Genoombrede profilering van transcriptiefactor-DNA-bindingsinteracties bij Candida albicans: een uitgebreide CUT & RUN-methode en data-analyseworkflow

Dit protocol beschrijft alle experimentele procedures, van epitoop tagging van transcriptiefactorcoderende genen via computationele data-analyse, tot het uitvoeren van genoombrede profilering van transcriptiefactor-DNA-bindingsinteracties in Candida albicans via CUT & RUN. Dit is een meer toegankelijke, snellere, gevoeligere, goedkopere techniek en biedt gegevens van hogere kwaliteit dan traditionele ChIP-chip- en ChIP-seq-benaderingen. Hoewel ons protocol is ontwikkeld voor Candida albicans cellen geïsoleerd uit biofilms of planktonische culturen, zou het praktisch moeten zijn om het aan te passen aan vrijwel elke goede vorm van Candida albicans cellen.

Breng na het uitbroeden van de celsuspensie een aliquot van vijf microliter over in een nieuwe PCR-buis. Voeg aan vijf microliter geïsoleerde kernen en een aliquot van vijf microliter intacte cellen die eerder bij vier graden Celsius waren opgeslagen, één microliter calcofluorwit en SYTO 13 toe. Incubeer bij 30 graden Celsius in het donker gedurende 30 minuten.

Inspecteer visueel de integriteit en zuiverheid van de geïsoleerde kernen met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Zoek naar geïsoleerde kernen met prominente SYTO 13-kleuring en zorg ervoor dat de celwand niet kleurt door de calcofluor-witte kleurstof. Herhaal de inspectie met intacte cellen als controle voor celwandkleuring met calcofluor-witte kleurstof.

Plaats de buizen op een magneetrek en wacht tot de drijfmest helemaal helder is. Gooi het supernatant weg met een pipet. Voeg 50 microliter van de antilichaambuffer toe en meng voorzichtig door te pipetteren.

Voeg drie microliter van het anti-GFP polyklonale antilichaam toe aan de buizen en incubeer de buisjes op een notenmixer bij 4 graden Celsius gedurende twee uur. Centrifugeer de buizen kortstondig gedurende vijf seconden bij 100 maal g bij kamertemperatuur en plaats de buizen op een magnetisch rek. Zodra de slurry helder is, gooit u het supernatant weg met een pipet.

Terwijl de buizen met de kralen zich nog op het magnetische rek bevinden, voegt u 200 microliter ijskoude celpermeabilisatiebuffer rechtstreeks op de kralen toe. Gooi het supernatant weg met een pipet. Herhaal twee wasbeurten met de ijskoude celpermeabilisatiebuffer.

Voeg 50 microliter ijskoude celpermeabilisatiebuffer toe aan elke buis en meng voorzichtig door te pipetteren. Voeg 2,5 microliter van het eiwit AG-MNase toe aan elk monster en meng door te pipetteren. Plaats de monsters op een notenmixer bij 4 graden Celsius en incubeer de monsters gedurende een uur.

Centrifugeer de stripbuizen kort op 100 maal g bij kamertemperatuur gedurende vijf seconden en plaats de buizen vervolgens op een magnetisch rek. Zodra de slurry helder is, gooit u het supernatant weg met een pipet. Terwijl de buizen met de kralen zich nog op het magnetische rek bevinden, voegt u 200 microliter ijskoude celpermeabilisatiebuffer rechtstreeks op de kralen toe.

Gooi het supernatant weg met een pipet. Herhaal twee wasbeurten met de ijskoude celpermeabilisatiebuffer. Voeg 100 microliter van de ijskoude celpermeabilisatiebuffer toe aan de monsters en pipetteer voorzichtig vijf keer op en neer.

Verwijder het gelverband uit de gelbox en open het gelverband volgens de instructies van de fabrikant. Verwijder de gel voorzichtig uit het gelgietsel en plaats deze in een gelhoudbak met 100 milliliter TBE met één sterkte. Voeg 10 microliter van de nucleïnezuurgelvlek toe aan het bakje en draai zachtjes rond.

Dek af met folie ter bescherming tegen licht en incubeer statisch bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Spoel de gel vervolgens twee keer af met 100 milliliter gedeïoniseerd kraanwater. Stel de gel onder blauwlichtverlichting af met een amberkleurige filterafdekking.

Snijd voor elke bibliotheek de gel iets boven de ongeveer 125 basispaar prominente adapterdimeerband en onder de laddermarkering van 400 basispaar. Prik de bodem van een buis van 0,65 milliliter met een naald van 22 gauge en plaats de doorboorde buis in een steriele microfugebuis van twee milliliter. Breng de gelschijf over naar de doorboorde buis in de microfugebuis van twee milliliter.

Centrifugeer de microfugebuis van twee milliliter met de doorboorde buis van 0,65 milliliter en monster gedurende twee minuten bij 10.000 maal g bij kamertemperatuur om de gelbrijf in de microfugebuis van twee milliliter te verzamelen. Voeg 300 microliter ijskoude gel-elutiebuffer toe aan de geldrijfmest. Meng op een nutator op kamertemperatuur gedurende minimaal drie uur of een nacht.

Breng alle vloeibare en geldrijfmest over in een filterkolom van 0,22 micrometer en centrifugeer gedurende één minuut bij 10.000 maal g bij kamertemperatuur. Download de broncode voor de CUT&RUN-analyse van de GitHub-pagina door op de groene knop Code te klikken, gevolgd door de optie Zip downloaden. Pak de map uit op een relevante locatie op de lokale computer.

Installeer Conda Environment en voer slechts één keer uit. Zodra Conda is geïnstalleerd, maakt u een virtuele omgeving met de relevante opdracht. Activeer de virtuele omgeving telkens wanneer deze workflow wordt uitgevoerd.

Celwandvertering en nucleaire integriteit werden beoordeeld door zowel controle intacte cellen als geïsoleerde kernen gekleurd met fluorescerende celwand en nucleïnezuurvlekken te visualiseren. In tegenstelling tot de geïsoleerde intacte kernen waar geen celwandkleuring wordt waargenomen, zijn zowel de kernen als de celwanden fluorescerend gelabeld in de intacte controlecellen. De figuur toont CUT&RUN TF-bibliotheken geanalyseerd met behulp van een capillair elektroforese-instrument.

Succesvolle CUT&RUN TF-bibliotheken zijn verrijkt voor korte fragmenten kleiner dan 200 basenparen. Suboptimale CUT&RUN TF-bibliotheken tonen verrijking voor grote DNA-fragmenten. De figuur hierin laat zien dat Ndt80 DNA-bindende motieven zijn verrijkt over alle Ndt80-gebonden loci geïdentificeerd door CUT & RUN, wat aangeeft dat de extra pieken die door deze methodologie worden geïdentificeerd waarschijnlijk bonafide Ndt80-gebonden sites zijn.

Vergelijkende analyse gaf aan dat het CUT&RUN-protocol de meeste van de eerder bekende bindende gebeurtenissen voor Ndt80 en Efg1 tijdens biofilmvorming identificeerde. Over het algemeen overlappen zowel Ndt80 als Efg1 loci met eerder gepubliceerde chIP-gegevens over chromatine-immuunprecipitatie en worden ze alleen geïdentificeerd met behulp van de CUT & RUN. Het stelt ons in staat om de reikwijdte en het tempo van ons onderzoek gericht op transcriptionele regelgevende netwerken en Candida albicans aanzienlijk te vergroten.