Name: Generatie van mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel en hun differentiatie in de skeletspierlijn (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Leer het isoleren van mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel en hun differentiatie naar skeletspierlijn. Deze methode garandeert hoge celviabiliteit met minimale endotheliale contaminatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken de heer Ojas Tikoo voor hun hulp bij het filmen en videoproductie. We erkennen ook de hulp die is ontvangen van het GARBH-Ini (Interdisciplinary Group on Advanced Research and Birth Outcome-DBT India) personeel, verpleegkundigen en senior onderzoeksfunctionarissen in het Gurugram Civil Hospital en Dr. Pallavi Kshetrapal voor hulp bij logistiek. Dit werk werd ondersteund door subsidies toegekend aan Suchitra Gopinath van het Department of Biotechnology, India (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).

Het gebruik van navelstrengweefsel in deze studie werd goedgekeurd door de Institutional Committee for Stem Cell Research (IC-SCR), de Institutional Ethics Committee, Translational Health Science and Technology Institute (IEC-THSTI), de Institutional Ethics Committee of Civil Hospital, Gurugram, Haryana en de Institutional Biosafety Committee, THSTI. Menselijke navelstrengweefselmonsters werden geoogst van termijnbevallingen op het moment van geboorte. Geïnformeerde schriftelijke toestemming werd verkregen van proefpersonen. Alle methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften.
1. Isolatie van MSC's uit navelstrengweefsel
<ol><li>Snijd op het moment van levering ten minste 5 cm koord door, bij voorkeur dichter bij de placenta, en steriliseer het koord door het buitenoppervlak af te vegen met 70% ethanol. Breng het stuk navelstrengweefsel sequentieel over van de ene verzamelbuis van 50 ml met fosfaatbuffered zoutoplossing (PBS) naar een andere buis met dezelfde. Transporteer de verzamelbuis met de naam van de proefpersoon op ijs binnen 1 uur naar het laboratorium. OPMERKING: Voor een groter onderzoek kan het nuttig zijn om de monsters van een streepjescode te voorzien om hun tracking gedurende het hele onderzoek mogelijk te maken. Belangrijk is dat al het personeel dat menselijke weefsels behandelt, het volledige regime van het hepatitis B-vaccin moet krijgen.</li>
	<li>Schakel in het laboratorium de UV gedurende 25 minuten in de BSL-2-kap in om geautoclaveerde instrumenten en pipetten vóór gebruik te steriliseren.</li>
	<li>Breng het navelstrengweefselstuk over van de verzamelbuis naar een metweefselkweek behandelde schaal van 10 cm 2 met PBS verrijkt met 5 g/L glucose, 50 μg/ml gentamicine, 2,5 μg/ml amfotericine B, 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine (schematisch in figuur 1).</li>
	<li>Snijd met behulp van een scalpel het koordweefsel verticaal langs de lengteas om twee halve cilindrische stukken te verkrijgen. Vanwege koordtorsie en het slijmvliesoppervlak, pint u het weefsel vast met een tang in de andere hand.</li>
	<li>Observeer op dit punt de navelstrengslagaders en ader en verwijder de bloedvaten door een scalpel te gebruiken om ze in één richting van het oppervlak af te schrapen. Spoel het navelstrengweefsel nogmaals in PBS om al het resterende bloed dat geassocieerd is met het weefsel te verwijderen. Zorg ervoor dat het schrapen zacht is om de integriteit van cellen in de WJ rond de vaten te behouden.</li>
	<li>Gehakt elke helft van het koordweefsel in fragmenten van 0,5 cm3 formaat en plaats de fragmenten met het luminale oppervlak naar beneden gericht op de schaal. Incubeer het gerecht kort gedurende 10 minuten in een bevochtigde kamer van 37 °C met 5% CO2.</li>
	<li>Na incubatie overspoelt u de schaal met de stukjes na het navelstrengweefsel met 20 ml medium dat MEM Alpha Modification bevat zonder L-glutamine, ribo- en deoxyribonucleosiden, 15% foetaal runderserum (niet warmte-geïnactiveerd) en 50 μg / ml gentamycine. Voeg het groeimedium voorzichtig langs de zijkanten toe om te voorkomen dat de weefselexplantaten uit hun oriëntatie worden losgemaakt. Voeg overtollig medium toe om rekening te houden met een fractie die tijdens de incubatie door de weefselexplantaten zal worden opgezogen.</li>
	<li>Voeg na 3 dagen incubatie vers medium toe aan de culturen. Zorg ervoor dat de culturen worden beschermd tegen schokken en beweging van de explantaten tijdens het hanteren van de gerechten.</li>
	<li>Verwijder na 1 week de weefselfragmenten afzonderlijk met behulp van een steriele tang en gooi ze weg met geschikte biohazard-zakken voor verwijdering. Behoud het bestaande medium en voeg 10 ml vers groeimedium toe. Vervang het groeimedium om de 4 dagen totdat individuele kolonies een samenvloeiing van 70% bereiken. OPMERKING: Het is waarschijnlijk dat de cellen niet gelijkmatig over het gerecht worden verdeeld, omdat er individuele proliferatieve kolonies zullen zijn die met de tijd moeten worden gecontroleerd op samenvloeiing. Over het algemeen genereert een schaal van 10 cm2 binnen een maand voldoende cellen om in een aparte schaal te worden gesplitst.</li>
	<li>Oogst de aanhangende cellen met behulp van trypsine/EDTA-oplossing (1x 0,25% trypsine en 0,02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution [HBSS]). Centrifugeer de celsuspensie bij 470 × g gedurende 5 minuten bij 25 °C en resuspenseer de celpellet in groeimedium.</li>
</ol>2. Immunofenotypering en vermeerdering van uMSCS
<ol><li>Ga verder met immunofenotypering zodra de aanhangende cellen 50% -60% confluence hebben bereikt en goed verspreid zijn. Voer geen MSC-markeranalyse uit op volledig confluente culturen, omdat dit de neiging heeft om downregulatie van belangrijke MSC-markers te veroorzaken.</li>
	<li>Verdeel na trypsinisatie een celsuspensie van 1 × 106 cellen /ml in FACS-buizen (1 × 105 cellen / buis) en kleur met geschikte fluorofoor-gekoppelde antilichamen (alle 1:50 verdunning) in combinatie: niet-gekleurd; CD105 + CD90; CD105 + CD73; cd105; CD90; cd73; CD34 + CD45 (gewone fluorofoor); isotype controles voor elke fluorofoor. Noteer een totaal aantal gebeurtenissen van ten minste 10.000 op de flowcytometer voor verdere analyse. OPMERKING: Aangezien de cellen voor elke oppervlaktemarker afzonderlijk worden geanalyseerd, is gating op celsubsets niet vereist.</li>
	<li>Bevestig naast de bovenstaande markers de aanwezigheid van positieve en negatieve oppervlaktemarkers in uMSC-lijnen die zijn gemaakt van individuele navelstrengweefselmonsters (tabel 1).</li>
	<li>Analyseer de gelabelde cellen door flowcytometrie en bepaal het percentage CD105+CD90+ en CD105+CD73+ cellen. Analyseer CD105+ en CD34−CD45− cellen afzonderlijk.</li>
</ol>3. Differentiatie van uMSCs in skeletspieren
<ol><li>Coat weefselkweekplaten met 0,01% collageen en 20 μg/ml laminine in PBS. Bekleed deze platen minimaal 4 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Plaat uMSCs met een dichtheid van 10.000 cellen/cm2 in groeimedium.</li>
	<li>Wanneer de cellen voor 70% samenvloeien, adem dan het groeimedium op en spoel de culturen 2x met PBS. Voeg myogeen differentiatiemedium (M1) bestaande uit DMEM + 5% paardenserum + 0,1 μM dexamethason + 50 μM hydrocortison toe aan de uMSCs. Voor het bepalen van de kinetiek van myogene progressie, voeg M1 medium om de andere dag toe aan de culturen.</li>
	<li>Om de kinetiek van myogene progressie te bepalen, analyseert u uMSCs voor Pax7, MyoD, Myogenin en MyHC-expressie na respectievelijk 2 dagen, 4-5 dagen, 6-7 dagen en 10-14 dagen.</li>
</ol>

<ol><li>Kuroda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+multipotent+cells+in+adult+human+mesenchymal+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).</li>
<li>Troyer, D. L., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wharton%27s+jelly-derived+cells+are+a+primitive+stromal+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population.</a> Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).</li>
<li>Karahuseyinoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+stem+cells+in+human+umbilical+cord+stroma%3A+In+situ+and+in+vitro+surveys%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys.</a> Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).</li>
<li>Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mesenchymal+stem+cells+from+the+sub-amniotic+human+umbilical+cord+lining+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane.</a> Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).</li>
<li>Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+umbilical+cord+perivascular+%28HUCPV%29+cells%3A+A+source+of+mesenchymal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors.</a> Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).</li>
<li>Mishra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Umbilical+cord+tissue+is+a+robust+source+for+mesenchymal+stem+cells+with+enhanced+myogenic+differentiation+potential+compared+to+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18978(2020).</li>
<li>Lu, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+with+hematopoiesis-supportive+function+and+other+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials.</a> Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).</li>
<li>Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+to+isolate+mesenchymal-like+cells+from+Wharton%27s+Jelly+of+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord.</a> Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).</li>
<li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+optimal+culture+conditions+for+clinical+scale+production+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).</li>
<li>Yoon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+explant-derived+and+enzymatic+digestion-derived+MSCs+and+the+growth+factors+from+Wharton%27s+jelly%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly.</a> BioMed Research International. 2013, 428726(2013).</li>
<li>Ishige, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+arterial%2C+venous%2C+and+Wharton%27s+jelly+explants+of+human+umbilical+cord%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord.</a> International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).</li>
<li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+to+muscle+fiber+to+model+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Kritieke stappen Een cruciale stap in dit protocol is het verzamelen van weefsel onder aseptische omstandigheden, vanaf het moment van levering tot het onderhoud van steriele culturen, voor de gehele duur van de vermeerdering. Tijdens het verzamelen van het snoer is het essentieel dat het snoer geen niet-gesteriliseerd oppervlak raakt en extern wordt afgeveegd met 70% ethanol voordat het wordt verzameld in buizen met PBS aangevuld met antibiotica. Het is belangrijk om de tijd tussen het verzamelen van...

De menselijke navelstreng is gecrediteerd om een robuust reservoir van mesenchymale stamcellen te bezitten, die momenteel worden onderzocht voor regeneratieve therapieën vanwege hun robuuste proliferatie- en differentiatiesnelheden, immunomodulerende eigenschappen en het vermogen om cellen te genereren uit alle drie de kiemlagen1. Het navelstrengweefsel bestaat uit meerdere compartimenten zoals het navelstrengbloed, het navelstrengsubendotheel en de Wharton's jelly (WJ), die op zichzelf drie onduidelijke regio's omvat- de perivasculaire zone, de intervasculaire zone en de subamnion of de koordvoering (CL)2. Hoewel uMSC's kunnen worden geïsoleerd van al deze verschillende regio's en in grote lijnen belangrijke MSC-markers kunnen uitdrukken, is er geen duidelijkheid over de vraag of deze compartimenten dezelfde populatie uMSC's bevatten of verschillen vertonen in hun differentiatiepotenties3. Daarom vereisen protocollen voor de isolatie van uMSCs een grotere precisie in hun modus en regio van isolatie, de robuuste karakterisering van differentiatiepotentialen en ten slotte een vergelijkende analyse van verschillende compartimenten van het snoer. 
In deze context hebben weinig studies verschillen aangetoond in uMSC proliferatieve en differentiatieve potentialen tussen verschillende delen van het koord. Hiervan onthulden vergelijkende analyses tussen uMSCs geïsoleerd van de CL- en WJ-regio's een groter proliferatief potentieel in CL-afgeleide uMSCs 3,4. In een afzonderlijke studie presteerden WJ-afgeleide uMSCs beter in proliferatietests in vergelijking met perivasculaire cellen (HUCPV)5. Bij het onderzoeken van verschillen tussen van navelstrengbloed afgeleide uMSCs en van navelstrengweefsel afgeleide uMSCs zonder vasculaire besmetting, werd differentiële expressie van belangrijke MSC-markers gemeld tussen de twee compartimenten, evenals verhoogde proliferatiesnelheden in van navelstrengweefsel afgeleide uMSCs6.
Van de verschillende studies die de differentiatiemogelijkheden van uMSCs onderzoeken, voornamelijk in weefsels van de mesoderm-afstamming, zoals osteogene, adipogene en chondrogene afstammingslijnen, hebben er maar heel weinig gedetailleerde protocollen opgeleverd voor myogene differentiatie en daaropvolgende karakterisering, evenals vergelijkende analyses tussen verschillende koordcompartimenten. In deze context hebben we een robuust spierdifferentiatieprotocol ontwikkeld en waargenomen dat van navelstrengweefsel afgeleide uMSCs superieure myogene differentiatiemogelijkheden vertonen in vergelijking met navelstrengbloed6. Hier wordt een stapsgewijs protocol beschreven voor de isolatie van uMSCs van het hele navelstrengweefsel zonder cellen geassocieerd met de vasculatuur, hun karakterisering en hun differentiatie in de myogene afstamming.

<table><tbody><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2411</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic oplossing 100x Vloeibaar, endotoxine getest (10.000 U Penicilline en 10 mg Streptomycine/mL in 0,9% normale zoutoplossing)</td><td>HiMedia</td><td>A001A-50mL</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH antilichaam</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MyHC antilichaam (My32)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-50401AF647</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MyoD antilichaam (5.8A)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56511</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myogeen antilichaam (Clone F5D)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34616AF594</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Pax7 antilichaam</td><td>DSHB</td><td>DSHB-C1-576</td><td></td></tr><tr><td>APC Muis anti-menselijk CD90 klon 5E10</td><td>BD Biosciences</td><td>559869</td><td></td></tr><tr><td>Collageen Type 1</td><td>Merck</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>D (+) Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>SIGMA</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II of FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foetaal Runderserum, gekwalificeerd Brazilië</td><td>GIBCO</td><td>10270106</td><td>niet te verhitten</td></tr><tr><td>FITC Muis anti-menselijk CD106 klon 51-10C9</td><td>BD Biosciences</td><td>551146</td><td></td></tr><tr><td>FITC Muis anti-menselijk CD14 klon M5E2</td><td>BD Biosciences</td><td>557153</td><td></td></tr><tr><td>FITC Muis anti-menselijk CD31 klon WM59</td><td>BD Biosciences</td><td>557508</td><td></td></tr><tr><td>FITC Muis anti-menselijk CD34 klon 581</td><td>BD Biosciences</td><td>555821</td><td></td></tr><tr><td>FITC Muis anti-menselijk CD45 klon HI30</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td></td></tr><tr><td>FITC Muis anti-menselijk CD49D klon 9F10</td><td>BD Biosciences</td><td>560840</td><td></td></tr><tr><td>FITC Muis anti-menselijk CD90 klon 5E10</td><td>BD Biosciences</td><td>555595</td><td></td></tr><tr><td>FITC Muis anti-menselijk HLA-A,B,C klon G46-2.6</td><td>BD Biosciences</td><td>557348</td><td></td></tr><tr><td>FITC Muis anti-menselijk IgG klon G18-145</td><td>BD Biosciences</td><td>555786</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1264</td><td></td></tr><tr><td>Paarden serum</td><td>HiMedia</td><td>RM1239</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Merck</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha Modificatie zonder L-glutamine, ribo- en deoxyribonucleoside</td><td>Hyclone</td><td>SH30568.FS</td><td>Basismedium voor uMSCs</td></tr><tr><td>PE Muis anti-menselijk CD105 klon 266</td><td>BD Biosciences</td><td>560839</td><td></td></tr><tr><td>PE Muis anti-menselijk CD44 klon 515</td><td>BD Biosciences</td><td>550989</td><td></td></tr><tr><td>PE Muis anti-menselijk CD49E klon llA1</td><td>BD Biosciences</td><td>555617</td><td></td></tr><tr><td>PE Muis anti-menselijk IgG klon G18-145</td><td>BD Biosciences</td><td>555787</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy7 Muis anti-menselijk CD73 KLON AD2</td><td>BD Biosciences</td><td>561258</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH=7,4</td><td>HiMedia</td><td>M1866</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine/EDTA oplossing (1x 0,25% Trypsine en 0,02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>HiMedia</td><td>TCL049-100mL</td><td></td></tr></tbody></table>

generatie van mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel en hun differentiatie in de skeletspierlijn

Generation of Mesenchymal Stem Cells from Human Umbilical Cord Tissue and their Differentiation into the Skeletal Muscle Lineage

Het verkennen van het therapeutisch potentieel van mesenchymale stamcellen is afhankelijk van het gemak van isolatie, de potentie voor differentiatie en de betrouwbaarheid en robuustheid van de bron. We beschrijven hier een stapsgewijs protocol voor de isolatie van mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel (uMSCs), hun immunofenotypering en de voortplanting van dergelijke culturen over verschillende passages. In deze procedure is de levensvatbaarheid van de uMSCs hoog omdat er geen enzymatische spijsvertering is. Verder zorgt het verwijderen van bloedvaten, inclusief de navelstrengslagaders en de ader, ervoor dat er geen besmetting is van cellen van endotheeloorsprong. Met behulp van flowcytometrie zijn uMSCs bij isolatie CD45−CD34−, wat wijst op een afwezigheid van cellen uit de hematopoietische afstamming. Belangrijk is dat ze belangrijke oppervlaktemarkeringen uitdrukken, CD105, CD90 en CD73. Bij het vaststellen van culturen beschrijft dit artikel een efficiënte methode om differentiatie in deze uMSCs in de skeletspierlijn te induceren. Een gedetailleerde analyse van myogene progressie in gedifferentieerde uMSCs onthult dat uMSCs Pax7 uitdrukken, een marker voor myogene voorlopers in de beginfase van differentiatie, gevolgd door de expressie van MyoD en Myf5, en ten slotte een terminale differentiatiemarker, myosine heavy chain (MyHC).

Het succes van isolatie van uMSCs uit navelstrengweefsel is >95%, in tegenstelling tot de slechte succespercentages van vol navelstrengbloed. Na succesvolle isolatie van uMSCs onthult FACS-analyse dat alle cellen CD34−CD45−CD105+CD90+ zijn. In vergelijkende analyse vertonen uMSCs geïsoleerd uit navelstrengbloed echter heterogene populaties, waarbij een deel van de cellen CD34 + CD45 + CD105 + (~ 15%) vertoont. Bovendien zijn dubbel-positieve CD1...

We beschrijven een protocol voor de isolatie van mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel en hun differentiatie in de skeletspierlijn.

Generatie van mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel en hun differentiatie in de skeletspierlijn

Exploring the therapeutic potential of mesenchymal stem cells is contingent upon the ease of isolation, potency toward differentiation, and the ...

We beschrijven ons protocol om mesenchymale stamcellen te isoleren van menselijk navelstrengweefsel en een robuuste methode om ze te differentiëren in skeletspierlijn. Deze techniek stelt ons in staat om mesenchymale stamcellen te isoleren die een hoge levensvatbaarheid en warmte bezitten, met weinig tot geen besmetting van cellen van endotheeloorsprong en om myogene differentiatie efficiënt te induceren bij deze ziekten. Koordtorsie en mucoid consistentie maken het moeilijk om het snoer te hanteren.We laten zien hoe je het koord verwerkt, om de gelei van de Wharton niet af te schrapen en endotheelcellen uit te sluiten van de populatie. Nadat u het navelstrengweefsel op het tijdstip van levering hebt verzameld, brengt u het navelstrengweefselstuk over van de verzamelbuis naar een met weefselkweek behandelde schaal van 10 vierkante centimeter en wast u het weefsel grondig met verse PBS. Om voor de torsie van het koord en het slijmvliesoppervlak te zorgen, pint u het weefsel vast met een tang in één hand.Snijd met behulp van een scalpel het koordweefsel verticaal langs de longitudinale toegang om twee halve cilindrische stukken te verkrijgen. Observeer op dit punt de navelstrengslagaders en aderen. Verwijder met behulp van een scalpel de bloedvaten door ze in één richting van het oppervlak af te schrapen en spoel het navelstrengweefsel in PBS om al het resterende bloed dat verband houdt met het weefsel te verwijderen.Gehakt elke helft van het navelstrengweefsel in fragmenten van 0,5 kubieke centimeter. Leg de fragmenten met het luminale oppervlak naar beneden gericht op de schaal en incubeer de schaal kort gedurende 10 minuten. Voeg aan het einde van de incubatie voorzichtig 20 milliliter medium met MEM Alpha-modificatie toe langs de zijkanten van de schaal die het navelstrengweefsel bevat.Zorg ervoor dat de explantaten niet loskomen van hun oriëntatie en voeg overtollig medium toe om rekening te houden met een fractie die de weefselexplantaten tijdens de incubatie zullen opnemen. Plaats het gerecht vervolgens drie dagen in de couveuse. Voeg na het einde van de incubatie vers medium toe aan de cultuur en zorg ervoor dat de culturen worden beschermd tegen schokken en beweging van de explantaten tijdens het hanteren van de gerechten.Verwijder na een week, met behulp van een steriele tang, de weefselfragmenten afzonderlijk en gooi ze weg met behulp van geschikte biohazard-zakken voor verwijdering. Behoud het bestaande medium en voeg 10 milliliter vers groeimedium toe. Vervang het groeimedium om de vier dagen totdat individuele kolonies een samenvloeiing van 70% bereiken Na het kleuren van de cellen zoals beschreven in het manuscript, analyseert u de gelabelde cellen door flowcytometrie en bepaalt u het percentage CD105 CD90-positieve en CD105 CD73-positieve cellen.Analyseer CD105 positieve en CD34 CD45 negatieve cellen afzonderlijk. Bedek de weefselkweekplaat met 0,01% collageen en 20 microgram per milliliter laminine in PBS en plaats het minimaal vier uur op de rocker bij kamertemperatuur. Verwijder na de incubatie het collageen en was de plaat met PBS en plaats vervolgens uMSCs met een dichtheid van 10.000 cellen per vierkante centimeter in het groeimedium.Zodra de cellen 70% samenvloeiing bereiken, aspirateer het groeimedium en spoel de kweekplaat tweemaal met PBS. Om de kinetiek van myogene progressie te bepalen, voegt u om de dag M1-medium toe aan de culturen en analyseert u uMSCs voor de expressie van pax7, MyoD, myogenine en myosine zware keten op respectievelijk twee dagen, vier tot vijf dagen, zes tot zeven dagen en tien tot veertien dagen. uMSCs geven de expressie van CD105 en CD90 weer en drukken geen hematopoëtische markers CD34 en CD45 uit.De uMSC's waren ook positief voor de expressie van uMSCs-marker CD73, wat aangeeft dat de uMSCs meerdere sleutelmarkers uitdrukten. uMSCs vertoonden expressie van pax7 binnen de eerste twee dagen na de toevoeging van M1, gevolgd door MyoD-expressie binnen de eerste vier dagen van M1-toevoeging. Cellen drukken myogenine-eiwit uit na zes dagen differentiatie, gevolgd door de expressie van myosine zware keten tussen 10 dagen en 14 dagen na de inductie van differentiatie.970 genen werden geupreguleerd als reactie op de inductie van myogene differentiatie in vergelijking met de ongedifferentieerde uMSCs. Meer myogene genen werden upreguleerd in van navelstrengweefsel afgeleide uMSCs in vergelijking met van navelstrengbloed afgeleide uMSCs. Zowel navelstrengweefsel als navelstrengbloed vertoonden upregulatie van genen gerelateerd aan cytoskeletale eiwitten, geassocieerd met actinebinding en sarcomeerassemblage, transporters geassocieerd met contractiele functie, spiermassaonderhoud, calciumsignalering en enzymatische functie.Verzamel het weefsel onder aseptische conditie en behoud steriele cultuur. Het snoer moet uitwendig worden geveegd met 70% ethanol en zo snel mogelijk worden verwerkt. Veel regeneratieve therapieën vereisen grote aantallen cellen uit vroege passages.Het kan ook worden gebruikt als een model om de hele droge omgeving na te bootsen en het postnatale metabolisme te weerspiegelen.

generation-mesenchymal-stem-cells-from-human-umbilical-cord-tissue

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit protocol beschrijft de isolatie en de daaropvolgende expansie van mesenchymale stromale cellen en endotheelcellen kolonievormende cellen zonder het gebruik van dierlijke serum op autologe paren te genereren voor experimentele transplantatie doeleinden.

Isolatie en dierlijk serum vrije expansie van de mens navelstreng Afgeleid Mesenchymale stromale cellen (MSC&#39;s) en Endotheliale Colony Forming progenitor cellen (ECFCs)

Het isoleren van volwassen stamcellen uit spier-en zachte weefsels op basis van de cel naleving snelheid kolf.

Het isoleren van stamcellen uit Soft musculoskeletale weefsels

Bloedvaten in de menselijke skeletspier haven diverse multi-lineage voorloper populaties die ideaal is voor regeneratieve toepassingen zijn. Deze isolatie methode maakt gelijktijdige zuivering van drie multipotente precursor celpopulaties respectievelijk uit drie structurele lagen van de bloedvaten: myogene endotheelcellen van de intima, pericytes van media en adventitia cellen van adventitia.

Isolatie van bloedvatgeassocieerde afgeleid Multipotente Voorlopers van Human Skeletal Muscle

Hier beschrijven we een protocol gebaseerd op epigenetische herprogrammering van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) in de richting van het genereren van een homogene populatie van de skeletspieren voorlopers die onder permissieve cultuur omstandigheden vormen driedimensionale clusters van samentrekkende spiervezels (myospheres), die biologische kenmerken van de menselijke recapituleren skeletspieren.

Generatie Myospheres Van hESCs door Epigenetische herprogrammeren

Hier presenteren we een protocol voor de ontleding van menselijke navelstreng (UC) en foetale placenta monster in koord bekleding (CL), Wharton's gelei (WJ), cord-placenta junctie (CPJ) en foetale placenta (FP) voor het isoleren en karakterisering van mesenchymale stromale cellen (MSC's) met de explantaatkweek techniek.

Isolatie en karakterisering van mesenchymale stromale cellen uit menselijke navelstreng en foetale Placenta

Hier presenteren we een methode voor het efficiënt benutten van het potentieel van de cardiale differentiatie van jonge bronnen van menselijke mesenchymale stamcellen om te genereren van functionele, aanbestedende, cardiomyocyte-achtige cellen in vitro.

In Vitro Differentiatie van menselijke mesenchymale stamcellen in functionele Cardiomyocyte-achtige cellen

Hier stellen wij een protocol voor chondrogenische differentiatie voor van bloedbloedmononucleaire cellen afgeleide door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen.

Chondrogenische Pelletvorming van Koord Bloed afgeleide geïnduceerde Pluripotente Stamcellen

Menselijke navelstreng (UC) kan worden verkregen in de perinatale periode als gevolg van premature, termijn en postterm levering. In dit protocol beschrijven we de isolatie en de karakterisering van UC-afgeleide mesenchymale stamcellen (UC-MSCs) uit foetussen/zuigelingen op 19-40 weken van de dracht.

Isolatie en karakterisatie van menselijke navelstreng afkomstige mesenchymale stamcellen van vroeggeboorte en termijn zuigelingen

Wij stellen voor een protocol dat laat zien hoe geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige keratinocyten en fibroblasten differentiëren en genereren een 3D huid organoid, met behulp van deze keratinocyten en fibroblasten. Dit protocol bevat een extra stap van het genereren van een gehumaniseerd muizen model. De techniek die hier gepresenteerd zal dermatologische onderzoek verbeteren.

Generatie van 3D huid Organoid van koord bloed afkomstige geïnduceerde pluripotente stamcellen

Dit protocol beschrijft en vergelijkt twee representatieve methoden voor het differentiëren van hiPSC's in mesenchymale stromale cellen (MSC's). De monolaagmethode wordt gekenmerkt door lagere kosten, eenvoudigere bediening en gemakkelijkere osteogene differentiatie. De embryoïde lichamen (EB's) methode wordt gekenmerkt door een lager tijdsverbruik.

Vergelijking van twee representatieve methoden voor differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen in mesenchymale stromale cellen

Leer het isoleren van mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel en hun differentiatie naar skeletspierlijn. Deze methode garandeert hoge celviabiliteit met minimale endotheliale contaminatie.

Generatie van mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel en hun differentiatie in de skeletspierlijn

Meer video's verkennen