Digitale ruimtelijke profilering voor karakterisering van de micro-omgeving in diffuus infiltrerend glioom van het volwassen type

Digital Spatial Profiling, of DSP, biedt een efficiënte methode voor ruimtelijk gestratificeerde eiwitkwantificering. De implementatie ervan stelt ons in staat om eiwitexpressie te karakteriseren in verschillende regio's van een tumor en de micro-omgeving. Een belangrijk kenmerk van DSP is de multiplexing-mogelijkheid, waardoor gegevensverwerking met hoge doorvoer mogelijk is.

De mogelijkheid om aangepaste interessegebieden te definiëren, biedt bovendien een ruimtelijke dimensie aan gegevensanalyse. DSP kan worden toegepast op elk monster waarin ruimtelijk kwantificerend eiwit of RNA-expressie kan helpen bij het ophelderen van een pathologisch of fysiologisch proces. Dit is vooral relevant in de oncologie, waar regionale doelvariabiliteit kan correleren met kwaadaardige groei of invasie.

Scott Palisoul, een histotechnoloog, en Rachael Barney, een genomische technoloog, demonstreren de procedure. Om dia's voor te bereiden, begint u met het nemen van verschillende kernen van twee millimeter van elke biopsie en plaatst u ze in een enkel weefselmicroarrayblok. Snijd secties van vier micron uit het blok en monteer ze op glazen dia's.

Plaats elke glijbaan in de pakking van de diahouder en incubeer deze gedurende 30 minuten bij 60 graden Celsius. Vul in het semi-geautomatiseerde IHC-systeem de container op positie één met 150 microliter wasbuffer per dia, plus vijf milliliter dood volume, en laat het deksel open. Vul dezelfde hoeveelheid blokkerende oplossing in de container op positie twee.

Plaats de reagenscontainerlade op de machine. Selecteer de Proces-IHC, gevolgd door het blokkeren van de naam van de oplossing in de vervolgkeuzelijst van het veld Markering. Als u klaar bent voor alle dia's, klikt u op Sluiten.

Klik vervolgens op Etiketten afdrukken en vink Alle dialabels aan die nog niet zijn afgedrukt en klik op Afdrukken. Plak labels op de bovenkanten van de dia's. Plaats de dia's op de schuiflade en zorg ervoor dat het monster en het label naar boven gericht zijn.

Druk op de LED-knop om de lade te laten zakken en laat het instrument beginnen met het scannen en herkennen van dia's. Klik op de knop Start om het experiment te starten. Wanneer de run is voltooid, drukt u op de LED-knop wanneer deze groen knippert.

Verwijder de lade van het instrument en til de afdektegels voorzichtig van elke dia op. Plaats de dia's in de 1X fosfaat gebufferde zoutoplossing. Verwijder overtollige buffer en schets elke weefselsectie met een hydrofobe pen om een hydrofobe barrière te creëren.

Maak een antilichaam PC oligo oplossing door acht microliter van elk antilichaam per dia toe te voegen en buffer W te gebruiken om een eindvolume van 200 microliter te bereiken. Breng vervolgens de antilichaam PC oligo-oplossing aan op de dia's en incubeer de dia's 's nachts bij vier graden Celsius. Plaats na incubatie de dia's in een bevochtigde lade en was driemaal gedurende 10 minuten in 1X TBST.

Post-fix in 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door tweemaal wassen gedurende vijf minuten in 1X TBST. Voeg SYTO 13 kernvlek toe gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door tweemaal wassen met 1X TBST. Plaats de muisaanwijzer op Gegevensverzameling in het bedieningspaneel en selecteer Nieuw of Doorgaan met uitvoeren.

Plaats de dia in de diahouder met het label naar de gebruiker toe. Laat de schuifladeklem zakken en zorg ervoor dat het weefsel zichtbaar is in het langwerpige venster. Voeg zes milliliter buffer S toe.Volg de aanwijzingen in het bedieningspaneel.

Zoom tussen verschillende assen met de x- en y-schuifregelaars om een gebied af te bakenen dat moet worden gescand. Selecteer Scannen en laat de scan doorgaan totdat het hele gedefinieerde doelgebied is afgebeeld. Genereer een afbeelding van 20 keer.

Definieer de ROI's door drie even grote cirkelvormige ROIs met een diameter van 250 micrometer voor elke weefselkern te selecteren. Keur de ROI's goed door op de knop Scanwerkruimte afsluiten te klikken. Wacht vervolgens tot het UV-licht de oligo's van de antilichamen splijt.

Nadat u het reinigingsinstrumentproces hebt voltooid, selecteert u Nieuwe gegevensverzameling om door te gaan met de huidige dia's of plaat. Open het voltooide plaatvenster door te dubbelklikken op het pictogramgebied Plaat. Voer het lotnummer van het hybridisatiecodepakket in en klik op Bijwerken.

Klik vervolgens op Afronden. Koppel de schuifhouder en de opvangplaat los door de aanwijzingen te volgen. Bewaar de dia's in TBST of bedek ze met een waterig medium en afdek slip voor langdurige opslag.

Sluit de platen af met een doorlatende afdichting en droog de aspiraten op 65 graden Celsius in een thermische cycler met de bovenkant open. Voeg zeven microliter diethylpyrocarbonaat behandeld water toe en meng. Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur en draai dan snel naar beneden.

Bereid de probebuffermix voor door de juiste probe R- en probe U-vergelijkingen te kiezen die de vergelijking toepassen zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg 84 microliter probebuffermix toe aan elk hybridisatiecodepakket. Voeg in een verse hybridisatieplaat met 96 putten acht microliter van elke hybridisatiecodemastermix toe aan alle 12 putten van de aangegeven rij.

Breng zeven microliter over van de DSP-opvangplaat naar de overeenkomstige put in de hybridisatieplaat. Verwarm de plaat, draai de plaat en incubeer deze 's nachts bij 67 graden Celsius. Koel na incubatie de plaat af op ijs en voer een snelle draai uit.

Bundel de hybridisatieproducten van elke put in een stripbuis en pipetteer elke put voorzichtig vijf keer. Draai naar beneden en laad de stripbuizen in het analysesysteem. Sla het CDF-bestand op een USB-station op het DSP-instrument op en breng de gegevens over naar de digitale analyzer.

Druk op het scherm op Verwerking starten. Selecteer Hoge gevoeligheid gevolgd door Volgende. Druk op Alles selecteren voor het aantal putjes met monsters, vervolgens op Voltooien, gevolgd door Volgende op de e-mailmelding.

Klik vervolgens op Start. Zodra het voorbereidingsstation klaar is, verzegelt u de cartridge en brengt u deze over naar de digitale analysator. Druk op Start Counting.

Selecteer Stage Position. Druk op Bestaand CDF-bestand laden en selecteer eerder geüpload bestand. Druk op Gereed.

Selecteer nogmaals Stage Position, druk op Gereed en vervolgens op Start om het programma uit te voeren. Sla het ZIP-bestand van de conversiebestanden van het aantal reporters van het analysesysteem op een USB-station op. Plaats de schijf in het DSP-apparaat.

Plaats in het DSP Control Center de muisaanwijzer op Gegevensverzameling en klik vervolgens op Accounts uploaden. Selecteer het relevante ZIP-bestand. Klik op Records in het DSP Control Center.

Als u scans in de wachtrij wilt weergeven, selecteert u Geselecteerde scans toevoegen aan wachtrij en vervolgens Mijn analysewachtrij. Selecteer Nieuw onderzoek in wachtrij door de muisaanwijzer op de optie Gegevensanalyse in het bedieningspaneel te plaatsen. DSP-experiment werd uitgevoerd op monsters van glioblastoom en de resultaten werden gevisualiseerd als een heatmap.

Rijen vertegenwoordigen eiwitdoelen en elke kolom komt overeen met een interessegebied. Expressieniveau wordt weergegeven door een kleurbereik dat varieert van blauw, met een lage expressie, tot rood, wat een hoge expressie aangeeft. Variabiliteit van kleur binnen een rij weerspiegelt regionale eiwitheterogeniteit en suggereert een mogelijke ruimtelijke associatie met differentiële eiwitexpressie.

In dit experiment waren S100 en CD-56 universeel hoog, omdat het neurale markers zijn. Markers met de meeste variabiliteit zijn B7-H3, KI-67, CD-44 en fibronectine, waarvan bekend is dat ze geassocieerd zijn met tumorproliferatie, migratie en metastase. Uit een breed scala aan kandidaat-doelen kan DSP degenen identificeren die aanzienlijke regionale variatie vertonen.

Dit legt de basis voor het onderzoeken van factoren die verband houden met variabiliteit en hun relevantie voor ziekte.