Onderzoek naar de verlichtende effecten van toediening van Bacillus cereus op colitis door middel van darmmicrobiotamodulatie

Dit protocol maakt het mogelijk om het bidirectionele regulerende effect van probiotische suppletie op de gezondheid en stabiele en reproduceerbare resultaten te evalueren. Een alternatief DSS-geïnduceerd colitismodel werd opgesteld met behulp van pseudo-kiemvrije muizen om enkele laboratoriumbeperkingen te vermijden bij het gebruik van kiemvrije muizen als receptoren voor probiotica. Om de gunstige effecten van probiotica in deze techniek te onderzoeken, is het een veelbelovende benadering voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingsstrategieën voor het verlichten van de symptomen van chronische ontstekingsgerelateerde aandoeningen.

Bereid om te beginnen een cocktail van antibiotica voor door ampicilline, neomycinesulfaat, metronidazol en vancomycine in drinkwater op te lossen. Bewaar de oplossingen na volledige oplossing bij vier graden Celsius. Doe de antibiotische cocktailoplossingen in een waterfles.

Zorg ervoor dat u bruine flessen gebruikt of wikkel de flessen in aluminiumfolie om de antibiotische oplossingen tegen licht te beschermen. Plaats de fles op de muizenkooi. Om een 2,5% dextraansulfaat-natriumoplossing te maken, lost u 2,5 gram DSS op in 100 milliliter gedestilleerd water.

Vervang het drinkwater door de 2,5%DSS oplossing in de colitis model muizengroep. Om het positieve effect van B cereus op het verlichten van colitis te beoordelen, worden de muizen willekeurig toegewezen aan de volgende drie groepen, de controlegroep, het DSS-geïnduceerde colitismodel en probiotische B cereus-suppletie voor DSS-geïnduceerde muizen. Om de rol van de darmmicrobiota bij het reguleren van de probiotische effecten van B cereus op door DSS geïnduceerde colitis te onderzoeken, worden de muizen willekeurig toegewezen aan de volgende drie groepen, ABX/controle, ABX/DSS en ABX/B cereus plus DSS.

Noteer het lichaamsgewicht van de muizen als het basisgewicht na toediening van de antibioticacocktail. Behandel de mannelijke C 57 BL zes muizen onmiddellijk met 2,5%DSS-oplossing in drinkwater gedurende zeven dagen. Bereid acht microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter voor, gevuld met 900 microliter steriele normale zoutoplossing.

Pipetteer 100 microliter logaritmische groei B cereus en los op in 900 microliter steriele normale zoutoplossing. Verdun B cereus serieel met behulp van tubes. Plak 40 microliter van elke verdunning op de respectieve LB-agarplaat met de verdunningsverhouding.

Herhaal dit driemaal voor elke verdunningsverhouding. Kweek de platen 16 uur lang in een incubator met constante temperatuur van 37 graden Celsius. Selecteer de platen met ongeveer 20 tot 70 volken om te tellen.

Verzamel na de kwantificering van B cereus een milliliter B cereus-medium met één keer 10 tot de negende CFU en centrifugeer gedurende 10 minuten op 8.000 G. Was vervolgens de bacteriecellen twee keer met steriel water door centrifigatie bij 8.000 G gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant. Verdun het geconcentreerde B cereus met steriele normale zoutoplossing tot een eindconcentratie van twee keer 10 tot de achtste CFU per 200 microliter.

Pipetteer de verdunning herhaaldelijk op en neer om een gedispergeerde B cereus-suspensie te verkrijgen. Veeg de buitenkant van de sondenaald af met 70% ethanol en zorg voor de juiste dosistoepassing. Om de muizen in bedwang te houden, pak je ze bij hun staart op en pak je de losse huid van de rug stevig vast met het uiteinde van de staart tussen de laatste twee vingers van de handler.

Houd de muizen in een verticale positie. Steek vervolgens de sondenaald voorzichtig en voorzichtig door de mond in de slokdarm. Dien de B cereus-oplossing toe, trek de naald voorzichtig terug en plaats de muis terug in zijn kooi.

Meet dagelijks het lichaamsgewicht van de muizen en verzamel de ontlastingsmonsters onmiddellijk in een gesteriliseerde centrifugebuis. Bepaal het fecale occulte bloed door ontlasting occult bloedtestpapier. Verzamel 10 milligram ontlastingsmonster op een applicatorstick.

Plaats het preparaat op de testkaart en breng een dun uitstrijkje aan op de kaart. Open de achterflap en breng de ontwikkelaar aan op het uitstrijkje. Bevestig de muizen in rugligging op de operatietafel en open de buikholte.

Scheid de hele dikke darm operatief en meet de lengte met een liniaal. Was vervolgens de dikke darm voorzichtig met een spuit van vijf milliliter gevuld met voorgekoelde PBS. Ontwas en hydrateer de dikke darmsecties.

Kleur vervolgens de dikke darmsecties met hematoxyline en eosine. Laat twee onafhankelijke onderzoekers de histologische scores van het monster onder een lichtmicroscoop evalueren, Hematoxyline- en eosinekleuring onthulde dat het colonweefsel van de muizen van het colitismodel crypteverlies, beschadiging van de bekercel, infiltratie van ontstekingscellen en verlies van epitheel vertoonde. Behandeling met B cereus verbeterde DSS-geïnduceerde histopathologische schade.

De histopathologische scores van colitismuizen waren significant hoger dan in de controlegroep. De histopathologische scores in de B cereus-groep waren echter significant lager dan bij de colitismuizen. Muizen werden willekeurig toegewezen in drie groepen, de scores voor gewichtsverlies, DAI en histopathologie waren hoger en de colonlengte was korter in de ABX/DSS-groep in vergelijking met muizen in de ABX/controlegroep.

Het gewichtsverlies, de lengte van de dikke darm, de DAI-scores en de histopathologiescores waren niet statistisch verschillend tussen de ABX/DSS- en ABX/B cereus plus DSS-groepen. De huidige resultaten suggereren indirect dat de darmmicrobiota een sleutelrol speelt in de positieve effecten van B cereus op colitis. Een van de belangrijkste stappen is het gebruik van Bacillus cereus door middel van de maagsondemethode om de colitismodellering bij muizen te construeren.

De behandeling van Bacillus cereus elimineerde de door DSS geïnduceerde colitis, wat leidde tot een basis voor de vervolgstudie van probiotica voor de behandeling van colitis.