Name: Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Leer hoe je histon post-translatiemodificaties kwantificeert in een 3D-hepatocytenmodel met vloeistofchromatografie-massaspectrometrie. Deze methode onthult chromatindynamica in ziektestoestanden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het Sidoli-lab erkent dankbaar de Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics award), Deerfield (Xseed award), Relay Therapeutics, Merck en het NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).

<ol><li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li>
<li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+the+missing+link+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).</li>
<li>Kim, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+culture+models+in+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue culture models in cancer biology.</a> Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology (Bethesda). 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Wrzesinski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cultural+divide%3A+exponential+growth+in+classical+2D+and+metabolic+equilibrium+in+3D+environments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The cultural divide: exponential growth in classical 2D and metabolic equilibrium in 3D environments.</a> PLoS One. 9 (9), 106973(2014).</li>
<li>Wrzesinski, K., Fey, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+and+the+recovery+of+physiological+functionality+in+3D+cultures+in+micro-bioreactors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors.</a> Bioengineering (Basel). 5 (1), 22(2018).</li>
<li>Gonda, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+transgenic+cell+model+to+quantify+genotoxic+effects+of+space+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Space+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional transgenic cell model to quantify genotoxic effects of space environment.</a> Advances in Space Research. 27 (2), 421-430 (2001).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130 (4), 601-610 (2007).</li>
<li>Tvardovskiy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top-down+and+middle-down+protein+analysis+reveals+that+intact+and+clipped+human+histones+differ+in+post-translational+modification+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Top-down and middle-down protein analysis reveals that intact and clipped human histones differ in post-translational modification patterns.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 14 (12), 3142-3153 (2015).</li>
<li>Azad, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifying+chromatin+by+histone+tail+clipping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Modifying chromatin by histone tail clipping.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (18), 3051-3067 (2018).</li>
<li>Kragesteen, B. K., Amit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heads+or+tails%3A+histone+tail+clipping+regulates+macrophage+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Heads or tails: histone tail clipping regulates macrophage activity.</a> Nature Immunology. 22 (6), 678-680 (2021).</li>
<li>Dhaenens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+clipping%3A+the+punctuation+in+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Histone clipping: the punctuation in the histone code.</a> EMBO Reports. 22 (8), 53440(2021).</li>
<li>Anderson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+histone+proteoforms+using+front-end+electron+transfer+dissociation-enabled+orbitrap+instruments%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analyses of histone proteoforms using front-end electron transfer dissociation-enabled orbitrap instruments.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 15 (3), 975-988 (2016).</li>
<li>Morgan, M. A. J., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reevaluating+the+roles+of+histone-modifying+enzymes+and+their+associated+chromatin+modifications+in+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Reevaluating the roles of histone-modifying enzymes and their associated chromatin modifications in transcriptional regulation.</a> Nature Genetics. 52 (12), 1271-1281 (2020).</li>
<li>Chan, J. C., Maze, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nothing+is+yet+set+in+%28hi%29stone%3A+novel+post-translational+modifications+regulating+chromatin+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nothing is yet set in (hi)stone: novel post-translational modifications regulating chromatin function.</a> Trends in Biochemical Sciences. 45 (10), 829-844 (2020).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Fischle, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+the+discrimination+of+repressive+methyl-lysine+marks+in+histone+H3+by+Polycomb+and+HP1+chromodomains%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains.</a> Genes and Development. 17 (15), 1870-1881 (2003).</li>
<li>Onder, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+epigenetic+histone+modification+analysis+by+mass+spectrometry+for+clinical+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Progress in epigenetic histone modification analysis by mass spectrometry for clinical investigations.</a> Expert Review of Proteomics. 12 (5), 499-517 (2015).</li>
<li>Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+in+chromatin+biology+and+epigenetics%3A+Elucidation+of+post-translational+modifications+of+histone+proteins+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry.</a> Journal of Proteomics. 75 (12), 3419-3433 (2012).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Moradian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+top-down%2C+middle-down%2C+and+bottom-up+mass+spectrometry+approaches+for+characterization+of+histone+variants+and+their+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications.</a> Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).</li>
<li>Zheng, Y., Huang, X., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epiproteomics%3A+quantitative+analysis+of+histone+marks+and+codes+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Epiproteomics: quantitative analysis of histone marks and codes by mass spectrometry.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 142-150 (2016).</li>
<li>Sidoli, S., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle-down+proteomics%3A+a+still+unexploited+resource+for+chromatin+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Middle-down proteomics: a still unexploited resource for chromatin biology.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (7), 617-626 (2017).</li>
<li>Stampar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma+%28HepG2%2FC3A%29+cell-based+3D+model+for+genotoxicity+testing+of+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals.</a> Science of the Total Environment. 755, 143255(2021).</li>
<li>Calitz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+and+anti-prolific+properties+of+Xysmalobium+undulatum+water+extract+during+short-term+exposure+to+two-dimensional+and+three-dimensional+spheroid+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Mechanisms+and+Methods%22%5BJournal%5D)">Toxicity and anti-prolific properties of Xysmalobium undulatum water extract during short-term exposure to two-dimensional and three-dimensional spheroid cell cultures.</a> Toxicology Mechanisms and Methods. 28 (9), 641-652 (2018).</li>
<li>Garcia, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+derivatization+of+histones+for+facilitated+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).</li>
<li>Sidoli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+window+acquisition+of+all+theoretical+mass+spectra+%28SWATH%29+analysis+for+characterization+and+quantification+of+histone+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra (SWATH) analysis for characterization and quantification of histone post-translational modifications.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 14 (9), 2420-2428 (2015).</li>
<li>Sidoli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+resolution+data-independent+acquisition+in+an+LTQ-orbitrap+allows+for+simplified+and+fully+untargeted+analysis+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications.</a> Analytical Chemistry. 87 (22), 11448-11454 (2015).</li>
<li>Karch, K. R., Sidoli, S., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantification+of+histone+PTMs+using+high-resolution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Identification and quantification of histone PTMs using high-resolution mass spectrometry.</a> Methods in Enzymology. 574, 3-29 (2016).</li>
<li>Yuan, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiProfile+quantifies+histone+peptides+with+modifications+by+extracting+retention+time+and+intensity+in+high-resolution+mass+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">EpiProfile quantifies histone peptides with modifications by extracting retention time and intensity in high-resolution mass spectra.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 14 (6), 1696-1707 (2015).</li>
<li>Yuan, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiProfile+2.0%3A+a+computational+platform+for+processing+epi-proteomics+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data.</a> Journal of Proteome Research. 17 (7), 2533-2541 (2018).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skyline%3A+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li>
<li>Pino, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Skyline+ecosystem%3A+Informatics+for+quantitative+mass+spectrometry+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics.</a> Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).</li>
<li>Aguilan, J. T., Kulej, K., Sidoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+for+protein+fold+change+and+p-value+calculation+for+non-experts+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Omics%22%5BJournal%5D)">Guide for protein fold change and p-value calculation for non-experts in proteomics.</a> Molecular Omics. 16 (6), 573-582 (2020).</li>
<li>Lex, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UpSet%3A+Visualization+of+intersecting+sets%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Visualization+and+Computer+Graphics%22%5BJournal%5D)">UpSet: Visualization of intersecting sets.</a> IEEE Transactions on Visualization and Computer Graphics. 20 (12), 1983-1992 (2014).</li>
<li>Shah, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HISTome2%3A+a+database+of+histone+proteins%2C+modifiers+for+multiple+organisms+and+epidrugs%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+and+Chromatin%22%5BJournal%5D)">HISTome2: a database of histone proteins, modifiers for multiple organisms and epidrugs.</a> Epigenetics and Chromatin. 13 (1), 31(2020).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+succinylation+and+lysine+malonylation+in+histones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Lysine succinylation and lysine malonylation in histones.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (5), 100-107 (2012).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+succinylation+and+its+function+on+the+nucleosome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Histone succinylation and its function on the nucleosome.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (15), 7101-7109 (2021).</li>
<li>Howe, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+H3K4me3+instructive+for+transcription+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Is H3K4me3 instructive for transcription activation.</a> Bioessays. 39 (1), 1-12 (2017).</li>
<li>Nicetto, D., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+H3K9me3+heterochromatin+in+cell+identity+establishment+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Role of H3K9me3 heterochromatin in cell identity establishment and maintenance.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 55, 1-10 (2019).</li>
<li>Wojcik, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27+dimethyl+loss+is+highly+specific+for+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumor+and+distinguishes+true+PRC2+loss+from+isolated+H3K27+trimethyl+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27 dimethyl loss is highly specific for malignant peripheral nerve sheath tumor and distinguishes true PRC2 loss from isolated H3K27 trimethyl loss.</a> Modern Pathology. 32 (10), 1434-1446 (2019).</li>
<li>Sellers, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+characterization+of+the+cancer+cell+line+encyclopedia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia.</a> Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+regulation+of+gene+expression+by+histone+lactylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation.</a> Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).</li>
<li>Farrelly, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+serotonylation+is+a+permissive+modification+that+enhances+TFIID+binding+to+H3K4me3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone serotonylation is a permissive modification that enhances TFIID binding to H3K4me3.</a> Nature. 567 (7749), 535-539 (2019).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADP-ribosylation+of+histone+variant+H2AX+promotes+base+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ADP-ribosylation of histone variant H2AX promotes base excision repair.</a> The EMBO Journal. 40 (2), 104542(2021).</li>
<li>Zheng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+histone+glycation+is+associated+with+disease-related+changes+in+chromatin+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Reversible histone glycation is associated with disease-related changes in chromatin architecture.</a> Nature Communications. 10 (1), 1289(2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen.

De analyse van histon PTM's is fundamenteel anders dan de typische proteomics analyse pijplijn. De meeste histon PTM's hebben nog steeds raadselachtige biologische functies; als gevolg hiervan zijn annotaties zoals Gene Ontology of pathway-databases niet beschikbaar. Er bestaan verschillende bronnen die histonmodificaties associëren met het enzym dat verantwoordelijk is voor hun katalyse of eiwitten die domeinen bevatten die deze PTM's binden (bijv. HISTome36). Ook is het mogelijk om te speculeren...

Sinds het einde van de19e eeuw worden celkweeksystemen gebruikt als model om de groei en ontwikkeling van cellen buiten het menselijk lichaam te bestuderen 1,2. Het gebruik ervan is ook uitgebreid om te bestuderen hoe weefsels en organen functioneren in zowel gezonde als zieke contexten 1,3. Suspensiecellen (bijv. bloedcellen) groeien naadloos en uitwisselbaar in petrischalen of kolven omdat ze niet in vivo in driedimensionale (3D) structuren samenkomen. Cellen afgeleid van vaste organen kunnen groeien in tweedimensionale (2D) of 3D-kweeksystemen. In 2D-kweek worden cellen gekweekt in een monolaag die zich hecht aan een plat oppervlak 2,4. 2D-celkweeksystemen worden gekenmerkt door exponentiële groei en een snelle verdubbelingstijd, meestal 24 uur tot enkele dagen5. Cellen in 3D-systemen groeien om ingewikkelde cel-celinteracties te vormen die weefselachtige conglomeraten nauwer modelleren, en ze worden gekenmerkt door hun vermogen om een dynamisch evenwicht te bereiken waarbij hun verdubbelingstijd 1 maand of langer kan bereiken5.
In dit artikel wordt een innovatieve methodologie gepresenteerd om 3D-sferoïden te laten groeien in roterende celkweeksystemen die verminderde zwaartekracht simuleren6. Dit is een vereenvoudigde afgeleide van een celkweeksysteem geïntroduceerd door NASA in de jaren 19907. Deze aanpak minimaliseert schuifkrachten, die optreden in bestaande methoden zoals draaiende kolven, en verhoogt de reproduceerbaarheid van sferoïden6. Bovendien verhoogt de roterende bioreactor de actieve nutriëntendiffusie, waardoor necrotische vorming wordt geminimaliseerd die optreedt in systemen zoals hangende druppelcelkweek waar media-uitwisseling onpraktisch is6. Op deze manier groeien cellen meestal ongestoord, waardoor structurele en fysiologische kenmerken kunnen worden gevormd die verband houden met cellen die in weefsel groeien. C3A-hepatocyten (HepG2/C3A) die op deze manier werden gekweekt, hadden niet alleen ultrastructurele organellen, maar produceerden ook hoeveelheden ATP, adenylaatkinase, ureum en cholesterol die vergelijkbaar waren met de in vivo waargenomen niveaus 1,2. Bovendien vertonen cellen gekweekt in 2D vs.3D celkweeksystemen verschillende genexpressiepatronen8. Genexpressieanalyse van C3A-hepatocyten gekweekt als 3D-sferoïden toonde aan dat deze cellen een breed scala aan leverspecifieke eiwitten tot expressie brachten, evenals genen die betrokken zijn bij belangrijke routes die de leverfunctie reguleren8. Eerdere publicaties toonden de verschillen aan tussen proteomen van exponentieel groeiende cellen in 2D-cultuur versus cellen bij dynamisch evenwicht in 3D-sferoïde culturen5. Deze verschillen omvatten cellulair metabolisme, dat op zijn beurt de structuur, functie en fysiologie van de cel5 beïnvloedt. Het proteoom van cellen gekweekt in 2D-cultuur was meer verrijkt met eiwitten die betrokken zijn bij celreplicatie, terwijl het proteoom van 3D-sferoïden meer verrijkt was in leverfunctionaliteit5.
De langzamere replicatiesnelheid van cellen die groeien naarmate 3D-sferoïden nauwkeuriger modelleren specifieke verschijnselen die verband houden met de chromatinetoestand en modificaties (bijv. Histon clipping9). Histon clipping is een onomkeerbare histon post-translationele modificatie (PTM) die proteolytische splitsing van een deel van de histon N-terminale staart veroorzaakt. Hoewel de biologische functie nog steeds ter discussie staat 10,11,12,13, is het duidelijk dat de aanwezigheid ervan in primaire cellen en leverweefsel wordt gemodelleerd door HepG2 / C3A-cellen gekweekt als sferoïden, maar niet als platte cellen 9. Dit is van cruciaal belang, omdat chromatinetoestand en modificaties de DNA-uitlezing meestal reguleren door de toegankelijkheid van genen en dus hun expressie te moduleren14. Histon PTM's beïnvloeden ofwel de chromatinetoestand direct door de netto lading van de nucleosomen te beïnvloeden waar histonen worden geassembleerd, of indirect door chromatineschrijvers, lezers en gummente werven 14. Honderden histon PTM's zijn geïdentificeerd tot op heden15, wat de hypothese versterkt dat chromatine een "histoncode" herbergt die door de cel wordt gebruikt om DNA16 te interpreteren. De identificatie van een groot aantal PTM-combinaties15 en de ontdekking dat combinaties van histon-PTM's vaak verschillende biologische functies hebben dan PTM's die geïsoleerd aanwezig zijn (bijv. Fischle, et al.17), benadrukt echter dat er meer werk nodig is om de "histoncode" te decoderen.
Momenteel is histon PTM-analyse gebaseerd op technieken die antilichamen gebruiken (bijv. Western blots, immunofluorescentie of chromatine-immunoprecipitatie gevolgd door sequencing [ChIP-seq]) of massaspectrometrie (MS). Op antilichamen gebaseerde technieken hebben een hoge gevoeligheid en kunnen gedetailleerde informatie verschaffen over de genoombrede lokalisatie van histonmarkeringen, maar zijn vaak beperkt in het bestuderen van zeldzame PTM's of PTM's die aanwezig zijn in combinaties 18,19,20. MS is meer geschikt voor high-throughput en onbevooroordeelde identificatie en kwantificering van enkelvoudige en naast elkaar bestaande eiwitmodificaties, met name histoneiwitten 18,19,20. Om deze redenen hebben deze en verschillende andere laboratoria de MS-pijplijn geoptimaliseerd voor de analyse van histonpeptiden (bottom-up MS), intacte histonstaarten (middle-down MS) en histoneiwitten over de volledige lengte (top-down MS)21,22,23.
Hieronder wordt een workflow beschreven voor het kweken van HepG2 / C3A-sferoïden en het voorbereiden ervan op histonpeptide-analyse (bottom-up MS) via nano-vloeistofchromatografie, online gekoppeld aan tandemmassaspectrometrie (nLC-MS / MS). Er werd een 2D-celkweek gekweekt en de cellen werden geoogst en overgebracht naar een bioreactor waar ze sferoïden zouden gaan vormen (figuur 1). Na 18 dagen in cultuur werden sferoïden behandeld met natriumbutyraat of natriumsuccinaat om de relatieve abundanties van histonacetylering en succinylering te verhogen. Met name 3D-culturen kunnen net zo goed worden behandeld met genotoxische verbindingen als hun platte cultuurequivalenten; recente publicaties benadrukken zelfs dat de toxicologische respons van cellen in 3D-cultuur meer lijkt op primaire weefsels dan die in 2D-platte cultuur24,25. Cellen werden vervolgens verzameld op bepaalde tijdstippen en nucleaire isolatie werd uitgevoerd. Vervolgens werden histonen geëxtraheerd en gederivatiseerd met propionisch anhydride voor en na trypsinevertering volgens een protocol dat voor het eerst werd ontwikkeld door Garcia et al.26. Deze procedure genereert peptiden van een geschikte grootte voor online scheiding met omgekeerde fase chromatografie (C18) en detectie met MS. Ten slotte werden histonpeptiden geïdentificeerd en gekwantificeerd en werden de gegenereerde gegevens op meerdere manieren weergegeven voor een meer complete biologische interpretatie.

<table><tbody><tr><td>0.05% trypsin-EDTA oplossing</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0.5-20 &micro;L pipettips</td><td>BRAND</td><td>13-889-172 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifugebuisjes</td><td>Bio-Rad</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro;L multikanaals pipette</td><td>BRAND</td><td>BR7059000 (Millipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>10 mL spuit</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>14-817-31 (Fisher Scientific)</td><td>Luer lock tip, gegradueerd tot 12 mL</td></tr><tr><td>10, 20, 200 en 1000 &micro;L enkelkanaals pipettes</td><td>Eppendorf</td><td>14-285-904 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro;L pipettips</td><td>Rainin</td><td>30389164</td><td></td></tr><tr><td>18 G spuitnaald</td><td>Air-Tite</td><td>14-817-100 (Fisher Scientific)</td><td>3" lengte, 0.05" diameter</td></tr><tr><td>200 &micro;L multikanaals pipette</td><td>Corning</td><td>4082</td><td></td></tr><tr><td>2-200 &micro;L pipettips</td><td>BRAND</td><td>Z740118 (Millipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>24-well ultra-low attachment microplaat</td><td>Corning</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 U-vormige celkweekkolf</td><td>Corning</td><td>461464U</td><td>Onbehandeld, met ventilatiekap</td></tr><tr><td>96-well randplaat</td><td>Axygen</td><td>PCR-96-FS-C (Corning)</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949-1</td><td>Aceton moet koud worden gebruikt</td></tr><tr><td>Ammoniumbicarbonaat (NH4HCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6141-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxide-oplossing</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC423300250</td><td></td></tr><tr><td>Water van celkweekkwaliteit</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>ClinoReactor</td><td>CelVivo</td><td>10004-12</td><td>Bioreactor voor 3D celkweek</td></tr><tr><td>ClinoStar</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>Clinostaat CO2 incubator voor 3D celkweek</td></tr><tr><td>Controle-eenheid</td><td>CelVivo</td><td>N/A</td><td>Tablet voor ClinoStar instellingen</td></tr><tr><td>Dulbecco's Aangepast Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>17-205-CV</td><td>1X oplossing met 4,5 g/L glucose en natriumpyruvaat, zonder L-glutamine en fenolrood</td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Forminezuur</td><td>Thermo Scientific</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Afzuigkap</td><td>Mott</td><td>N/A</td><td>Model 7121000</td></tr><tr><td>Glas Pasteur pipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8B</td><td>9", met katoenen plug, borosilicaatglas, niet-steriel</td></tr><tr><td>Glutagro supplement</td><td>Corning</td><td>25-015-CI</td><td>200 mM L-ananyl-L-glutamine</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td>1X oplossing zonder calcium, magnesium en fenolrood</td></tr><tr><td>HPLC-kwaliteit acetonitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-kwaliteit water</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-1</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A481-212</td><td></td></tr><tr><td>IJs</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MEM niet-essentiële aminozuren</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td>100X oplossing</td></tr><tr><td>Oasis HLB-hars</td><td>Waters</td><td>186007549</td><td>Hydrofiel-Lipofiel-Gebalanceerde (HLB) Hars met 30&micro;m deeltjesgrootte</td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos Tribrid massaspectrometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBHQ</td><td>Hoge resolutie massaspectrometer</td></tr><tr><td>Oro-Flex I polypropyleen filterplaat</td><td>Orochem</td><td>OF1100</td><td>96-well polypropyleen filterplaat met 10 &micro;M PE frit</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>100X oplossing</td></tr><tr><td>pH-papier</td><td>Hydrion</td><td>Z111848 (Sigma-Aldrich)</td><td>0-13 pH testpapier</td></tr><tr><td>Pipetpistool</td><td>Eppendorf</td><td>Z666467 (Millipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>Polymicro capillair</td><td>Molex</td><td>50-110-7740 (Fisher Scientific)</td><td>Flexibel gefuseerd silica capillair met polymide coating, 75 &micro;M ID x 363 &micro;M OD</td></tr><tr><td>Polystyreen 10 mL serologische pipetten, steriele</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>Propionylzuuranhydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240311-50G</td><td></td></tr><tr><td>Gekoelde centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>Reprosil-Pur-hars</td><td>MSWIL</td><td>R13.AQ.0003</td><td>120 Å poriegrootte, C18-AQ fase, 3 &micro;M kralengrootte</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Clay Adams</td><td>25477 (American Laboratory Trading)</td><td>Nutator Mixer 1105</td></tr><tr><td>Sequencing-kwaliteit gemodificeerd trypsine</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbutyraat</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11079</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsuccinaat dibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14160-100G</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac vacuüm concentrator (1.5 mL microcentrifugebuisjes)</td><td>Savant</td><td>20249 (American Laboratory Trading)</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac vacuüm concentrator (96-well)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15308325</td><td>Savant SPD1010</td></tr><tr><td>Steriele kap</td><td>Thermo Scientific</td><td>1375</td><td>Klasse II, Type A2</td></tr><tr><td>Zwavelzuur (H2SO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-004-375</td><td>Baker Analysed ACS reagens</td></tr><tr><td>Weefselkweek behandelde 100 mm x 20 mm schotel</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-23</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroazijnzuur (TCA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AC421451000</td><td>Hersuspensie 100% w/v in HPLC-kwaliteit water</td></tr><tr><td>Trifluorazijnzuur (TFA)

global level quantification of histone post-translational modifications in a 3d cell culture model of hepatic tissue

Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

Platte culturen van zoogdiercellen zijn een veel gebruikte in vitro benadering voor het begrijpen van celfysiologie, maar dit systeem is beperkt in het modelleren van vaste weefsels als gevolg van onnatuurlijk snelle celreplicatie. Dit is vooral een uitdaging bij het modelleren van volwassen chromatine, omdat snel replicerende cellen vaak betrokken zijn bij DNA-replicatie en een heterogene polyploïde populatie hebben. Hieronder wordt een workflow gepresenteerd voor het modelleren, behandelen en analyseren van rustige chromatinemodificaties met behulp van een driedimensionaal (3D) celkweeksysteem. Met behulp van dit protocol worden hepatocellulaire carcinoomcellijnen gekweekt als reproduceerbare 3D-sferoïden in een incubator die actieve nutriëntendiffusie en lage schuifkrachten bieden. Behandeling met natriumbutyraat en natriumsuccinaat veroorzaakte respectievelijk een toename van histonacetylering en succinylering. Verhogingen van de niveaus van histonacetylering en succinylering zijn geassocieerd met een meer open chromatinetoestand. Sferoïden worden vervolgens verzameld voor isolatie van celkernen, waaruit histoneiwitten worden geëxtraheerd voor de analyse van hun posttranslationele modificaties. Histonanalyse wordt uitgevoerd via vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie, gevolgd door een interne computationele pijplijn. Ten slotte worden voorbeelden van gegevensrepresentatie getoond om de frequentie en het voorkomen van combinatorische histonmarkeringen te onderzoeken.

In dit protocol werden HepG2/C3A-sferoïden behandeld met 20 mM NaBut en 10 mM NaSuc, die beide de wereldwijde niveaus van histon-PTM's beïnvloedden (figuur 3A). Histon PTM's werden vervolgens geïdentificeerd en gekwantificeerd op het niveau van één residu via MS/MS-acquisitie (figuur 3B).
Wanneer monsters in replicaties worden uitgevoerd, kan statistische analyse worden uitgevoerd om de vouwveranderingsverrijking van een PTM ...

Dit protocol schetst hoe een driedimensionaal celkweeksysteem kan worden gebruikt om chromatinemodificaties in een bijna fysiologische toestand te modelleren, behandelen en analyseren.

Flat cultures of mammalian cells are a widely used in vitro approach for understanding cell physiology, but this system is limited in modeling solid ...

Van de wereldwijde chromatinedynamiek is aangetoond dat het een belangrijke bemiddelaar is van verschillende ziektetoestanden, zoals kanker en veroudering. Ons protocol biedt een fysiologisch relevant model om dit proces te bestuderen. Standaard laboratoriumanalyse van histon posttranslationele modificaties of PTMS is meestal beperkt tot het onderzoeken van een enkele PTM per keer met behulp van op antilichamen gebaseerde assays.Vloeistofchromatografie massaspectrometrie analyse van histon PTMS stelt ons in staat om de overvloed van honderden PTMS in een enkel experiment te meten. Stephanie Stransky, Ronald Cutler en Julie Kim, respectievelijk een postdoc, grad student en onderzoekstechnologie van het lab, demonstreren de procedure. Eerst, met behulp van standaard groeimedia, groeien de cellen als een monolaag totdat ze 80% confluent zijn.Was vervolgens de cellen met HBSS. Voeg vijf milliliter van 0,05% trypsine-EDTA verdund in HBSS toe. Incubeer de cellen gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.Gebruik een microscoop om de loslating van cellen te controleren. Na het tellen van de cellen, verdun de celsuspensie met verse groeimedia. Voeg 0,5 milliliter groeimedia toe om een ultralaag opzetstuk van 24-putjes met meerdere microputten in elk in evenwicht te brengen.Centrifugeer vervolgens de platen bij 3000 x g om luchtbellen van het oppervlak van de plaat te verwijderen. Breng nu de eerder gemaakte celsuspensie over op de 24-wells plaat en centrifugeer gedurende drie minuten bij 120 x g. Controleer de cellen in de 24-well plaat en incubeer vervolgens de platen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur op sferoïde vorming.Voeg ondertussen, om de bioreactor in evenwicht te brengen, 25 milliliter steriel water toe aan de vochtigheidskamer en negen milliliter groeimedia aan de celkamer. Incubeer de bioreactor in een roterende clinostat incubator gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Maak de sferoïden los van de ultralage 24-putplaat door voorzichtig te pipetteren met behulp van een milliliter brede boorpunten en breng ze over naar een weefselkweekschaal.Om voldoende vormen van sferoïden te selecteren, controleert u de kwaliteit van sferoïden onder een microscoop. Sferoïden van goede kwaliteit hebben een uniforme grootte, compactheid en rondheid. Vul de gebalanceerde bioreactor met vijf milliliter verse groeimedia en breng de sferoïden erin over.Vul vervolgens de bioreactor volledig met verse groeimedia en zet de bioreactor in de clinostat incubator bij 10 tot 11 RPM. Wissel elke twee tot drie dagen groeimedia uit door 10 milliliter oude media te vervangen door verse media. Naarmate deze sferoïden in grootte en aantal toenemen, verhoogt u de rotatiesnelheid van de incubator.Voeg na het verkrijgen van de sferoïde pellet vijf volumes koud 0,2 molair zwavelzuur toe aan de pellet en pipetteer op en neer om de pellet te verstoren en histonen vrij te geven. Zodra het supernatant na centrifugering is verkregen, voegt u koud geconcentreerd trichloorazijnzuur toe, zodat de uiteindelijke concentratie 25 tot 30 volumeprocent wordt. En meng het door de buis een paar keer om te keren en te centrifugeren zoals beschreven in het manuscript.Na het weggooien van het supernatant, met behulp van een glazen weidepipet, wast u de pellet en de wanden van de buis met ongeveer 500 microliter koud aceton en 0,1% zoutzuur en centrifugeert u vervolgens op 3.400 x g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Draai vervolgens de buis om om het supernatant weg te gooien. Voeg met behulp van een glazen weidepipet 500 microliter 100% koude aceton toe om de pellet en centrifuge te wassen zoals eerder gedemonstreerd.Verwijder na het weggooien van het supernatant aceton volledig door voorzichtig te pipetteren en laat het monster ongeveer 20 minuten drogen met een open deksel. Resuspend de pellet in 20 microliter van 15 tot 20% acetonitril in een 100 millimolar ammoniumbicarbonaat van pH 8. Draai na het vortexen de suspensie gedurende 30 seconden op 1000 x g.Breng voor acht of meer monsters elk opnieuw gesuspendeerd monster over op een plaat met 96 putten. Voeg vervolgens in een kap twee microliter propionzuuranhydride toe en meng door vijf keer te pipetteren. Voeg snel 10 microliter ammoniumhydroxide toe en meng door vijf keer te pipetteren.Meng HLB-hars op een magneetroerplaat. Voeg vervolgens 70 microliter van de HLB-suspensie toe aan elke put van een 96-well filterplaat op een 96-wells opvangplaat. Na het weggooien van de doorstroom, wast u de hars met 100 microliter 0,1% trifluorazijnzuur.Na resuspendatie van elk monster in 100 microliter van 0,1% trifluorazijnzuur, laadt u elk monster in elke put en voorkomt u spatten met behulp van een vacuüm. Na het weggooien van de doorstroom, wast u de monsters met 100 microliter 0,1% trifluorazijnzuur en plaatst u de filterplaat op een nieuwe opvangplaat. Voeg vervolgens 60 microliter 60% acetonitril in 0,1% trifluorazijnzuur toe aan elke put en voorkom spatten met behulp van vacuüm.Vang de doorstroming op en droog in een snelheidsvacuüm. Plaats de gedroogde verzamelplaat in de HPLC en voer de LC/MS/MS-methode uit zoals beschreven in het manuscript. In deze studie werd de relatieve abundantie van gemeenschappelijke histon posttranslationele modificaties waargenomen in C3A-hepatocyten die als driedimensionale sferoïden werden gekweekt.Posttranslationele modificaties konden ook worden waargenomen op een enkel residu in peptiden gegenereerd uit histoneiwitten. Behandeling van de sferoïden met natriumbutyraat verhoogde de relatieve abundantie van histonacetylering, terwijl die met natriumsuccinaat de histonresidusuccinylering verbeterde. De methode toonde ook het distributiepatroon van histonacetylering na behandeling met natriumbutyraat en dat van histonsuccinylering na behandeling met natriumsuccinaat.Het resultaat toonde ook commonatoriële patronen van verschillende histonmodificaties. Natriumbutyraatbehandelingen verbeterden de acetylering van het lysineresidu 14 op een peptide gegenereerd uit het histoneiwit H3 aanzienlijk, alleen wanneer het negende lysineresidu twee methylgroepen had, maar niet één of drie methylgroepen. De relatieve abundanties van individuele modificaties en verschillende combinaties van posttranslationele modificaties in het van H3 afgeleide peptide werden ook berekend.Combinatorische patronen van posttranslationele modificaties na behandeling met natriumbutyraat werden ook waargenomen in een peptide gegenereerd uit histoneiwit H4. Ook hier resulteerde de behandeling met natriumbutyraat in een significante toename van acetylering. Er moet kritisch op worden gelet dat de sferoïden zo min mogelijk op de bank blijven en in een ontzoutingsstap om morsen van het monster te voorkomen. Deze workflow kan worden gebruikt om chromatine in vaste weefsels te onderzoeken met behulp van een meer fysiologisch model dan snel replicerende platte celculturen.

global-level-quantification-histone-post-translational-modifications

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een reeks testen om de expressie niveaus van H1 linker histonen te analyseren. mRNA van de individuele H1 genen worden kwantitatief gemeten door een willekeurige primer op basis reverse transcriptie gevolgd door real-time PCR, terwijl eiwit kwantificering van H1 histonen wordt bereikt met behulp van HPLC-analyse.

Expressie analyse van zoogdieren Linker-histon Subtypes

Advances in massaspectrometrie toestemming hebben high throughput analyse van eiwitexpressie en modificatie in een groot aantal weefsels. Gecombineerd met subcellulaire fractionering en ziektemodellen, kwantitatieve massaspectrometrie en bioinformatica nieuwe eigenschappen kunnen onthullen in biologische systemen. De werkwijze hierin beschreven analyseert chromatine-geassocieerde eiwitten in de vaststelling van hart-en vaatziekten en is gemakkelijk toepasbaar op...

Kwantitatieve analyse van chromatine proteomen in de ziekte van

Dit protocol beschrijft een volledig geïntegreerde workflow voor het karakteriseren histon post-translationele modificaties met massaspectrometrie (MS). De workflow bevat histon zuivering uit celkweken of weefsels, histon derivatisering en de spijsvertering, MS analyse met behulp van nano-flow vloeistofchromatografie en instructies voor gegevensanalyse. Het protocol is ontworpen voor de voltooiing binnen 2-3 dagen.

Compleet Workflow voor Analyse van histon post-translationele modificaties Met behulp van Bottom-up Massaspectrometrie: Van Histon Extraction om Data Analysis

Het doel van dit artikel is om een uitgebreide, systematische handleiding voor de efficiënte reiniging van histones H3 en H4 en de kwantificering van residuen geacetyleerd Histon.

Zuivering van H3 en H4 Histone eiwitten en de kwantificering van geacetyleerd Histone merken in cellen en hersenweefsel

Dit protocol richt zich op chromatinepreparatie uit snap bevroren weefsels en is geschikt voor Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) gevolgd door kwantitatieve PCR-analyse (X-ChIP-qPCR) of next generation sequencing-benaderingen (X-ChIP-seq).

Chromatine-extractie uit bevroren chimere leverweefsel voor chromatine-immunoprecipitatieanalyse

Dit werk beschrijft een protocol voor de kwantificering van globale histonmodificaties met behulp van intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde hersenmicroglia. Het werk bevat ook het microglia-isolatieprotocol dat werd gebruikt voor het verzamelen van gegevens.

Kwantificering van globale histon posttranslationele modificaties met behulp van intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde microglia in de hersenen van muizen

Een analytische workflow op basis van vloeistofchromatografie, mobiliteitsspectrometrie met ingesloten ionen en time-of-flight-massaspectrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) voor een zeer betrouwbare en zeer reproduceerbare "bottom-up"-analyse van histonmodificaties en identificatie op basis van de belangrijkste parameters (retentietijd [RT], botsingsdoorsnede [CCS] en nauwkeurige massa-tot-lading [m/z]-verhouding).

Screening op histonmodificatie met behulp van vloeistofchromatografie, Trapped Ion Mobility Spectrometry en Time-Of-Flight Mass Spectrometry

Deze methode beschrijft een eenvoudige en snelle strategie voor de karakterisering en het onderzoek van histonproteoformen.

Onthulling van histon-proteovormen met behulp van 2D-TAU gelelektroforese

Dit protocol maakt efficiënte histonextractie uit verschillende klinische monsters mogelijk voor latere posttranslationele modificatieanalyse door LC-MS/MS. Door robuuste detectie van belangrijke histonmodificaties te faciliteren, dient het als een waardevol hulpmiddel voor uitgebreide epigenetische profilering in grote klinische cohorten.

Extractie van histonen uit klinische monsters voor epigenetisch profileren door middel van massaspectrometrie

Hier presenteren we een protocol om single-cell histon posttranslationele modificatieanalyse te automatiseren met behulp van een isotopische twee-plex labelingstrategie en ArgC-digestie. Deze workflow maakt kwantitatieve, reproduceerbare en hooggevoelige profilering van chromatine-heterogeniteit en epigenetische responsen bij enkelcelresolutie mogelijk.

Geautomatiseerde monstervoorbereiding voor de multiplexanalyse van single-cel histon post-translationele modificaties (sc-hPTM2)

Dit protocol biedt een uitgebreide beeldvormingspijplijn om de morfologie van leverstellate cellen in intact leverweefsel te visualiseren en te modelleren. Deze benadering combineert fluorescerende labeling van fibroblasten met behulp van muisgenetica, in situ leverperfusie-gebaseerde weefselvoorbereiding en een aangepaste iDISCO-weefselreinigingsmethode om optische transparantie te bereiken.

Mapping van de morfologie van hepatische stellate cellen in muismodellen van leverfibrose

Leer hoe je histon post-translatiemodificaties kwantificeert in een 3D-hepatocytenmodel met vloeistofchromatografie-massaspectrometrie. Deze methode onthult chromatindynamica in ziektestoestanden.

Global Level Quantification of Histone Post-Translational Modifications in a 3D Cell Culture Model of Hepatic Tissue

Meer video's verkennen