Omgekeerde genetica om varianten van het RNA-virus met positieve zin te ontwikkelen

Het hier beschreven protocol maakt het mogelijk om willekeurig gemutageniseerde RNA-bibliotheken van volledige lengte van enkelstrengs positieve RNA-virale genomen tot 10 kilobytes lang te genereren, en om fenotypes van belang te selecteren onder de gewenste experimentele omstandigheden. Deze techniek kan in korte tijd virale RNA-bibliotheken van volledige lengte creëren met verschillende niveaus van genetische diversiteit met behulp van een kloonvrije benadering. De techniek maakt gebruik van goedkope en algemeen verkrijgbare reagentia voor de synthese van bibliotheken.

Shaheen Khan, een promovendus van de afdeling Virologie, afdeling Life Sciences, Shiv Nadar University, zal de procedure demonstreren. Voer om te beginnen ep-PCR uit door de mastermix voor te bereiden voor vier sets experimenten met voorwaartse en achterwaartse primers samen met de reactiecomponenten zonder de pJFH1-sjabloon, zoals beschreven in het tekstmanuscript. Aliquot de master mix in vier buizen.

Voeg 100 nanogram, 50 nanogram, 25 nanogram en 10 nanogram van de sjabloon toe aan de afzonderlijke buisjes en pas het totale volume van de reactie aan tot 50 microliter. Pas de cycluscondities toe om een fragment van 97 36-basenparen te versterken. Schat het ep-PCR-product geamplificeerd door vijf microliter van de PCR-producten te laden en het te vergelijken met bekende hoeveelheden van een kilobase DNA-ladder door een op 0,8% TAE gebaseerde agarosegelelektroforese uit te voeren.

Zuiver het product met behulp van een kolomreinigingsset. Schat de concentratie van het gezuiverde product door de absorptie op 260 nanometer te meten. Concentreer het ep-PCR-product vacuüm om een productconcentratie te verkrijgen die gelijk is aan of groter is dan 100 nanogram per microliter.

Zet een in vitro RNA-synthesereactie op en plaats deze op 37 graden Celsius voor incubatie. Zuiver vervolgens het gesynthetiseerde product met behulp van een kolomzuiveringskit. Zet een cDNA-synthesereactie van 20 microliter op door ongeveer één microgram van het virale RNA, vijf micromolaire omgekeerde primer en 200 eenheden reverse transcriptase toe te voegen, volgens de aanbevelingen van de fabrikant.

Gebruik het cDNA om een reactiemengsel te maken zoals beschreven in het tekstmanuscript en voer een amplificatiecyclus uit. Laat het product draaien op een op 0,8% TAE gebaseerde agarosegel om de productgrootte van 25 71-basenparen te bevestigen en zuiver het product vervolgens met behulp van een kolomzuiveringskit zoals eerder gedemonstreerd. Elute in 40 microliter steriel water.

Om een overhang van drie priemgetallen toe te voegen, voegt u 0,5 micromolaire DATP en één eenheid low-fidelity Taq-DNA-polymerase toe en incubeert u het volledige PCR-product bij 70 graden Celsius gedurende 30 minuten, samen met 1X PCR-buffer en 1,5 millimolair magnesiumchloride. Zuiver het mengsel vervolgens met behulp van een kolomreinigingsset. Stel de ligatiereactie in en incubeer deze gedurende drie uur bij kamertemperatuur.

Voeg vervolgens 100 microliter Escherichia coli DH5-Alpha toe aan het geligeerde DNA en geef de cellen gedurende 35 seconden een hitteschok bij 42 graden Celsius. Voeg een milliliter LB-medium toe aan de celsuspensie en incubeer met zacht schudden gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Centrifugeer bij 13.800 RCF.

Gooi het supernatant weg en resuspendeer in 200 microliter vers LB-medium. Plaat 100 microliter van de getransformeerde E.coli DH5-Alpha-cellen op een LB-plaat met 50 microgram per milliliter ampicilline, en incubeer gedurende 16 uur bij 37 graden Celsius. Zet mini-preps van 25 tot 30 kolonies op in vijf milliliter LB-medium met 50 microgram ampicilline per milliliter en groei 's nachts bij 37 graden Celsius.

Extraheer de volgende dag de plasmiden met een commerciële kit en voer restrictie-enzymvertering uit in 10 microliter volume met 200 nanogram van de geïsoleerde plasmiden, twee eenheden EcoR1 en 1X restrictiebuffer voor alle kolonies. Na het incuberen van de digestiemengsels bij 37 graden Celsius gedurende drie uur, laadt u de producten op 0,8% TAE-gebaseerde agarosegel om de invoeging van plasmide-DNA te bevestigen. Voer Sanger-sequencing uit van de plasmiden van 25 positieve klonen met behulp van de aanbevolen primers.

Een dag voor de transfectie splitst u de cellen en telt u het aantal levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer. Zaai vervolgens het menselijke hepatoom 7,5 cellen in schaaltjes van 35 millimeter in twee milliliter complete DMEM en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius gedurende 16 uur in een bevochtigde incubator met 5% koolstofdioxide. Bereid de volgende dag het transcriptlipidencomplex voor door 10 microliter transfectiereagens te verdunnen in 50 microliter van het minimale essentiële medium en afzonderlijk vijf microgram virale transcripten te verdunnen in 50 microliter van het minimale essentiële medium.

Incubeer beide mengsels gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Meng ze vervolgens in een enkele steriele microcentrifugebuis en incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder na de celincubatie het kweekmedium, was de cellen twee keer met voorverwarmde 1X PBS en voeg 1,5 milliliter van het minimale essentiële medium toe.

Voeg langzaam het complex toe en draai de schaal voorzichtig rond voor een gelijkmatige verdeling. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 10 uur. Verwijder vervolgens het medium.

Was de getransfecteerde cellen twee keer met één milliliter voorverwarmde 1X PBS en voeg twee milliliter complete DMEM toe. Isoleer viraal RNA uit 140 microliter kweeksupernatanten met behulp van een virale RNA-isolatiekit. Zet een qRT-PCR-reactie van 10 microliter op met behulp van een in de handel verkrijgbare qRT-PCR-kit.

Gebruik de voorwaartse en achterwaartse primers en sonde voor HCV-RNA-kwantificering. Stel de reactiecyclus in op 48 graden Celsius gedurende 20 minuten, 95 graden Celsius gedurende 10 minuten en 45 cycli van 95 graden Celsius gedurende 15 seconden en 60 graden Celsius gedurende één minuut. Voer de reacties uit en stel negatieve controles in.

Genereer tegelijkertijd een standaardcurve met behulp van een tienvoudig serieel verdund bekend kopieaantal HCV-transcripten om viraal RNA te kwantificeren. Voer in drievoud uit. Plaat menselijk hepatoom 7,5 cellen in een plaat met 96 putjes en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in een 5%-kooldioxide-incubator ongeveer 16 uur voordat het virus wordt toegevoegd.

Voer in een bioveiligheidsklasse II-kast tienvoudige seriële verdunningen van het virus uit. Voeg 100 microliter van het verdunde virus per putje toe om cellen te infecteren en incubeer ze bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Was de geïnfecteerde cellen na drie dagen driemaal met 0,1 milliliter PBS en fixeer en permeabiliseer de cellen met 0,1 milliliter ijskoude methanol bij min 20 graden Celsius gedurende 20 minuten.

Was de putjes driemaal met 1X PBS en daarna 1X met PBST. Blokkeer na het verwijderen van de PBST de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met 0,1 milliliter 1%BSA met 0,2% magere melk in PBST. Verwijder de blokkerende oplossing en behandel de cellen gedurende vijf minuten met 0,1 milliliter 3% waterstofperoxide bereid in 1X PBS.

Nogmaals, was de cellen twee keer met 1X PBS en 1X met PBST. Voeg 50 microliter anti-NS5A 9E10 monoklonaal antilichaam per putje toe en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur. Was de putjes driemaal met 1X PBS en één keer met PBST.

Voeg 50 microliter HRP-geconjugeerd geitenanti-muis secundair IgG per putje toe, incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en verwijder vervolgens het ongebonden antilichaam door de putjes te wassen met 0,1 milliliter 1X PBS. Voeg 30 microliter DAB toe en incubeer de plaat met zacht schommelen gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Verwijder de DAB-oplossing en was de putjes twee keer met 1X PBS en één keer met gedestilleerd water.

Voeg 100 microliter PBS toe met 0,03% natriumazide. Onderzoek elk putje onder een omgekeerde lichtmicroscoop met behulp van een 10X-objectief. Tel het aantal positieve putjes.

Gebruik een riet- en münchencalculator om de eindpuntverdunning te schatten die 50% van de putten infecteert. Los pibrentasvir, een NS5A-remmer, op in 100%DMSO tot een concentratie van één millimolair en verdun het verder in volledige DMEM tot een concentratie van 10 nanomolair. Infecteer vervolgens naïeve Huh-7.5-cellen bij 70%confluentie met een ML50-virusdosis om 50% van de cellen gedurende 12 uur te infecteren, en breng vervolgens de geïnfecteerde cellen 24 uur na infectie over op platen met zes putjes.

Voeg 1X EC50 PIB toe aan de geïnfecteerde cellen na 16 uur celsplitsing. Doe dit na elke celsplitsing gedurende zes opeenvolgende passages, gevolgd door drie medicijnvrije passagecycli, en volg de verspreiding van het virus met behulp van een focusvormende test. Oogst virale supernatanten bij elke passage en bewaar ze bij min 80 graden Celsius.

Extraheer viraal RNA uit het supernatans op dag 18 en het gesynthetiseerde cDNA. Amplificeer het NS5A-gen met behulp van vijf microliter verdund cDNA. Bepaal vervolgens NS5A-geneesmiddelresistentiemutaties in zes tot acht positieve bacteriële plasmiden met behulp van de NS5A-sequencingprimers.

Volledige genoommutantbibliotheken werden gesynthetiseerd met behulp van klonaal pJFH1 in afnemende hoeveelheden van 100 tot 10 nanogram. De gemiddelde opbrengst van ep-PCR-producten varieerde van 3,8 tot 12,5 nanogram per microliter. Het aandeel mutaties in mutantbibliotheken nam toe met afnemende input van pJFH1 in de ep-PCR-reactie.

ML50 gesynthetiseerd met behulp van 50 nanogram van de sjabloon had vier substituties per 10.000 gekopieerde basenparen, terwijl ML25 gesynthetiseerd met behulp van 25 nanogram sjabloon negen substituties bevatte. Er werden geen substituties gevonden binnen het aantal nucleotiden waarvan de sequentie werd bepaald in klonaal pJFH1. ML50-virale varianten waren minder vatbaar voor pibrentasvir in vergelijking met het klonale JFH1-virus.

Van de acht NS5A-klonen hadden er vier een combinatie van D7V+F28C, terwijl V8A+F28C en F36L elk in één kloon voorkwamen. Deze mutaties bevonden zich in het N-eindpunt van NS5A, waarvan bekend is dat het klinisch relevante NS5A-resistentiemutaties herbergt. De uiteindelijke concentratie van elk bestanddeel van ep-PCR is van cruciaal belang, met name de hoeveelheid sjabloon.

Het ontbreken van KB Extender zal de opbrengst van het ep-PCR-product aanzienlijk verminderen.