning van kolonisatiepatronen en -strategieën voor Zea mays en Festuca rubra met een extra visuele expressie van kolonisatieparameters.

In Zea mays sterk fluctuerend kolonisatiepotentieel, afhankelijk van het ontwikkelingsstadium van de plant, werd waargenomen, maar in Festuca rubra vinden de kolonisatieprocessen plaats in de wortels en was de ontwikkeling van hyphale netwerken gecorreleerd met een lage ontwikkelingssnelheid van de wortels. MycoPatt is geschikt voor het in kaart brengen van de arbusculaire mycorrhiza kolonisatie in elke plant. Het is ook nuttig om het kolonisatiemechanisme volledig te verkennen en de schimmelstrategie langs de wortels te beoordelen.