Name: Genoombrede profilering van transcriptiefactor-DNA-bindingsinteracties bij Candida albicans: een uitgebreide CUT and RUN-methode en data-analyseworkflow (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Verken de CUT&RUN-methode voor genoombrede profilering van transcriptiefactor-DNA-bindingen bij Candida albicans. Deze computergestuurde workflow biedt snellere, gevoeligere en kosteneffectievere data-analyse dan traditionele ChIP-methoden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken alle voormalige en huidige leden van de laboratoria Nobile en Hernday voor feedback op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) award nummer R35GM124594 en door de familie Kamangar in de vorm van een begiftigde leerstoel aan C.J.N. Dit werk werd ook ondersteund door het NIH National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) awardnummer R15AI137975 aan A.D.H.C.L.E. werd ondersteund door het NIH National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) fellowshipnummer F31DE028488. De inhoud is de exclusieve verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet de standpunten van de financiers. De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek; bij het verzamelen, analyseren of interpreteren van gegevens; bij het schrijven van het manuscript; of in de beslissing om de resultaten te publiceren.

<ol><li>Gulati, M., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilms%3A+development%2C+regulation%2C+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms.</a> Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).</li>
<li>Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+regulation+of+single-and+multi-species+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).</li>
<li>Nobile, C. J., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilms+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilms and human disease.</a> Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).</li>
<li>Nobile, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recently+evolved+transcriptional+network+controls+biofilm+development+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans.</a> Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).</li>
<li>Iracane, E., Vega-Estévez, S., Buscaino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+and+off%3A+epigenetic+regulation+of+C.+albicans+morphological+switches%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches.</a> Pathogens. 10 (11), 1463(2021).</li>
<li>Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+chromatin+accessibility+in+regulating+the+Candida+albicans+white-opaque+phenotypic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fungi%22%5BJournal%5D)">The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch.</a> Journal of Fungi. 7 (1), 37(2021).</li>
<li>Mancera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+complex+transcription+network+controlling+biofilm+formation+in+candida+species%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species.</a> eLife. 10, 64682(2021).</li>
<li>Lohse, M. B., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+Wor4%2C+a+new+transcriptional+regulator+of+white-opaque+switching%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%2C+Genomes%2C+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).</li>
<li>Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+molecular+biology+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Genetics and molecular biology in Candida albicans.</a> Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).</li>
<li>Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+and+microarray-based+analysis+of+protein+location%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location.</a> Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).</li>
<li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733(2015).</li>
<li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIC+and+ChEC%3A+Genomic+mapping+of+chromatin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li>
<li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856(2017).</li>
<li>Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+in+situ+genome-wide+profiling+with+high+efficiency+for+low+cell+numbers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers.</a> Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).</li>
<li>Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient%2C+rapid%2C+and+recyclable+system+for+CRISPR-mediated+genome+editing+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Society+For+Microbiology%22%5BJournal%5D)">An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans.</a> American Society For Microbiology. 2 (2), 00149(2017).</li>
<li>Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+markerless+CRISPR-mediated+system+for+genome+editing+in+Candida+auris+reveals+a+conserved+role+for+Cas5+in+the+caspofungin+response%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Spectrum%22%5BJournal%5D)">A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response.</a> Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021(2021).</li>
<li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+CUT%26RUN+chromatin+profiling+tools%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Improved CUT&RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314(2019).</li>
<li>Skrzypek, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Candida+Genome+Database+%28CGD%29%3A+Incorporation+of+Assembly+22%2C+systematic+identifiers+and+visualization+of+high+throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ssvQC%3A+an+integrated+CUT%26RUN+quality+control+workflow+for+histone+modifications+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">ssvQC: an integrated CUT&RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors.</a> BMC Research Notes. 14 (1), 366(2021).</li>
<li>Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigWig+and+BigBed%3A+enabling+browsing+of+large+distributed+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).</li>
<li>Homann, O. R., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MochiView%3A+Versatile+software+for+genome+browsing+and+DNA+motif+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis.</a> BMC Biology. 8, 49(2010).</li>
<li>Hainer, S. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+chromatin+profiling+using+CUT%26RUN%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85(2019).</li>
<li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).</li>
<li>Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+circuits+regulating+developmental+processes+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711(2020).</li>
<li>Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUT%26amp%3BRUNTools%3A+a+flexible+pipeline+for+CUT%26amp%3BRUN+processing+and+footprint+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">CUT&amp;RUNTools: a flexible pipeline for CUT&amp;RUN processing and footprint analysis.</a> Genome Biology. 20 (1), 192(2019).</li>
<li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li>
</ol>

Clarissa J. Nobile is medeoprichter van BioSynesis, Inc., een bedrijf dat diagnostiek en therapieën ontwikkelt voor biofilminfecties.

Dit protocol presenteert een uitgebreide experimentele en computationele pijplijn voor genoombrede lokalisatie van regulerende TF's in C. albicans. Het is ontworpen om zeer toegankelijk te zijn voor iedereen met standaard microbiologie en moleculaire biologie training. Door gebruik te maken van het hoge dynamische bereik en de lage sample input vereisten van de CUT&RUN assay en het opnemen van optimalisaties voor de lokalisatie van TF-DNA binding interacties in C. albicans biofilm en planktonic culturen...

Candida albicans is een klinisch relevante, polymorfe menselijke schimmelpathogeen die bestaat in een verscheidenheid aan verschillende groeiwijzen, zoals de planktonische (vrij zwevende) groeiwijze en als gemeenschappen van strak gehechte cellen beschermd door een extracellulaire matrix, bekend als de biofilmmodus van groei 1,2,3. Net als bij andere ontwikkelings- en cellulaire processen is biofilmontwikkeling een belangrijke C. albicans virulentie eigenschap waarvan bekend is dat deze op transcriptioneel niveau wordt gecontroleerd door regulerende transcriptiefactoren (TF's) die op een sequentiespecifieke manier aan DNA binden4. Onlangs zijn chromatineregulatoren en histonmodifiers ook naar voren gekomen als belangrijke regulatoren van C. albicans biofilmvorming5 en morfogenese6 door dna-toegankelijkheid te bemiddelen. Om de complexe biologie van deze belangrijke schimmelpathogeen te begrijpen, zijn effectieve methoden om de genoombrede lokalisatie van specifieke TF's te bepalen tijdens verschillende ontwikkelings- en cellulaire processen waardevol.
Chromatine immunoprecipitatie gevolgd door sequencing (ChIP-seq) is een veelgebruikte methode om eiwit-DNA interacties in C. albicans 5,6 te onderzoeken en heeft grotendeels de meer klassieke chromatine immunoprecipitatie gevolgd door microarray (ChIP-chip)9 methode vervangen. Zowel ChIP-seq- als ChIP-chipmethoden vereisen echter een groot aantal invoercellen10, wat een complicerende factor kan zijn bij het onderzoeken van TF's in de context van specifieke monsters en groeiwijzen, zoals biofilms verzameld van patiënten of diermodellen van infectie. Bovendien levert de chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) -test vaak een aanzienlijke hoeveelheid achtergrondsignaal op in het hele genoom, wat een hoge mate van verrijking vereist voor het doelwit van belang om signaal voldoende van ruis te scheiden. Hoewel de ChIP-chip-assay tegenwoordig grotendeels verouderd is, maken de sequencingdieptes die nodig zijn voor ChIP-seq deze test onbetaalbaar voor veel onderzoekers, met name degenen die meerdere TF's en / of chromatine-geassocieerde eiwitten bestuderen.

Splitsing onder doelen en loslaten met behulp van nuclease (CUT&RUN) is een aantrekkelijk alternatief voor ChIP-seq. Het werd in 2017 ontwikkeld door het Henikoff-lab om de beperkingen van ChIP-seq en chromatine endogene splitsing te omzeilen, gevolgd door sequencing ChEC-seq 11,12, een andere methode om eiwit-DNA-interacties op genoombreed niveau te identificeren, terwijl het hoge resolutie, genoombrede mapping van TF's en chromatine-geassocieerde eiwittenbiedt 13 . CUT&RUN vertrouwt op de gerichte vertering van chromatine in gepermeabiliseerde kernen met behulp van vastgebonden microkokkennucleasen, gevolgd door sequencing van de verteerde DNA-fragmenten 9,10. Aangezien DNA-fragmenten specifiek worden gegenereerd bij de loci die gebonden zijn door een eiwit van belang, in plaats van door het hele genoom te worden gegenereerd via willekeurige fragmentatie zoals in ChIP-assays, resulteert de CUT & RUN-benadering in sterk verminderde achtergrondsignalen en vereist dus 1/10e van de sequencingdiepte in vergelijking met ChIP-seq11,13, 14. Deze verbeteringen leiden uiteindelijk tot aanzienlijke verlagingen van de sequencingkosten en vermindering van het totale aantal inputcellen dat nodig is als uitgangsmateriaal voor elk monster.
Hier wordt een robuust CUT&RUN-protocol beschreven dat is aangepast en geoptimaliseerd voor het bepalen van de genoombrede lokalisatie van TF's in C. albicans-cellen geïsoleerd uit biofilms en planktonculturen. Een grondige pijplijn voor gegevensanalyse wordt ook gepresenteerd, die de verwerking en analyse van de resulterende sequentiegegevens mogelijk maakt en vereist dat gebruikers minimale expertise hebben in codering of bio-informatica. In het kort beschrijft dit protocol epitoop-tagging van TF-coderende genen, het oogsten van biofilm- en planktoncellen, isolatie van intacte permeabiliseerde kernen, incubatie met primaire antilichamen tegen het specifieke eiwit of epitoop-gelabelde eiwit van belang, tethering van de chimere A / G-microkokkenkernen (pAG-MNase) fusie-eiwitten aan de primaire antilichamen, genomisch DNA-herstel na chromatinevertering en voorbereiding van genomische DNA-bibliotheken voor sequencing.
Het experimentele CUT&RUN-protocol wordt gevolgd door een speciaal gebouwde pijplijn voor gegevensanalyse, die ruwe DNA-sequencing leest in FASTQ-formaat en alle vereiste verwerkingsstappen implementeert om een volledige lijst te bieden van aanzienlijk verrijkte loci gebonden door de TF van belang (gericht op het primaire antilichaam). Merk op dat meerdere stappen van het beschreven bibliotheekvoorbereidingsprotocol specifiek zijn aangepast en geoptimaliseerd voor CUT & RUN-analyse van TF's (in tegenstelling tot nucleosomen). Hoewel de gegevens in dit manuscript werden gegenereerd met behulp van TF-specifieke aanpassingen van een commerciële CUT & RUN-kit, zijn deze protocollen ook gevalideerd met behulp van individueel geproduceerde componenten (d.w.z. pAG-MNase-enzym en magnetische DNA-zuiveringsparels) en in-house voorbereide buffers, die de experimentele kosten aanzienlijk kunnen verlagen. De uitgebreide experimentele en data-analyseprotocollen worden hieronder in detail beschreven in een stap-voor-stap formaat. Alle reagentia en kritieke apparatuur, evenals buffer- en mediarecepten, worden vermeld in respectievelijk de tabel met materialen en aanvullend dossier 1.

<table><tbody><tr><td>0.22 &mu;m filter</td><td>Millipore Sigma</td><td>SLGPM33RS</td><td></td></tr><tr><td>0.65 mL low-adhesion tubes</td><td>VWR</td><td>490003-190</td><td></td></tr><tr><td>1 M CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-152-341</td><td></td></tr><tr><td>1 M PIPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ61224AK</td><td></td></tr><tr><td>12-well untreated cell culture plates</td><td>Corning</td><td>351143</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60-24-2</td><td></td></tr><tr><td>2% Digitonin</td><td>Fisher Scientific</td><td>CHR103MI</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tubes</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>5x phusion HF buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td>Item deel van de Phusion high fidelity DNA polymerase; verwezen naar in de tekst als "DNA polymerase buffer"</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Criterion</td><td>C5001</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP magnetic beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>Verwezen naar in de tekst als "capillary electrophoresis instrument"; gebruikersafhankelijk</td></tr><tr><td>Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific</td><td>VWR</td><td>89133-910</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Benchling primer design tool</td><td>Benchling</td><td></td><td>https://www.benchling.com/molecular-biology/; Verwezen naar in de tekst als "the primer design tool"</td></tr><tr><td>Betaine</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ77507AB</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor white stain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18909-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Candida Genome Database</td><td></td><td></td><td>http://www.candidagenome.org/</td></tr><tr><td>Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads</td><td>Polysciences</td><td>&nbsp;86057-3</td><td></td></tr><tr><td>Conda software</td><td></td><td></td><td>https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html</td></tr><tr><td>curl tool</td><td></td><td></td><td>http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz</td></tr><tr><td>CUTANA ChIC/CUT&amp;RUN kit</td><td>Epicypher</td><td>14-1048</td><td>Verwezen naar in de tekst als "the CUT&amp;RUN kit"</td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (D-glucose)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D163</td><td></td></tr><tr><td>Difco D-mannitol</td><td>&nbsp;BD Biosciences</td><td>217020</td><td></td></tr><tr><td>Disposable cuvettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-127</td><td></td></tr><tr><td>Disposable transfer pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>DNA Gel Loading Dye (6x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq green DNA polymerase</td><td>Fisher Scientific</td><td>EP0713</td><td>Verwezen naar in de tekst als "cPCR DNA polymerase"</td></tr><tr><td>DreamTaq green DNA polymerase buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>EP0713</td><td>Item deel van de DreamTaq green DNA polymerase; verwezen naar in de tekst als "cPCR DNA polymerase buffer"</td></tr><tr><td>E. coli spike-in DNA</td><td>Epicypher</td><td>18-1401</td><td></td></tr><tr><td>ELMI Microplate incubator</td><td>ELMI</td><td>TRMS-04</td><td>Verwezen naar in de tekst als "microplate incubator"</td></tr><tr><td>End Prep Enzyme Mix</td><td></td><td></td><td>Item deel van de NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td></tr><tr><td>End Prep Reaction Buffer</td><td></td><td></td><td>Item deel van de NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>VWR</td><td>89125-170</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest MssI</td><td>Fisher Scientific</td><td>FD1344</td><td>Verwezen naar in de tekst als "restriction enzyme"</td></tr><tr><td>FastDigest MssI Buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>FD1344</td><td>Item deel van de FastDigest MssI kit; verwezen naar in de tekst als "restriction enzyme buffer"</td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP525-25</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td></td><td></td><td>Gebruikersafhankelijk</td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td></td><td></td><td>Gebruikersafhankelijk</td></tr><tr><td>GeneRuler low range DNA ladder</td><td>Fisher Scientific</td><td>FERSM1192</td><td></td></tr><tr><td>GitBash workflow</td><td></td><td></td><td>https://gitforwindows.org/</td></tr><tr><td>GitHub source code</td><td></td><td></td><td>https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis</td></tr><tr><td>HEPES-KOH pH 7.5</td><td>Boston BioProducts</td><td>BBH-75-K</td><td></td></tr><tr><td>High-speed centrifuge</td><td></td><td></td><td>Gebruikersafhankelijk</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PX1830-4</td><td></td></tr><tr><td>Lens paper</td><td>VWR</td><td>52846-001</td><td></td></tr><tr><td>Ligation Enhancer</td><td></td><td></td><td>Item deel van de NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td></tr><tr><td>Lithium acetate dihydrate</td><td>MP Biomedicals</td><td>215525683</td><td></td></tr><tr><td>Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody</td><td>Takara</td><td>632592</td><td>Gebruikersafhankelijk</td></tr><tr><td>MACS2</td><td></td><td></td><td>https://pypi.org/project/MACS2/</td></tr><tr><td>Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes</td><td>Epicypher</td><td>10-0008</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>MR02</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Microplate and cuvette spectrophotometer</td><td>BioTek</td><td>EPOCH2TC</td><td>Verwezen naar in de tekst als "spectrophotometer"; gebruikersafhankelijk</td></tr><tr><td>MochiView</td><td></td><td></td><td>http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3183</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td>470302-522</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>NCBI GEO</td><td></td><td></td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/</td></tr><tr><td>NEBNext Adaptor for Illumina</td><td></td><td></td><td>Item deel van de NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); verwezen naar in de tekst als "Adapter"</td></tr><tr><td>NEBNext Index X Primer for Illumina</td><td></td><td></td><td>Item deel van de NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); verwezen naar in de tek

genoombrede profilering van transcriptiefactor-dna-bindingsinteracties bij candida albicans: een uitgebreide cut &amp; run-methode en data-analyseworkflow

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

Regulerende transcriptiefactoren beheersen veel belangrijke biologische processen, waaronder cellulaire differentiatie, reacties op omgevingsverstoringen en -spanningen en gastheer-pathogeeninteracties. Het bepalen van de genoombrede binding van regulerende transcriptiefactoren aan DNA is essentieel om de functie van transcriptiefactoren in deze vaak complexe biologische processen te begrijpen. Splitsing onder doelen en afgifte met behulp van nuclease (CUT & RUN) is een moderne methode voor genoombrede mapping van in vivo eiwit-DNA-bindingsinteracties die een aantrekkelijk alternatief is voor de traditionele en veel gebruikte chromatine-immunoprecipitatie gevolgd door sequencing (ChIP-seq) -methode. CUT&RUN is geschikt voor een experimentele opstelling met een hogere doorvoer en heeft een aanzienlijk hoger dynamisch bereik met lagere sequencingkosten per monster dan ChIP-seq. Hier worden een uitgebreid CUT&RUN-protocol en bijbehorende data-analyseworkflow beschreven die is toegesneden op genoombrede analyse van transcriptiefactor-DNA-bindingsinteracties in de menselijke schimmelpathogeen Candida albicans . Dit gedetailleerde protocol omvat alle noodzakelijke experimentele procedures, van epitoop tagging van transcriptiefactorcoderende genen tot bibliotheekvoorbereiding voor sequencing; daarnaast bevat het een aangepaste computationele workflow voor CUT & RUN-gegevensanalyse.

Dit robuuste CUT&RUN-protocol werd aangepast en geoptimaliseerd voor het onderzoeken van de genoombrede lokalisatie van specifieke TF's in C. albicans biofilms en planktonculturen (zie figuur 2 voor een overzicht van de experimentele aanpak). Een grondige pijplijn voor gegevensanalyse is ook inbegrepen om de analyse van de resulterende CUT & RUN-sequencinggegevens te vergemakkelijken en vereist dat gebruikers minimale expertise hebben in codering of bio-informatica (zie <strong clas...

Dit protocol beschrijft een experimentele methode en data-analyse workflow voor splitsing onder doelen en afgifte met behulp van nuclease (CUT & RUN) in de menselijke schimmelpathogeen Candida albicans.

Genoombrede profilering van transcriptiefactor-DNA-bindingsinteracties bij Candida albicans: een uitgebreide CUT &amp; RUN-methode en data-analyseworkflow

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...

Dit protocol beschrijft alle experimentele procedures, van epitoop tagging van transcriptiefactorcoderende genen via computationele data-analyse, tot het uitvoeren van genoombrede profilering van transcriptiefactor-DNA-bindingsinteracties in Candida albicans via CUT & RUN. Dit is een meer toegankelijke, snellere, gevoeligere, goedkopere techniek en biedt gegevens van hogere kwaliteit dan traditionele ChIP-chip- en ChIP-seq-benaderingen. Hoewel ons protocol is ontwikkeld voor Candida albicans cellen geïsoleerd uit biofilms of planktonische culturen, zou het praktisch moeten zijn om het aan te passen aan vrijwel elke goede vorm van Candida albicans cellen.Breng na het uitbroeden van de celsuspensie een aliquot van vijf microliter over in een nieuwe PCR-buis. Voeg aan vijf microliter geïsoleerde kernen en een aliquot van vijf microliter intacte cellen die eerder bij vier graden Celsius waren opgeslagen, één microliter calcofluorwit en SYTO 13 toe. Incubeer bij 30 graden Celsius in het donker gedurende 30 minuten.Inspecteer visueel de integriteit en zuiverheid van de geïsoleerde kernen met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Zoek naar geïsoleerde kernen met prominente SYTO 13-kleuring en zorg ervoor dat de celwand niet kleurt door de calcofluor-witte kleurstof. Herhaal de inspectie met intacte cellen als controle voor celwandkleuring met calcofluor-witte kleurstof.Plaats de buizen op een magneetrek en wacht tot de drijfmest helemaal helder is. Gooi het supernatant weg met een pipet. Voeg 50 microliter van de antilichaambuffer toe en meng voorzichtig door te pipetteren.Voeg drie microliter van het anti-GFP polyklonale antilichaam toe aan de buizen en incubeer de buisjes op een notenmixer bij 4 graden Celsius gedurende twee uur. Centrifugeer de buizen kortstondig gedurende vijf seconden bij 100 maal g bij kamertemperatuur en plaats de buizen op een magnetisch rek. Zodra de slurry helder is, gooit u het supernatant weg met een pipet.Terwijl de buizen met de kralen zich nog op het magnetische rek bevinden, voegt u 200 microliter ijskoude celpermeabilisatiebuffer rechtstreeks op de kralen toe. Gooi het supernatant weg met een pipet. Herhaal twee wasbeurten met de ijskoude celpermeabilisatiebuffer.Voeg 50 microliter ijskoude celpermeabilisatiebuffer toe aan elke buis en meng voorzichtig door te pipetteren. Voeg 2,5 microliter van het eiwit AG-MNase toe aan elk monster en meng door te pipetteren. Plaats de monsters op een notenmixer bij 4 graden Celsius en incubeer de monsters gedurende een uur.Centrifugeer de stripbuizen kort op 100 maal g bij kamertemperatuur gedurende vijf seconden en plaats de buizen vervolgens op een magnetisch rek. Zodra de slurry helder is, gooit u het supernatant weg met een pipet. Terwijl de buizen met de kralen zich nog op het magnetische rek bevinden, voegt u 200 microliter ijskoude celpermeabilisatiebuffer rechtstreeks op de kralen toe.Gooi het supernatant weg met een pipet. Herhaal twee wasbeurten met de ijskoude celpermeabilisatiebuffer. Voeg 100 microliter van de ijskoude celpermeabilisatiebuffer toe aan de monsters en pipetteer voorzichtig vijf keer op en neer.Verwijder het gelverband uit de gelbox en open het gelverband volgens de instructies van de fabrikant. Verwijder de gel voorzichtig uit het gelgietsel en plaats deze in een gelhoudbak met 100 milliliter TBE met één sterkte. Voeg 10 microliter van de nucleïnezuurgelvlek toe aan het bakje en draai zachtjes rond.Dek af met folie ter bescherming tegen licht en incubeer statisch bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Spoel de gel vervolgens twee keer af met 100 milliliter gedeïoniseerd kraanwater. Stel de gel onder blauwlichtverlichting af met een amberkleurige filterafdekking.Snijd voor elke bibliotheek de gel iets boven de ongeveer 125 basispaar prominente adapterdimeerband en onder de laddermarkering van 400 basispaar. Prik de bodem van een buis van 0,65 milliliter met een naald van 22 gauge en plaats de doorboorde buis in een steriele microfugebuis van twee milliliter. Breng de gelschijf over naar de doorboorde buis in de microfugebuis van twee milliliter.Centrifugeer de microfugebuis van twee milliliter met de doorboorde buis van 0,65 milliliter en monster gedurende twee minuten bij 10.000 maal g bij kamertemperatuur om de gelbrijf in de microfugebuis van twee milliliter te verzamelen. Voeg 300 microliter ijskoude gel-elutiebuffer toe aan de geldrijfmest. Meng op een nutator op kamertemperatuur gedurende minimaal drie uur of een nacht.Breng alle vloeibare en geldrijfmest over in een filterkolom van 0,22 micrometer en centrifugeer gedurende één minuut bij 10.000 maal g bij kamertemperatuur. Download de broncode voor de CUT&RUN-analyse van de GitHub-pagina door op de groene knop Code te klikken, gevolgd door de optie Zip downloaden. Pak de map uit op een relevante locatie op de lokale computer.Installeer Conda Environment en voer slechts één keer uit. Zodra Conda is geïnstalleerd, maakt u een virtuele omgeving met de relevante opdracht. Activeer de virtuele omgeving telkens wanneer deze workflow wordt uitgevoerd.Celwandvertering en nucleaire integriteit werden beoordeeld door zowel controle intacte cellen als geïsoleerde kernen gekleurd met fluorescerende celwand en nucleïnezuurvlekken te visualiseren. In tegenstelling tot de geïsoleerde intacte kernen waar geen celwandkleuring wordt waargenomen, zijn zowel de kernen als de celwanden fluorescerend gelabeld in de intacte controlecellen. De figuur toont CUT&RUN TF-bibliotheken geanalyseerd met behulp van een capillair elektroforese-instrument.Succesvolle CUT&RUN TF-bibliotheken zijn verrijkt voor korte fragmenten kleiner dan 200 basenparen. Suboptimale CUT&RUN TF-bibliotheken tonen verrijking voor grote DNA-fragmenten. De figuur hierin laat zien dat Ndt80 DNA-bindende motieven zijn verrijkt over alle Ndt80-gebonden loci geïdentificeerd door CUT & RUN, wat aangeeft dat de extra pieken die door deze methodologie worden geïdentificeerd waarschijnlijk bonafide Ndt80-gebonden sites zijn.Vergelijkende analyse gaf aan dat het CUT&RUN-protocol de meeste van de eerder bekende bindende gebeurtenissen voor Ndt80 en Efg1 tijdens biofilmvorming identificeerde. Over het algemeen overlappen zowel Ndt80 als Efg1 loci met eerder gepubliceerde chIP-gegevens over chromatine-immuunprecipitatie en worden ze alleen geïdentificeerd met behulp van de CUT & RUN. Het stelt ons in staat om de reikwijdte en het tempo van ons onderzoek gericht op transcriptionele regelgevende netwerken en Candida albicans aanzienlijk te vergroten.

genome-wide-profiling-transcription-factor-dna-binding-interactions

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We ontwikkelden een protocol dat snel, gevoelig en reproduceerbaar is voor het profileren van pathogene genexpressie tijdens een infectie.

Genexpressie infecteren Microben Met behulp van een digitale Bar-codering Platform

We presenteren een strategisch plan en protocol voor het identificeren van niet-coderende genetische varianten die de binding van transcriptiefactoren (TF) aan DNA beïnvloeden. Er wordt een gedetailleerd experimenteel protocol gegeven voor elektroforetische mobiliteitsverschuivingsassay (EMSA) en DNA-affiniteitsprecipitatie-assay (DAPA) analyse van genotype-afhankelijke TF DNA-binding.

Screening voor Functionele niet-coderende genetische varianten Met behulp van Electroforetische Mobility Shift Assay (EMSA) en DNA-affiniteit Neerslag Assay (DAPA)

Galaxy en David hebben zich ontwikkeld tot populaire tools die het mogelijk maken de onderzoekers zonder bioinformatica training te analyseren en RNA-Seq gegevens te interpreteren. We beschrijven een protocol voor C. elegans onderzoekers RNA-Seq experimenten toegang voeren en verwerken dataset behulp Galaxy en zinvolle biologische informatie uit het gen lijsten met behulp DAVID verkrijgen.

Transcriptoom analyse<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA Sequencing gegevens via de Tuxedo Suite op de Galaxy Project

We beschrijven chromatin endogene splitsing gekoppeld aan high-throughput sequencing (ChEC-seq), een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) -orthogonale methode voor het mappen van eiwitbindingsplaatsen genoom-wijd met micrococculaire nuclease (MNase) fusie-eiwitten.

Genoom-wide mapping van eiwit-DNA-interacties met ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Dit protocol beschrijft het combinatorische gebruik van ChIP-seq, 4sU-seq en totaal RNA-seq ribosoom profilering voor cellijnen en primaire cellen. Hierdoor wijzigingen bijhouden in transcriptiefactor bindend, DOVO transcriptie, RNA-verwerking, omzet en vertaling na verloop van tijd, en de algemene gang van zaken in geactiveerd en/of snel veranderende cellen weer te geven.

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

Hier presenteren we een nieuwe methode voor de vaststelling van bindende affiniteiten bij evenwicht en in oplossing met hoge gevoeligheid op grote schaal. Dit verbetert de kwantitatieve analyse van transcriptie factor-DNA-bindende. De methode is gebaseerd op geautomatiseerde fluorescentie anisotropie metingen in een gecontroleerde levering systeem.

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Hier presenteren we een verbeterde gist één-hybrid screening protocol ter identificatie van de transcriptiefactoren (TFs) die zich aan een menselijke DNA-regio van belang binden kunnen. Deze methode maakt gebruik van een high-throughput screening-pijpleiding die de binding van ondervragen kan &gt; 1000 TFs in een enkele experiment.

Verbeterde gist One-hybride schermen te identificeren van de transcriptiefactor binden aan menselijke DNA-sequenties

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft een complete pijplijn om RNA-sequencing transcriptoomgegevens te analyseren, van ruwe reads tot functionele analyse, inclusief kwaliteitscontrole en voorbewerkingsstappen tot geavanceerde statistische analytische benaderingen.

Transcriptoomanalyse met hoge doorvoer voor het onderzoeken van gastheer-pathogeeninteracties

CUT&amp;RUN en zijn varianten kunnen worden gebruikt om de eiwitbezetting op chromatine te bepalen. Dit protocol beschrijft hoe de eiwitlokalisatie op chromatine kan worden bepaald met behulp van eencellige uliCUT &amp; RUN.

Single-Cell Factor Lokalisatie op Chromatine met behulp van Ultra-Low Input Cleavage Under Targets en Release met Nuclease

Een geoptimaliseerd Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease gevolgd door next generation sequencing (CUT&amp;RUN-seq) protocol wordt beschreven voor neuro-endocriene kleincellige longkankercellijnen. Het maakt genoombrede mapping mogelijk van diverse histonmodificaties en transcriptiefactoren (bijv. E2F7) bindingsplaatsen om epigenetische en transcriptionele deregulatie in de SCLC-pathobiologie te onderzoeken.

Genoom-brede mapping van histonmodificaties en bindingsplaatsen voor transcriptiefactoren in neuro-endocriene kleincellige longkankercellijnen met behulp van CUT&amp;RUN

Hier presenteren we een snel en eenvoudig ATAC-seq-protocol dat geïmplementeerd kan worden in L4-fase Caenorhabditis elegans whole-worm met slechts 30 μL wormpellet.

Chromatine toegankelijkheidsprofilering bij hele Caenorhabditis elegans L4-larven

Verken de CUT&RUN-methode voor genoombrede profilering van transcriptiefactor-DNA-bindingen bij Candida albicans. Deze computergestuurde workflow biedt snellere, gevoeligere en kosteneffectievere data-analyse dan traditionele ChIP-methoden.

Genoombrede profilering van transcriptiefactor-DNA-bindingsinteracties bij Candida albicans: een uitgebreide CUT and RUN-methode en data-analyseworkflow (Video) | JoVE Journal

Genoombrede profilering van transcriptiefactor-DNA-bindingsinteracties bij Candida albicans: een uitgebreide CUT & RUN-methode en data-analyseworkflow

Meer video's verkennen