Name: Ter plaatse Hybridisatie gecombineerd met immunohistochemie in cryosectie zebravisembryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Leer in situ hybridisatie gecombineerd met immunohistochemie in cryosectie zebravisembryo's. Deze methode detecteert gelijktijdig mRNA en eiwitexpressie in Danio rerio, wat essentieel is voor onderzoek naar genregulatie in de ontwikkelingsbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Nantong Science and Technology Foundation of China (MS12019011), de Nantong Science and Technology Foundation of China (JC2021058) en de Natural Science Foundation van de Jiangsu Higher Education Institutions (21KJB180009).

Alle dierprotocollen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van Nantong University (nr. S20191210-402).
1. Verzameling zebravisembryo's
<ol><li>Zet de avond voordat de eieren worden verzameld een paar zebravissen in kweekbakken, de ene een transgene zebravis en de andere een AB wild-type zebravis (Tg (foxP2:egfp-caax) X AB wild-type of Tg (hb9:egfp) X AB wild-type) (zie de Tabel met Materialen). Gebruik een diagonale plastic scheidingswand om het mannetje en het vrouwtje te scheiden om fysieke toegang uit te sluiten. Plaats de volgende dag het bovenste deel van de kweektank in een schoon onderste deel gevuld met vers water en verwijder de scheidingswand van de kweektank. Laat de vis 10-20 minuten paren en verzamel de eieren nadat ze naar de bodem van de kweekbak zijn gezonken.</li>
	<li>Kweek de embryo's in E3-embryomedium (zie de tabel met materialen) dat methyleenblauw (1 ml 0,05% methyleenblauw in 1 l E3-embryomedium) bevat bij 28,5 °C.</li>
	<li>Behandel de embryo's 24 uur na de bevruchting (hpf) met fenylthioureum (PTU, zie de tabel met materialen) om pigmentvorming te voorkomen. OPMERKING: Dieren van beide geslachten worden gebruikt in experimenten.</li>
</ol>2. In situ hybridisatie
OPMERKING: Het water dat wordt gebruikt voor de stappen 2.1-2.11 is met diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld water (zie de materiaaltabel).
<ol><li>Fixeer ~10 embryo's met 0,5-1 ml vers 4% paraformaldehyde (PFA, zie de tabel met materialen) in een microfugebuis van 1,5 ml bij 4 °C gedurende 12-14 uur. OPMERKING: Het protocol voor in situ hybridisatie is enigszins gewijzigd ten opzichte van eerder gepubliceerde literatuur12. PFA moet vers worden bereid en bewaard bij 4 °C binnen één week na gebruik of gedurende één maand bij -20 °C. Alle volgende stappen in in situ hybridisatie werden uitgevoerd met behulp van 1,5 ml microfugebuizen.</li>
	<li>Gebruik een pincet om de huid te verwijderen van alleen embryo's ouder dan 48 hpf. OPMERKING: De huid wordt verwijderd om de penetratie van RNA-sondes in het rompgebied van embryo's ouder dan 48 hpf te vergemakkelijken.</li>
	<li>Droog de embryo's geleidelijk uit door te wassen met 25%, 50% en 75% methanol in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 achtereenvolgens (PBST, zie de tabel met materialen) gedurende 5 minuten elk bij kamertemperatuur. Was de embryo's vervolgens gedurende 5 minuten in 100% methanol op kamertemperatuur. Incubeer de embryo's in 100% methanol bij -20 °C gedurende ten minste een nacht gedurende 12-14 uur. OPMERKING: Gedehydrateerde embryo's kunnen gedurende 6 maanden worden bewaard in 100% methanol bij -20 °C.</li>
	<li>Rehydrateer de embryo's geleidelijk door te wassen met 75%, 50% en 25% methanol in PBST gedurende achtereenvolgens gedurende 5 minuten op kamertemperatuur. Was het embryo drie keer met PBST gedurende 5 minuten elk op kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwerk de embryo's met 10 μg/ml proteïnase K (zie de tabel met materialen) in PBST bij kamertemperatuur (zie tabel 1).</li>
	<li>Was de embryo's met PBST gedurende 5 min. Voer deze wasstap drie keer uit.</li>
	<li>Bevestig de gewassen embryo's gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in 4% PFA. OPMERKING: Deze stap stopt de spijsvertering omdat PFA proteïnase K inactiveert. Zorg ervoor dat het monster voorzichtig wordt gemengd om alle embryo's aan PFA bloot te stellen; De buizen kunnen op hun zijkanten worden geplaatst om de embryo's gelijkmatig in de oplossing te verdelen. Deze PFA hoeft niet vers te zijn (het kan tot 2 weken gekoeld worden).</li>
	<li>Was het embryo drie keer met PBST en broed gedurende 5 minuten tijdens elke wasbeurt.</li>
	<li>Voer prehybridisatie van de embryo's uit door te broeden met een prehybridisatieoplossing (preHYB, zie de tabel met materialen) bij 65 °C gedurende 5 minuten. Vervang preHYB door hybridisatieoplossing (HYB, zie de materiaaltabel) en prehybridiseer gedurende ten minste 4 uur in HYB. OPMERKING: Voordat u overgaat tot prehybridisatie, verwarmt u de oplossingen voor op 65 °C. Formamide (zie de tabel met materialen) wordt gebruikt om de vorm en structuur van het weefsel te behouden. Formamide voorkomt ook de binding van niet-homologe fragmenten bij lage temperaturen.</li>
	<li>Verwarm de sonde (Insm1a of 5-HT2C) in HYB gedurende 5 minuten bij 95 °C voordat u deze aan de embryo's toevoegt. Gebruik de sonde met 1 μg/ml HYB. Verwijder zoveel mogelijk preHYB zonder de embryo's in contact te laten komen met de lucht en voeg voorverwarmde sonde in HYB toe aan de buis met de embryo's. OPMERKING: Een gelabelde RNA-sonde kan worden gebruikt om te hybridiseren met een doel-mRNA-sequentie in de embryo's. Daarom kan de sonde worden gebruikt om de expressie van een interessant gen en de locatie van mRNA te detecteren.</li>
	<li>Laat de sonde een nacht (12-14 uur) hybridiseren bij 50-70 °C. OPMERKING: De hybridisatietemperatuur verschilt voor verschillende sondes.</li>
	<li>Zuig de volgende dag de sondeoplossing op met een pipet en bewaar deze in een buis bij -20 °C, zodat deze vele malen kan worden hergebruikt.</li>
	<li>Was de embryo's als volgt:<ol><li>Was de embryo's gedurende 15 minuten met 100% HYB op 65 °C.</li>
		<li>Was de embryo's achtereenvolgens met 75%, 50% en 25% HYB in 2x standaard zoutcitraat met 0,1% Tween-20 (SSCT, zie de tabel met materialen) gedurende 15 minuten elk bij 65 °C.</li>
		<li>Was de embryo's gedurende 15 min in 2x SSCT op 65 °C.</li>
		<li>Was de embryo's gedurende 15 min in 0,2x SSCT op 65 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Was de embryo's twee keer gedurende 10 minuten in maleïnezuurbuffer met 0,02% Tween-20 (MABT, zie de tabel met materialen) op kamertemperatuur.</li>
	<li>Blokkeer de gehybridiseerde en gewassen embryo's gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur met 2% blokkerende oplossing-1 (zie de tabel met materialen).</li>
	<li>Vervang de blokkerende oplossing-1 door antidigoxigenine AP (1:4.000 verdunning, zie de tabel met materialen) in een verse 2% blokkerende oplossing-1 en schud gedurende 12-14 uur gedurende 12-14 uur bij 4 °C.</li>
	<li>Was de embryo's vier keer gedurende 30 minuten in MABT op kamertemperatuur. OPMERKING: Haal de BM purple (zie de Tabel met materialen) uit de koelkast tijdens de derde wasbeurt en schud het af en toe tijdens de volgende wasbeurten.</li>
	<li>Was de embryo's twee keer gedurende 10 minuten in NTMT (0,1 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 1% Tween-20, zie de tabel met materialen).</li>
	<li>Gebruik een pipet om zoveel mogelijk NTMT uit de embryo's te verwijderen. Vervang door BM paars AP-substraat en kleur de embryo's bij kamertemperatuur in het donker. Controleer de kleurveranderingen elke 30 minuten om de mate van verven te regelen. OPMERKING: De specifieke verftijd is anders en moet worden aangepast aan elke sonde. Het incuberen van de embryo's bij 37 °C kan de reactie versnellen. Het incuberen van de embryo's bij 4 °C kan de reactietijd verhogen en kan 's nachts worden gedaan.</li>
	<li>Zodra het in de gewenste mate is ontwikkeld, stopt u de reactie door twee keer kort met NTMT te spoelen. Na in situ hybridisatie, spoel de embryo's driemaal met PBST gedurende 20 minuten.</li>
</ol>3. Inbedding
<ol><li>Dompel de embryo's gedurende 12-14 uur bij 4 °C onder in 5% sucrose in 1x PBS (zie de tabel met materialen).</li>
	<li>Vervang de oplossing die de embryo's bedekt tot 15% sucrose in 1x PBS en incubeer gedurende 12-16 uur bij 4 °C.</li>
	<li>Vervang de oplossing die de embryo's bedekt tot 30% sucrose in 1x PBS en incubeer gedurende 1-2 dagen bij 4 °C. OPMERKING: Incubeer in deze oplossing totdat de embryo's naar de bodem van de buis zinken.</li>
	<li>Vul een cryomold met een optimale snijtemperatuur (OCT) medium (zie de Tabel met materialen). Breng de embryo's in 30% sucrose over naar de cryomold met OCT-medium. Roer ze om de sucrose uit de embryo's te verwijderen.</li>
	<li>Breng de embryo's over naar een nieuwe cryomold voor weefsel en vul deze voorzichtig met OCT-medium, waardoor de vorming van bellen wordt vermeden.</li>
	<li>Dompel elk embryo onder, duw het naar de bodem van de cryomold en plaats elk embryo in de gewenste oriëntatie (dorsaal-ventraal of lateraal). Houd de embryo's in een rechte lijn. OPMERKING: Het wordt sterk aanbevolen om slechts één embryo in elke cryomold te plaatsen (zie de tabel met materialen).</li>
	<li>Plaats de ingebedde embryo's in cryomolden in een droogijs ethanolbad.</li>
	<li>Bewaren bij -80 °C ten minste een nacht gedurende 12-14 uur. OPMERKING: De cryomolden kunnen minstens een maand bij -80 °C worden bewaard.</li>
</ol>4. Cryosectie
<ol><li>Stel de cryosecties met behulp van een cryostaat in op -20 °C.</li>
	<li>Verwijder het monsterblok uit de cryomold en plaats het in de cryostaat. Plaats OCT medium op de bodem van de gekoelde klauwplaat en plaats het blok erop.</li>
	<li>Zorg ervoor dat het monsterblok evenwijdig is aan het scheermesje. Knip voorzichtig overtollig OCT-medium rond het monster af.</li>
	<li>Snijd in 12-20 μm dikke secties met behulp van een cryostaat. Breng de secties snel over naar glazen dia's, zodat elke dia 3-4 secties heeft. Laat de monsters op kamertemperatuur komen en bewaar de secties in een afgesloten schuifdoos bij -80 °C voor later gebruik.</li>
</ol>5. Immunostaining
OPMERKING: GFP-kleuring wordt uitgevoerd op de secties.
<ol><li>Was de dia's met de secties met PBS gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Verwarm de citraatbuffer tot het koken in een magnetron.</li>
	<li>Plaats de dia's in de buffer en blijf verwarmen om de oplossing ongeveer 20 minuten aan de kook te houden. OPMERKING: Deze stap helpt bij het ophalen van antigeen. Het weefsel blijft intact, zelfs bij hoge temperaturen, wat de kleuringskwaliteit verbetert door vouwen, beschadiging of loslating van de weefsels te voorkomen.</li>
	<li>Laat de monsters langzaam afkoelen tot kamertemperatuur voor de volgende stap. Giet de overtollige oplossing af, droog het gebied rond elke sectie voorzichtig met een stuk weefsel en teken een cirkel rond de sectie met een waterafstotende pen (zie de tabel met materialen) om een hydrofobe barrière te vormen. Zorg ervoor dat u de weefselsecties niet droogt.</li>
	<li>Was de dia's twee keer met PBS en broed gedurende 10 minuten tijdens elke wasbeurt.</li>
	<li>Blok gedurende 2 uur in blokkeeroplossing-2 (zie de materiaaltabel) bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Pipetteer primaire antilichaamoplossing (muis monoklonaal α-GFP, 1:250, zie de Tabel met materialen) per dia en incuber de dia's in een immunohistochemische natte doos bij 4 °C gedurende een nacht.</li>
	<li>Was de dia's drie keer met PBS en broed gedurende 10 minuten tijdens elke wasbeurt.</li>
	<li>Laat overtollige PBS aftappen. Incubeer de dia's met het juiste secundaire antilichaam (1:400, zie de materiaaltabel) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in PBS.</li>
	<li>Was de dia's drie keer met PBS en broed gedurende 10 minuten tijdens elke wasbeurt.</li>
	<li>Giet de overtollige PBS af, pipetteer het montagemedium op de dia en monteer met een schuifafdekplaat.</li>
</ol>

<ol><li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+%28Brachydanio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li>
<li>Chen, E., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+genomics+research+model%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a genomics research model.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).</li>
<li>Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li>
<li>Torres, E. The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it">https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it</a> (2018).</li>
<li>Akam, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+location+of+ultrabithorax+transcripts+in+Drosophila+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections.</a> EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).</li>
<li>Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+in+situ+hybridization+method+for+the+detection+of+cellular+RNAs+in+Drosophila+tissue+sections+and+its+application+for+localizing+transcripts+of+the+homeotic+Antennapedia+gene+complex%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex.</a> EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).</li>
<li>Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryos+and+young+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).</li>
<li>Clay, H., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+embryos+using+tyramide+signal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification.</a> Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).</li>
<li>Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+genetic+tools+for+studying+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development.</a> Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).</li>
<li>Cunningham, R. L., Monk, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry+for+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae.</a> Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li>
<li>Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+5-HT%282C%29+receptors+regulate+anxiety-like+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain%2C+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior.</a> Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).</li>
<li>Ferguson, J. L., Shive, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+immunofluorescence+and+immunohistochemistry+on+cryosectioned+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344(2019).</li>
<li>Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+immunohistochemistry+in+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575(2020).</li>
<li>Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+whole-mount+immunohistochemistry+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+embryos+and+larvae+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol.</a> Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).</li>
<li>O'Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Garbage+in%2C+garbage+out%3A+a+critical+evaluation+of+strategies+used+for+validation+of+immunohistochemical+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers.</a> Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dit protocol stelt een combinatie voor van in situ hybridisatie en immunohistochemie, een belangrijke stap in de colokalisatie-experimenten op zebravisembryo's. Deze methode dient als een eenvoudige en efficiënte manier om tegelijkertijd één mRNA en één eiwit te analyseren. In situ hybridisatie en antilichaamkleuring werden uitgevoerd op zebravisembryo's. In tegenstelling tot verschillende protocollen die eerder 14,15,16 werden gepubliceerd,<sup class="xref...

De zebravis is een krachtig gewerveld model voor studies van ontwikkeling en genetica 1,2. Zebravissen en mensen delen een hoge genetische homologie (70% van de genen wordt gedeeld met het menselijk genoom), waardoor het kan worden gebruikt als model voor menselijke ziekten3. Bij zebravissen is het vrij gebruikelijk om de expressiepatronen van twee genen en hun ruimtelijke relatie te detecteren. Immunohistochemie werd voor het eerst gebruikt in 1941 om pathogenen in geïnfecteerde weefsels te detecteren door FITC-gelabelde antilichamen toe te passen4. Het doeleiwit in de weefselsectie wordt eerst gelabeld met een primair antilichaam en de sectie wordt vervolgens gelabeld met een secundair antilichaam tegen de gastheersoort immunoglobuline van het primaire antilichaam. Antilichaamkleuring is een robuuste aanpak om de lokalisatie van eiwitten te detecteren, die een hoge optische resolutie op intracellulair niveau biedt. Het aantal beschikbare antilichamen is echter zeer beperkt bij zebravissen. Een recente studie toont aan dat ongeveer 112.000 antilichamen commercieel beschikbaar zijn voor muizen; Er zijn echter zeer weinig antilichamen aangetoond die betrouwbaar zijn bij zebravissen5.
In plaats daarvan is in zebravissen in situ hybridisatie op grote schaal toegepast voor genexpressiepatroonanalyse. Deze methode werd voor het eerst gebruikt om genexpressie in Drosophila-embryo's te beoordelen in de jaren 19806,7, en sindsdien is deze technologie voortdurend ontwikkeld en verbeterd. Aanvankelijk werden radioactief gelabelde DNA-sondes gebruikt om mRNA-transcripten te detecteren; De ruimtelijke resolutie was echter relatief laag en er waren potentiële gezondheidsrisico's veroorzaakt door de radioactiviteit. Vervolgens is in situ hybridisatie afhankelijk van de RNA-sondes gelabeld met digoxigenine (DIG) of fluoresceïne (Fluo), die worden geconjugeerd tot alkalische fosfatase (AP) of gedetecteerd door fluorescerende tyramidesignaalversterking (TSA)8,9. Hoewel TSA is gebruikt om twee of drie genen te detecteren, zijn DIG-labeling van RNA-sondes en antiDIG AP-geconjugeerd antilichaam nog steeds zeer gevoelige, stabiele en veelgebruikte benaderingen voor in situ hybridisatie. Daarom zijn gecommercialiseerde antilichamen in combinatie met DIG-gelabelde in situ probes nuttig om inzicht te geven in eiwitlokalisatie en expressie van één gen.
Embryo's met hele mounts kunnen de ruimtelijke relatie tussen genen niet onthullen vanwege de lage optische resolutie, ook al zijn zebravisembryo's klein en transparant10. Daarom is sectionering noodzakelijk om de expressiepatronen van genen op intracellulair niveau te analyseren. Cryosectieing is veel gebruikt bij zebravissen omdat het gemakkelijk uit te voeren is en het antigeen effectief kan behouden. Daarom biedt in situ hybridisatie in combinatie met immunohistochemie in cryosecties van zebravissen een krachtige manier om de expressiepatronen van twee genen te analyseren. Een combinatie van in situ hybridisatie en immunohistochemie is toegepast op zebravissen11. Proteïnase K-behandeling werd echter gebruikt om de penetratie van de sonde te verbeteren ten koste van de antigeenintegriteit. Om deze beperking te overwinnen, gebruikt dit protocol verwarming om antigeenopvraging te induceren. Dit protocol is niet alleen van toepassing op embryo's van verschillende stadia en weefselsecties van verschillende diktes (14 μm hoofdsecties en 20 μm ruggenmergsecties), maar het is ook geverifieerd met behulp van genen die tot expressie komen in twee organen, waaronder het hoofd en het ruggenmerg.
Dit artikel beschrijft hoe in situ hybridisatie en antilichaamkleuring in zebravisembryo's in cryosecties kunnen worden gecombineerd. De veelzijdigheid van dit protocol wordt aangetoond door gebruik te maken van een aantal in situ hybridisatie-immunohistochemie combinaties, waaronder in situ hybridisatie probes voor twee verschillende neuronen. Deze methode is geschikt voor het detecteren van mRNA en eiwit in verschillende regio's en embryo's van verschillende leeftijden, evenals de expressiepatronen van twee genen.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 secundair antilichaam</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenine AP Fab-fragmenten</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP antilichaam</td><td>Millipore</td><td>MAB3580</td><td></td></tr><tr><td>Blockingreagens</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>Blockingoplossing-1</td><td>zelf gemaakt</td><td>N/A</td><td>Los het blockingreagens op in 1X MAB tot een uiteindelijke concentratie van 10% (gewicht/volume). Autoclaveer en bewaar bij -20 &#176;C voor gebruik.</td></tr><tr><td>Blockingoplossing-2</td><td>zelf gemaakt</td><td>N/A</td><td>0,1% Triton X-100, 3% BSA, 10% geitenserum in 1x PBS</td></tr><tr><td>BM paars</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td><td>Sigma</td><td>B2064</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Citraatbuffer</td><td>Leagene</td><td>IH0305</td><td></td></tr><tr><td>Citrisch zuur</td><td>Sigma</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold voor weefsel, 15 mm x 15 mm x 5 mm</td><td>Head Biotechnology</td><td>H4566</td><td></td></tr><tr><td>DEPC-behandeld water</td><td>Sangon Biotech</td><td>B501005</td><td></td></tr><tr><td>Digitale camera, fluorescentiemicroscoop</td><td>Nikon</td><td>NI-SSR 931479</td><td></td></tr><tr><td>E3 embryomedium</td><td>zelf gemaakt</td><td>N/A</td><td>5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Invitrogen</td><td>AM9342</td><td></td></tr><tr><td>Geitenserum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Heparine natriumzout</td><td>J&amp;K Scientific</td><td>542858</td><td></td></tr><tr><td>HYB</td><td>zelf gemaakt</td><td>N/A</td><td>preHYB plus 50 &micro;g/mL heparine natriumzout, 100 &micro;g/mL ribonucleïnezuur diethylaminoethanolzout</td></tr><tr><td>Immunohistochemische natte doos</td><td>Mkbio</td><td>MH10002</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Leica messen met laag profiel</td><td>Leica</td><td>819</td><td></td></tr><tr><td>MABT (1x)</td><td>zelf gemaakt</td><td>N/A</td><td>0,1 M maleïnezuur, 0,15 M NaCl, 0,02% Tween-20, pH 7,5</td></tr><tr><td>Maleïnezuur</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J&amp;K Scientific</td><td>116481</td><td></td></tr><tr><td>Methyleenblauw</td><td>Macklin</td><td>M859248</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NTMT</td><td>zelf gemaakt</td><td>N/A</td><td>0,1M Tris-HCl, 0,1M NaCl, 1% Tween-20</td></tr><tr><td>OCT medium</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ADI-950-233</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 4%</td><td>Abbexa</td><td>abx082483</td><td>zelf gemaakt in 1x PBS</td></tr><tr><td>PBST (1x)</td><td>zelf gemaakt</td><td>N/A</td><td>1x PBS plus 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>Fenyltiotreum</td><td>Merck</td><td>103-85-5</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing (10x)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>preHYB</td><td>zelf gemaakt</td><td>N/A</td><td>50% formamide, 5x SSC, 9,2 mM citroenzuur (pH 6,0), 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche</td><td>1092766</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucleïnezuur diethylaminoethanolzout</td><td>Sigma</td><td>R3629</td><td></td></tr><tr><td>RNase-vrije 1,5 mL buisjes</td><td>Ambion</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>SSC (20x)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9770</td><td></td></tr><tr><td>SSCT (0,2x)</td><td>zelf gemaakt</td><td>N/A</td><td>0,2x SSC plus 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>SSCT (1x)</td><td>zelf gemaakt</td><td>N/A</td><td>1x SSC plus 0,1% Tween-20</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Invitrogen</td><td>15503022</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Zebravis</td><td>Laboratory Animal Center of Nantong University</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

ter plaatse hybridisatie gecombineerd met immunohistochemie in cryosectie zebravisembryo's

In Situ Hybridization Combined with Immunohistochemistry in Cryosectioned Zebrafish Embryos

Als gewerveld dier is de zebravis veel gebruikt in biologische studies. Zebravissen en mensen delen een hoge genetische homologie, waardoor het kan worden gebruikt als een model voor menselijke ziekten. Genfunctiestudie is gebaseerd op de detectie van genexpressiepatronen. Hoewel immunohistochemie een krachtige manier biedt om eiwitexpressie te testen, beperkt het beperkte aantal commercieel beschikbare antilichamen in zebravissen de toepassing van costaining. In situ hybridisatie wordt veel gebruikt in zebravisembryo's om mRNA-expressie te detecteren. Dit protocol beschrijft hoe beelden kunnen worden verkregen door in situ hybridisatie en immunohistochemie te combineren voor embryosecties van zebravissen. In situ hybridisatie werd uitgevoerd voorafgaand aan cryosectie, gevolgd door antilichaamkleuring. Immunohistochemie en de beeldvorming van een enkele cryosectie werden uitgevoerd na in situ hybridisatie. Het protocol is nuttig om het expressiepatroon van twee genen te ontrafelen, eerst door in situ transcriptdetectie en vervolgens door immunohistochemie tegen een eiwit in dezelfde sectie.

Dit protocol kan worden gebruikt om tegelijkertijd het expressiepatroon van één mRNA en één eiwit te onderzoeken. Figuur 1 toont de experimentele workflow. De 5-HT2C-receptor is een subtype van de 5-HT-receptor gebonden door de neurotransmitter serotonine (5-hydroxytryptamine, 5-HT). Het is wijd verspreid in het centrale zenuwstelsel (CZS) en kan een verscheidenheid aan hersenfuncties aanzienlijk reguleren, waaronder eetlust, stemming, angst en reproductief gedrag13. ...

Dit protocol beschrijft hoe beelden kunnen worden verkregen door in situ hybridisatie en immunohistochemie van embryonale secties van zebravissen te combineren. In situ hybridisatie werd uitgevoerd voorafgaand aan cryosectie, gevolgd door antilichaamkleuring. Het is nuttig om de expressiepatronen van twee genen in zebravissen te detecteren als er een tekort aan antilichamen is.

Ter plaatse Hybridisatie gecombineerd met immunohistochemie in cryosectie zebravisembryo's

As a vertebrate, the zebrafish has been widely used in biological studies. Zebrafish and humans share high genetic homology, which allows its use as a ...

Dit protocol maakt gebruik van een combinatie van in situ hybridisatie en de immunohistochemie, en het dient als een eenvoudige en efficiënte manier om tegelijkertijd één mRNA en één eiwit te analyseren. Dit protocol is van toepassing op embryo's in verschillende stadia, weefselsecties van verschillende dikte en verschillende organen. Om te beginnen, fixeer ongeveer 10 embryo's met 0,5 tot 1 milliliter vers 4% paraformaldehyde in een microfugebuis van 1,5 milliliter bij vier graden Celsius gedurende 12 tot 14 uur.Droog de embryo's geleidelijk uit door achtereenvolgens vijf minuten op kamertemperatuur te wassen met 25, 50 en 75% methanol in PBST. Was de embryo's vervolgens gedurende vijf minuten in 100% methanol op kamertemperatuur. Incubeer de embryo's in 100% methanol bij min 20 graden Celsius gedurende ten minste een nacht, gedurende 12 tot 14 uur.Rehydrateer de embryo's geleidelijk door te wassen met 75, 50 en 25% methanol in PBST gedurende achtereenvolgens vijf minuten op kamertemperatuur. Nogmaals, was het embryo driemaal met PBST gedurende vijf minuten elk op kamertemperatuur. Verwerk de embryo's met 10 microgram per milliliter proteïnase K in PBST bij kamertemperatuur en was de embryo's driemaal met PBST gedurende vijf minuten.Bevestig vervolgens de gewassen embryo's gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in 4% paraformaldehyde. Nogmaals, was het embryo driemaal met PBST tijdens het incuberen gedurende vijf minuten tijdens elke wasbeurt. Voor het pre-hybridiseren van de embryo's, incubeer ze in pre-hybridisatie-oplossing bij 65 graden Celsius gedurende vijf minuten.Vervang vervolgens de pre-hybridisatieoplossing door de hybridisatieoplossing en pre-hybridiseer gedurende ten minste vier uur. Verwarm de sonde in de hybridisatieoplossing gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius voordat u deze aan de embryo's toevoegt. Verwijder zoveel mogelijk pre-hybridisatie-oplossing zonder de embryo's in contact te laten komen met de lucht.Voeg aan de buis met de embryo's de voorverwarmde sonde toe in de hybridisatieoplossing en laat de sonde gedurende 12 tot 14 uur bij 50 tot 70 graden Celsius een nacht hybridiseren. Zuig de sondeoplossing de volgende dag op met een pipet en bewaar deze in een buis bij min 20 graden Celsius, zodat deze vele malen kan worden hergebruikt. Was de embryo's met 100% hybridisatie-oplossing gevolgd door sequentieel wassen met 75, 50 en 25% hybridisatie-oplossing in tweemaal de concentratie van SSCT gedurende 15 minuten bij 65 graden Celsius.Was vervolgens de embryo's in twee keer en 0,2 keer de concentratie SSCT gedurende 15 minuten bij 65 graden Celsius. Was de embryo's tweemaal gedurende 10 minuten in MABT op kamertemperatuur. Blokkeer de gehybridiseerde en gewassen embryo's gedurende ten minste twee uur bij kamertemperatuur, met 2% blokkerende oplossing-1.Vervang de blokkerende oplossing-1 door antidigoxigenine alkalische fosfatase in een verse 2% blokkerende oplossing-1 en schud een nacht gedurende 12 tot 14 uur bij vier graden Celsius. Was de embryo's vervolgens vier keer in MABT gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Nogmaals, was de embryo's twee keer in NTMT en verwijder zoveel mogelijk NTMT uit de embryo's met behulp van een pipet.Vervang door BM paars alkalisch fosfatasesubstraat en kleur de embryo's bij kamertemperatuur in het donker. Zodra de vlek zich heeft ontwikkeld, stopt u de reactie door twee keer kort te spoelen met NTMT. Na in situ hybridisatie, spoel de embryo's driemaal met PBST gedurende 20 minuten.Dompel de embryo's 's in 5% sucrose in PBS gedurende een nacht van 12 tot 14 uur bij vier graden Celsius. Verander vervolgens de oplossing die de embryo's bedekt tot 15% sucrose in PBS en incuber 's nachts gedurende 12 tot 16 uur bij vier graden Celsius. Nogmaals, verander de oplossing die de embryo's bedekt tot 30% sucrose in PBS en incubeer gedurende één tot twee dagen bij vier graden Celsius.Breng de embryo's over naar een nieuwe cryomold voor weefsel en vul deze voorzichtig met een optimaal snijtemperatuurmedium terwijl de vorming van bellen wordt vermeden. Snijd vervolgens de monsters in 12 tot 20 micrometer dikke secties met behulp van een cryostaat en breng de secties snel over naar glazen dia's. Laat de monsters op kamertemperatuur komen en bewaar de secties in een afgesloten schuifdoos bij min 80 graden Celsius voor later gebruik.Was de dia's met de secties met PBS gedurende vijf minuten. Plaats vervolgens de dia's in de buffer en verwarm de oplossing gedurende ongeveer 20 minuten om deze in de buurt van de kooktemperatuur te houden. Giet de overtollige oplossing af en droog het gebied rond elke sectie voorzichtig af met een stuk weefsel.Teken vervolgens een cirkel rond de sectie met een waterafstotende pen om een hydrofobe barrière te vormen en blokkeer de sectie gedurende twee uur in blokkerende oplossing-2 bij kamertemperatuur. Pipetteer primaire antilichaamoplossing per dia en incubeer de dia's in een immunohistochemische natte doos bij vier graden Celsius gedurende een nacht. Was de dia's drie keer met PBS tijdens het incuberen gedurende 10 minuten tijdens elke wasbeurt en laat de overtollige PBS uitlekken.Incubeer vervolgens de dia's met het juiste secundaire antilichaam gedurende één uur bij kamertemperatuur in PBS. Nogmaals, was de dia's driemaal met PBS tijdens het incuberen gedurende 10 minuten tijdens elke wasbeurt en giet de overtollige PBS af. Vervolgens pipetteer je het montagemedium op de glijbaan en monteer je met een schuifafdekplaat.De expressie van 5-HT2C-receptor in het centrale zenuwstelsel werd gedetecteerd in de transgene foxP2 egfp-caaxlijn. De gelijktijdige expressie van 5-HT2C werd waargenomen in de transgene lijn samen met foxP2-neuronen, die werden gelabeld door fluoresceïnegroen fluorescerend eiwit. De expressie van insm1a, een zinkvingertranscriptiefactor in het ruggenmerg en motorneuronen van de zebravis, werd gedetecteerd in de transgene lijn.De gelijktijdige expressie van insm1a werd waargenomen in de transgene lijn samen met hb9-neuronen, die werden gelabeld door fluoresceïnegroen fluorescerend eiwit. Zebravissen moeten worden gefixeerd met vers bereide paraformaldehyde.

in-situ-hybridization-combined-with-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hele monteren in situ hybridisatie is een van de meest gebruikte technieken in de ontwikkelingsbiologie. Hier presenteren wij een hoge resolutie dubbele fluorescente in situ hybridisatie protocol voor de analyse van de precieze expressiepatroon van een enkel gen en voor het bepalen van de overlap van de expressie-domeinen van twee genen. We nemen een propidiumjodide nucleair anti-vlek weefsel organisatie te markeren.

Zebravis hele Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridisatie

Een snelle manier om immunokleuring van zebravis embryonale hart gedrag wordt beschreven. In vergelijking met de ganse berg immunokleuring aanpak, deze methode verhoogt dramatisch de penetratie van de antilichamen, die het mogelijk maakt het verkrijgen van een hoge resolutie beelden, die cellulaire / subcellulaire structuren openbaren in het hart in een veel lagere verwerkingstijd.

Immunokleuring van ontleed zebravis embryonale hart

De zebravis, een kleine tropische vissen, is uitgegroeid tot een populair model voor het bestuderen van gen-functie tijdens gewervelde ontwikkeling en ziekte. De ruimtelijke en temporele expressie van de doelwitgenen worden...

Hoge resolutie Hele Mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in zebravis embryo&#39;s om genexpressie en functie te bestuderen

De zebravis embryo is een uitstekend model voor ontwikkelingsbiologie onderzoek. Tijdens de embryogenese, zebravissen ontwikkelen met een dooier massa, die driedimensionale uitdagingen voor monster observatie en analyse presenteert. Dit protocol beschrijft hoe twee-dimensionale platte mount voorbereidingen van ganse berg in situ (WISH) gekleurd zebravis embryo exemplaren maken.

Flat Mount Voorbereiding voor observatie en analyse van de zebravis embryo Exemplaren gekleurd door Whole Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Technieken worden beschreven aan fosfo-epitopen geheel zebravis embryo immunostain en voert vervolgens twee kleuren fluorescerende confocale lokalisatie in cellulaire structuren zo klein als primaire cilia. De technieken voor de vaststelling en beeldvorming kan de locatie en de kinetiek van het uiterlijk of interactie met specifieke eiwitten te bepalen.

Immunokleuring Phospho-epitopen in gecilieerde Organen van Whole Mount zebravis embryo&#39;s

Cilia ontwikkeling is essentieel voor goede organogenese. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te etiketteren en ciliated cellen van de zebravis visualiseren.

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

Dit protocol toont sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op cryosecties van in het beginstadium zebravis-embryo's die precieze colokalisatie analyses in specifieke celpopulaties mogelijk maken.

Sequentiële immunofluorescentie en immunohistochemie op Gecryode zebravis-embryo's

Genbewerkingstechnologieën hebben onderzoekers in staat gesteld om zebravissen mutanten te genereren om de genfunctie relatief eenvoudig te onderzoeken. Hier bieden we een gids voor het uitvoeren van parallelle embryogenotypering en kwantificering van in situ hybridisatiesignalen bij zebravissen. Deze onbevooroordeelde aanpak zorgt voor een grotere nauwkeurigheid in fenotypische analyses op basis van in situ hybridisatie.

Genotyping en kwantificering van In Situ Hybridization Kleuring in Zebrafish

Hier presenteren we een protocol voor fluorescerende antilichaamgemedieerde detectie van eiwitten in hele preparaten van zebravissen embryo's en larven.

Hele mount immunohistochemie in zebravissen embryo's en larven

De zebravis is een belangrijk model voor het begrijpen van de nierontwikkeling. Hier wordt een in situ hybridisatieprotocol geoptimaliseerd om genexpressie in zebravislarven en juvenielen te detecteren tijdens de ontwikkeling van mesonephros.

In situ Hybridisatie in zebravislarven en juvenielen tijdens mesonephrosontwikkeling

Leer in situ hybridisatie gecombineerd met immunohistochemie in cryosectie zebravisembryo's. Deze methode detecteert gelijktijdig mRNA en eiwitexpressie in Danio rerio, wat essentieel is voor onderzoek naar genregulatie in de ontwikkelingsbiologie.

Ter plaatse Hybridisatie gecombineerd met immunohistochemie in cryosectie zebravisembryo's

Meer video's verkennen