Generatie van mesenchymale stamcellen uit menselijk navelstrengweefsel en hun differentiatie in de skeletspierlijn

We beschrijven ons protocol om mesenchymale stamcellen te isoleren van menselijk navelstrengweefsel en een robuuste methode om ze te differentiëren in skeletspierlijn. Deze techniek stelt ons in staat om mesenchymale stamcellen te isoleren die een hoge levensvatbaarheid en warmte bezitten, met weinig tot geen besmetting van cellen van endotheeloorsprong en om myogene differentiatie efficiënt te induceren bij deze ziekten. Koordtorsie en mucoid consistentie maken het moeilijk om het snoer te hanteren.

We laten zien hoe je het koord verwerkt, om de gelei van de Wharton niet af te schrapen en endotheelcellen uit te sluiten van de populatie. Nadat u het navelstrengweefsel op het tijdstip van levering hebt verzameld, brengt u het navelstrengweefselstuk over van de verzamelbuis naar een met weefselkweek behandelde schaal van 10 vierkante centimeter en wast u het weefsel grondig met verse PBS. Om voor de torsie van het koord en het slijmvliesoppervlak te zorgen, pint u het weefsel vast met een tang in één hand.

Snijd met behulp van een scalpel het koordweefsel verticaal langs de longitudinale toegang om twee halve cilindrische stukken te verkrijgen. Observeer op dit punt de navelstrengslagaders en aderen. Verwijder met behulp van een scalpel de bloedvaten door ze in één richting van het oppervlak af te schrapen en spoel het navelstrengweefsel in PBS om al het resterende bloed dat verband houdt met het weefsel te verwijderen.

Gehakt elke helft van het navelstrengweefsel in fragmenten van 0,5 kubieke centimeter. Leg de fragmenten met het luminale oppervlak naar beneden gericht op de schaal en incubeer de schaal kort gedurende 10 minuten. Voeg aan het einde van de incubatie voorzichtig 20 milliliter medium met MEM Alpha-modificatie toe langs de zijkanten van de schaal die het navelstrengweefsel bevat.

Zorg ervoor dat de explantaten niet loskomen van hun oriëntatie en voeg overtollig medium toe om rekening te houden met een fractie die de weefselexplantaten tijdens de incubatie zullen opnemen. Plaats het gerecht vervolgens drie dagen in de couveuse. Voeg na het einde van de incubatie vers medium toe aan de cultuur en zorg ervoor dat de culturen worden beschermd tegen schokken en beweging van de explantaten tijdens het hanteren van de gerechten.

Verwijder na een week, met behulp van een steriele tang, de weefselfragmenten afzonderlijk en gooi ze weg met behulp van geschikte biohazard-zakken voor verwijdering. Behoud het bestaande medium en voeg 10 milliliter vers groeimedium toe. Vervang het groeimedium om de vier dagen totdat individuele kolonies een samenvloeiing van 70% bereiken Na het kleuren van de cellen zoals beschreven in het manuscript, analyseert u de gelabelde cellen door flowcytometrie en bepaalt u het percentage CD105 CD90-positieve en CD105 CD73-positieve cellen.

Analyseer CD105 positieve en CD34 CD45 negatieve cellen afzonderlijk. Bedek de weefselkweekplaat met 0,01% collageen en 20 microgram per milliliter laminine in PBS en plaats het minimaal vier uur op de rocker bij kamertemperatuur. Verwijder na de incubatie het collageen en was de plaat met PBS en plaats vervolgens uMSCs met een dichtheid van 10.000 cellen per vierkante centimeter in het groeimedium.

Zodra de cellen 70% samenvloeiing bereiken, aspirateer het groeimedium en spoel de kweekplaat tweemaal met PBS. Om de kinetiek van myogene progressie te bepalen, voegt u om de dag M1-medium toe aan de culturen en analyseert u uMSCs voor de expressie van pax7, MyoD, myogenine en myosine zware keten op respectievelijk twee dagen, vier tot vijf dagen, zes tot zeven dagen en tien tot veertien dagen. uMSCs geven de expressie van CD105 en CD90 weer en drukken geen hematopoëtische markers CD34 en CD45 uit.

De uMSC's waren ook positief voor de expressie van uMSCs-marker CD73, wat aangeeft dat de uMSCs meerdere sleutelmarkers uitdrukten. uMSCs vertoonden expressie van pax7 binnen de eerste twee dagen na de toevoeging van M1, gevolgd door MyoD-expressie binnen de eerste vier dagen van M1-toevoeging. Cellen drukken myogenine-eiwit uit na zes dagen differentiatie, gevolgd door de expressie van myosine zware keten tussen 10 dagen en 14 dagen na de inductie van differentiatie.

970 genen werden geupreguleerd als reactie op de inductie van myogene differentiatie in vergelijking met de ongedifferentieerde uMSCs. Meer myogene genen werden upreguleerd in van navelstrengweefsel afgeleide uMSCs in vergelijking met van navelstrengbloed afgeleide uMSCs. Zowel navelstrengweefsel als navelstrengbloed vertoonden upregulatie van genen gerelateerd aan cytoskeletale eiwitten, geassocieerd met actinebinding en sarcomeerassemblage, transporters geassocieerd met contractiele functie, spiermassaonderhoud, calciumsignalering en enzymatische functie.

Verzamel het weefsel onder aseptische conditie en behoud steriele cultuur. Het snoer moet uitwendig worden geveegd met 70% ethanol en zo snel mogelijk worden verwerkt. Veel regeneratieve therapieën vereisen grote aantallen cellen uit vroege passages.

Het kan ook worden gebruikt als een model om de hele droge omgeving na te bootsen en het postnatale metabolisme te weerspiegelen.