Name: Ensemble Force Spectroscopie door Shear Forces (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Leer ensemble force spectroscopie voor het bestuderen van DNA-ligand bindingen met hoge doorvoer. Deze methode maakt real-time detectie van biomoleculaire interacties en mechanisch ontvouwen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoekswerk werd ondersteund door de National Science Foundation [CBET-1904921] en de National Institutes of Health [NIH R01CA236350] aan H.M.

OPMERKING: Alle buffers en de chemische reagentia die in dit protocol worden gebruikt, worden vermeld in de tabel Materialen.
1. Voorbereiding van de schuifkrachtmicroscoop
OPMERKING: De schuifkrachtmicroscoop bestaat uit twee delen, een reactie-eenheid (homogenisator) en een detectie-eenheid (fluorescentiemicroscoop). De vergroting van het oculair is 10x en de vergroting van de objectieflens (lucht) is 4x.
<ol><li>Monteer de homogenisator en de microscoop op een montagetafel. Draag een bril en zet de fluorescentiemicroscoop aan en pas vervolgens de homogenisator aan om ervoor te zorgen dat de excitatielichtstraal van een geschikte golflengte (hier werd 488 nm gebruikt) door het midden van de dispergeerpunt van de homogenisator gaat.</li>
	<li>Bereid een reactiekamer met platte bodem voor die 5 cm hoog is en 1,5 cm2 x 1,5 cm2 in doorsnede. Om de achtergrond te verminderen, moet u ervoor zorgen dat het geselecteerde kamermateriaal niet fluoresceert, zoals een bril (sommige kunststoffen hebben fluorescentie).</li>
	<li>Kies een geschikte homogenisatordisperseerpunt die de gewenste schuifkracht kan leveren. OPMERKING: De afschuifsnelheid is afhankelijk van de afstand tussen de rotor en de stator bij een vaste roterende snelheid11 volgens de volgende vergelijking: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63741/63741eq01.jpg" style="margin: auto;"> waarbij μ de dynamische viscositeit van water bij 20 °C is; D is de binnendiameter van de stator; d is de buitendiameter van de rotor en V is de schuifsnelheid (toerental/s).</li>
	<li>Klem de reactiekamer op het monsterstadium van de fluorescentiemicroscoop en pas vervolgens de kamer aan om de dispergeerpunt van de homogenisator vast te houden (figuur 1). Zorg ervoor dat de dispergeerpunt zich iets boven (~ 1 mm) het onderste oppervlak van de reactiekamer bevindt.</li>
	<li>Pas de verticale positie van de homogenisator en de kamer samen aan om ervoor te zorgen dat de focus van de microscoop op het oppervlak van de dispergeerpunt ligt. Pas vervolgens de horizontale positie van de dispergeerpunt aan om ervoor te zorgen dat het detectiegebied (gezichtsveld) is ingesteld tussen de rotor en de stator (figuur 1).</li>
	<li>Schakel de fluorescentiekanalen in volgens de fluorescerende kleurstof die in het experiment is gebruikt.</li>
	<li>Gebruik vóór het high-speed shearing experiment gedeïoniseerd (DI) water om het afschuiven te testen met een lage schuifsnelheid (bijv. 2.000 rpm) om ervoor te zorgen dat de dispergeerpunt op de juiste manier kan werken zonder de reactiekamer aan te raken.</li>
</ol>2. I-motieven ontvouwen met en zonder liganden
<ol><li>Bereid een menselijk telomerisch i-motief-DNA (Tabel van Materialen) gelabeld met respectievelijk een kleurstof en een quencher aan de twee uiteinden in DI-water, zoals beschreven in Hu et al.11. OPMERKING: i-motief met volgorde: 5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA.</li>
	<li>Verdun het DNA tot 5 μM in de 30 mM MES-buffer bij pH 5,5 of pH 7,4. Voeg aan de DNA-oplossing ligand L2H2-4OTD toe, dat werd gesynthetiseerd volgens Abraham Punnoose et al.13, in een concentratiebereik van 0-60 μM. Meng de oplossing voorzichtig gedurende 10 minuten om de i-motiefstructuren zonder licht te vouwen.</li>
	<li>Controleer en minimaliseer de achtergrondfluorescentie-intensiteit van de reactiekamer die is gevuld met gedeïoniseerd DI-water met behulp van de fluorescerende microscoop zonder afschuiving. Een eenvoudige manier om de achtergrondfluorescentie te minimaliseren, is door de reactiekamer te wassen met DI-water. De achtergrondfluorescentiewaarde moet later in de data-analyses worden afgetrokken. OPMERKING: Strooilicht moet vanaf deze stap worden vermeden.</li>
	<li>Stel de parameters van de CCD-camera in met behulp van de software. De aanbevolen parameters zijn als volgt: belichtingstijd = 0,5 s, CCD-gevoeligheid = 1600 en opnametijd = 20 min.</li>
	<li>Voeg met behulp van een lange pipet de DNA-oplossing toe aan de lege en schone reactiekamer. Bedek de reactiekamer met een zwarte doos. Start vervolgens de homogenisator om af te scheren met een geselecteerde schuifsnelheid variërend van 9.724 s−1 tot 97.245 s−1 (geselecteerd met behulp van de software die is gekoppeld aan de homogenisator) gedurende 20 minuten met de CCD-camera ingeschakeld om de gegevens vast te leggen.</li>
	<li>Verwijder na het experiment de kamer en was deze met DI-water.</li>
</ol>3. Schuifkracht-bediende klikreactie
<ol><li>Bereid i-motief DNA in DI water. Incubeer 10 μM i-motief DNA in 300 μL van 30 mM Tris buffer (pH 7,4) aangevuld met 150 μM CuCl en 300 μM ascorbinezuur gedurende 10 minuten om de i-motiefstructuren te vouwen (alle concentraties zijn eindconcentraties in de oplossing). OPMERKING: CuCl is de katalysator van de klikreactie. Ascorbinezuur voorkomt koper (I) oxidatie.</li>
	<li>Ultrafiltreer de oplossing met een ultrafiltratieapparaat met een centrifugale kracht van 14.300 x g. Vul de oplossing aan tot ~500 μL met 30 mM Tris-buffer (pH 7,4) aangevuld met 300 μM ascorbinezuur na elke filtratie.</li>
	<li>Herhaal de filtratie 3x.</li>
	<li>Verzamel de restoplossing en maak een eindvolume van 300 μL door 30 mM Tris (pH 7,4) toe te voegen, aangevuld met 300 μM ascorbinezuur samen met 20 μM Calfluor 488 azide, 20 μM HPG en 10 μM TBTA. Zodra de reagentia zijn toegevoegd, verplaatst u de oplossing naar de donkere kamer. OPMERKING: Licht moet na deze stap worden vermeden.</li>
	<li>Controleer en minimaliseer de achtergrondfluorescentie-intensiteit van de reactiekamer gevuld met DI-water met behulp van de microscoop vóór de afschuifexperimenten. Een eenvoudige manier om de achtergrondfluorescentie te minimaliseren, is door de reactiekamer te wassen met DI-water.</li>
	<li>Voeg de DNA-oplossing met een lange pipet toe aan de lege reactiekamer en start vervolgens het afschuiven van de homogenisator met een afschuifsnelheid van 63.209 s−1 gedurende 20 minuten met de CCD-camera ingeschakeld.</li>
	<li>Verwijder na het experiment de kamer en was deze met DI-water.</li>
</ol>

<ol><li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+Optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).</li>
<li>Woodside, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+measurements+of+the+sequence-dependent+folding+landscapes+of+single+nucleic+acid+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).</li>
<li>Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+strong+is+a+covalent+bond%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">How strong is a covalent bond.</a> Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).</li>
<li>Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+supercoiled+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Behavior of supercoiled DNA.</a> Biophysical Journal. 74 (4), 2016-2028 (1998).</li>
<li>Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+single-molecule+force+spectroscopy+using+a+centrifuge%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge.</a> Nature Communications. 7, 11026(2016).</li>
<li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-responsive+polymer+particles+as+force+clamps+for+the+mechanical+unfolding+of+target+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules.</a> Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).</li>
<li>Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+assay+for+proteolytic+susceptibility%3A+Force-induced+collagen+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization.</a> Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).</li>
<li>Astumian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+and+kinetics+of+molecular+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics and kinetics of molecular motors.</a> Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).</li>
<li>Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+shear+flow+on+protein+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">The effects of shear flow on protein structure and function.</a> Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).</li>
<li>Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+shear+stress+on+endothelial+cells%3A+go+with+the+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow.</a> Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).</li>
<li>Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+unfolding+of+ensemble+biomolecular+structures+by+shear+force%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force.</a> Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).</li>
<li>Sedghi Masoud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+interactions+between+telomeric+i-motif+DNA+and+a+cyclic+tetraoxazole+compound%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound.</a> ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).</li>
<li>Abraham Punnoose, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+and+specific+recognition+of+telomeric+G-quadruplexes+via+polyvalency+induced+unstacking+of+binding+units%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).</li>
<li>Dhakal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+an+ILPR+i-motif+and+a+partially+folded+structure+with+comparable+mechanical+stability+revealed+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).</li>
<li>Hu, C., Tahir, R., Mao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+mechanochemical+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Single-molecule mechanochemical sensing.</a> Accounts of Chemical Research. 55 (9), 1214-1225 (2022).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, maakt real-time onderzoek mogelijk van de ontvouwing van een ensembleset van biomoleculaire structuren door schuifkracht. De hier gepresenteerde resultaten onderstrepen dat DNA i-motiefstructuren kunnen worden ontvouwd door schuifkracht. Het ontvouwen van het ligandgebonden i-motief en de schuifkracht-aangedreven klikreacties waren proof-of-concept toepassingen voor deze ensemblekrachtspectroscopiemethode.
Figuur 1</stro...

In single-molecule force spectroscopy1 (SMFS) zijn de mechanische eigenschappen van individuele moleculaire structuren bestudeerd door geavanceerde instrumenten zoals de atoomkrachtmicroscoop, optische pincetten en magnetisch pincetten 2,3,4. Beperkt door dezelfde directionaliteitseis van de moleculen in de krachtgenererende/detecterende opstellingen of het kleine gezichtsveld in een magnetisch pincet en de miniatuurcentrifugekrachtmicroscoop (MCF)5,6,7,8, kan slechts een beperkt aantal moleculen tegelijkertijd worden onderzocht met behulp van SMFS. De lage doorvoer van SMFS verhindert de brede toepassing ervan in het moleculaire herkenningsveld, wat de betrokkenheid van een grote set moleculen vereist.
Shear flow biedt een mogelijke oplossing om krachten toe te passen op een enorme set moleculen9. In een vloeistofstroom in een kanaal geldt: hoe dichter bij het kanaaloppervlak, hoe langzamer de stroomsnelheid10. Zo'n stroomsnelheidsgradiënt veroorzaakt schuifspanning die evenwijdig is aan het grensvlak. Wanneer een molecuul in deze afschuifstroom wordt geplaatst, heroriënteert het molecuul zich zodat de lange as uitlijnt met de stroomrichting, omdat de schuifkracht wordt uitgeoefend op de lange as11. Als gevolg van deze heroriëntatie wordt verwacht dat alle moleculen van hetzelfde type (grootte en lengte van de handgrepen) in dezelfde richting uitlijnen terwijl ze dezelfde schuifkracht ervaren.
Dit werk beschrijft een protocol om zo'n schuifstroom te gebruiken om schuifkracht uit te oefenen op een massieve set moleculaire structuren, zoals geïllustreerd door het DNA i-motief. In dit protocol wordt een schuifstroom gegenereerd tussen de rotor en de stator in een homogenisatorpunt. De huidige studie wees uit dat de gevouwen DNA i-motiefstructuur kon worden ontvouwd door schuifsnelheden van 9724-97245 s−1. Bovendien werd een dissociatieconstante van 36 μM gevonden tussen het L2H2-4OTD-ligand en het i-motief. Deze waarde komt overeen met die van 31 μM gemeten door de gelverschuivingstest12. Verder wordt de huidige techniek gebruikt om het i-motief te ontvouwen, dat het gechelateerde koper (I) kan blootstellen om een klikreactie te katalyseren. Dit protocol maakt het dus mogelijk om een grote set i-motiefstructuren met goedkope instrumenten in een redelijke tijd (korter dan 30 minuten) uit te vouwen. Aangezien de schuifkrachttechniek de doorvoer van de krachtspectroscopie drastisch verhoogt, noemen we deze techniek ensemblekrachtspectroscopie (EFS). Dit protocol heeft tot doel experimentele richtlijnen te geven om de toepassing van dit efs op basis van schuifkracht te vergemakkelijken.

<table><tbody><tr><td>3K MWCO Amicon</td><td>Millipore Sigma</td><td>ufc900324</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinezuur</td><td>VWR</td><td>VWRC0143-100G</td><td></td></tr><tr><td>Calfluor 488 azide</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>1369-1</td><td></td></tr><tr><td>CuCl</td><td>Thermo&nbsp;</td><td>ACRO270525000</td><td></td></tr><tr><td>Dispersie tip</td><td>Zwitserland</td><td>PT-DA07/2EC-B101</td><td></td></tr><tr><td>DNA oligo's</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleurstof</td><td>IDT</td><td>/5Cy5/</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>Japan</td><td>Nikon TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>Homogenisator</td><td>Zwitserland</td><td>PT 3100D</td><td></td></tr><tr><td>HPG</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>cs-295271</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>VWRC26760.295</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>VWR</td><td>VWRCE169-500G</td><td></td></tr><tr><td>Quencher</td><td>IDT</td><td>/3IAbRQSp/</td><td></td></tr><tr><td>TBTA</td><td>Tokyo Chemical Industry</td><td>T2993</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>VWR</td><td>VWRCE133-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

ensemble force spectroscopie door shear forces

Ensemble Force Spectroscopy by Shear Forces

Single-molecule technieken op basis van fluorescentie en mechanochemische principes bieden superieure gevoeligheid in biologische detectie. Vanwege het gebrek aan hoge doorvoermogelijkheden is de toepassing van deze technieken echter beperkt in de biofysica. Ensemblekrachtspectroscopie (EFS) heeft een hoge doorvoer aangetoond bij het onderzoek van een enorme reeks moleculaire structuren door mechanochemische studies van individuele moleculen om te zetten in die van moleculaire ensembles. In dit protocol werden de secundaire DNA-structuren (i-motieven) ontvouwd in de schuifstroom tussen de rotor en stator van een homogenisatorpunt met schuifsnelheden tot 77796/s. De effecten van stroomsnelheden en moleculaire groottes op de schuifkrachten die het i-motief ervaart, werden aangetoond. De EFS-techniek onthulde ook de bindingsaffiniteit tussen DNA i-motieven en liganden. Bovendien hebben we een klikchemiereactie aangetoond die kan worden geactiveerd door schuifkracht (d.w.z. mechano-klikchemie). Deze resultaten stellen de effectiviteit vast van het gebruik van schuifkracht om de conformatie van moleculaire structuren te regelen.

Figuur 1 schetst de mechanische ontvouwing en real-time detectie van ensemblemoleculen in EFS. In figuur 1B werd waargenomen dat de fluorescentie-intensiteit van i-motif DNA toenam met de schuifsnelheid variërend van 9.724 s−1 tot 97.245 s−1 in een pH 5,5 MES-buffer. Als controle werd de fluorescentie-intensiteit niet verhoogd wanneer hetzelfde i-motief-DNA werd geschoren met een snelheid van 63.209 s−1 in een pH...

Ensemble force spectroscopy (EFS) is een robuuste techniek voor mechanische ontvouwing en real-time detectie van een ensemble set van biomoleculaire structuren in biofysische en biosensing velden.

Ensemble Force Spectroscopie door Shear Forces

Single-molecule techniques based on fluorescence and mechanochemical principles provide superior sensitivity in biological sensing. However, due to the ...

Dit protocol biedt een high throughput techniek om de intermoleculaire binding tussen DNA en liganden te bestuderen. Deze techniek heeft een hoge doorvoer aangetoond bij het onderzoek van massieve set biomoleculaire structuren. Het doet dit door de mechanische chemische eigenschappen van individuele moleculen om te zetten in die van moleculaire ensembles.Ik denk dat het een heel stap vooruit is, maar er zijn weinig kritische stappen. Bijvoorbeeld de uitlijning van microscoop, homogenisator en de reactiebuis. Deze drie dingen moeten perfect op elkaar zijn afgestemd om de verandering in fluorescentie nauwkeurig te volgen.Begin met het monteren van de homogenisator en de microscoop op een montagetafel. Nadat u een bril hebt gedragen, zet u de fluorescentiemicroscoop aan en past u vervolgens de homogenisator aan om ervoor te zorgen dat de excitatielichtstraal door het midden van de dispergeerpunt van de homogenisator gaat. Bereid vervolgens een reactiekamer met platte bodem voor die vijf centimeter hoog is en 1,5 bij 1,5 vierkante centimeter in doorsnede, zodat het geselecteerde kamermateriaal niet fluoresceert om de achtergrond te verminderen.Klem daarna de reactiekamer op het monsterstadium van de fluorescentiemicroscoop en pas vervolgens de kamer aan om de dispergeerpunt van de homogenisator vast te houden, zodat de punt zich iets boven het onderste oppervlak van de reactiekamer bevindt. Pas vervolgens de verticale positie van de homogenisator en de kamer samen aan om ervoor te zorgen dat de focus van de microscoop op het oppervlak van de dispergeerpunt ligt. Pas vervolgens de horizontale positie van de dispergeerpunt aan om ervoor te zorgen dat het detectiegebied tussen de rotor en de stater is ingesteld.Schakel de fluorescerende kanalen in, volgens de fluorescerende kleurstof die in het experiment is gebruikt. Vóór het hoge snelheidsschuifexperiment werd gedeïoniseerd water gebruikt om het scheren met een lage schuifsnelheid te testen. Bereid eerst een menselijk telomerisch i-motief-DNA gelabeld met een kleurstof en een quencher aan de twee uiteinden respectievelijk in gedeïoniseerd water zoals beschreven in het manuscript.Verdun vervolgens het DNA tot vijf micromolaire in 30 millimolaire MES-buffer bij pH 5,5 of pH 7,4. Voeg aan de DNA-oplossing ligand L2H24OTD" toe in een concentratiebereik van nul tot 60 micromolair en meng de oplossing voorzichtig gedurende 10 minuten om de i-motiefstructuren zonder licht te vouwen. Controleer en minimaliseer de achtergrondfluorescentie-intensiteit van de reactiekamer die is gevuld met gedeïoniseerd water met behulp van de fluorescerende microscoop zonder af te scheren.Stel vervolgens de parameters van de CCD-camera in met behulp van de software met belichtingstijd als 0,5 seconden, CCD-gevoeligheid van 1.600 en opnametijd gelijk aan 20 minuten. Voeg met een lange pipet de DNA-oplossing toe aan de lege en schone reactiekamer en bedek de reactiekamer met een zwarte doos. Start vervolgens de homogenisator om gedurende 20 minuten te scheren met een geselecteerde schuifsnelheid variërend van 9, 724 per seconde tot 97, 245 per seconde, met de CCD-camera ingeschakeld om de gegevens op te nemen.Verwijder na het experiment de kamer en was deze met gedeïoniseerd water. Bereid i-motief DNA en gedeïoniseerd water. Incubeer vervolgens 10 micromolair i-motief-DNA en 300 microliter 30 millimolar tris buffer aangevuld met 150 micromolelie koperchloride en 300 micromolair ascorbinezuur gedurende 10 minuten om de i-motiefstructuren te vouwen.Vervolgens ultra filtraat de oplossing met een ultrafiltratie-apparaat met een centrifugale kracht van 14, 300 keer G.Vul de oplossing aan tot ongeveer 500 microliter met 30 millimol tris-buffers aangevuld met 300 micromolaire ascorbinezuur na elke filtratie. Maak na het verzamelen van de restoplossing een laatste volume van 300 microliter door 30 millimol tris toe te voegen, aangevuld met 300 micromolaire ascorbinezuur samen met 20 micromolaire CalFluor 488 Azide, 20 micromolaire HPG en 10 micromolaire TBTA. Zodra de reagentia zijn toegevoegd, verplaatst u de oplossing naar de donkere kamer.Controleer en minimaliseer vervolgens de achtergrondfluorescentie-intensiteit van de reactiekamer gevuld met gedeïoniseerd water met behulp van de microscoop vóór de afschuifexperimenten. Voeg vervolgens de DNA-oplossing toe aan de lege reactiekamer met een lange pipet en start vervolgens het afschuiven van de homogenisator met een afschuifsnelheid van 63, 209 per seconde gedurende 20 minuten met de CCD-camera ingeschakeld. Verwijder na het experiment de kamer en was deze met gedeïoniseerd water.De fluorescentie-intensiteit van i-motif DNA werd waargenomen om toe te nemen met de enorme snelheid variërend van 9, 724 per seconde tot 97, 245 per seconde in een pH 5,5 MES-buffer. De fluorescentie-intensiteit werd echter niet verhoogd wanneer hetzelfde i-motief-DNA werd geschoren met een snelheid van 63.209 per seconde, omdat het niet vouwt bij pH 7,4 in MES-buffer. De ligandbinding aan de DNA i-motiefmoleculen die aan de pure stroom werden onderworpen, werd geëvalueerd, waaruit bleek dat de toename van de fluorescentie-intensiteit minder duidelijk werd met toenemende ligandconcentratie.De dissociatieconstante werd bepaald voor de interactie tussen het ligand en het i-motief en bleek 34 micromol te zijn. Het koperen i-motief werd uitgevouwen met een schuifsnelheid van 63, 209 per seconde, en de vrijgekomen koperen i-motief veroorzaakte de fluorgene klikreactie, wat resulteerde in een verhoogde fluorescentie-intensiteit in de loop van de tijd. Zorg er eerst voor dat het detectiegebied is ingesteld tussen rotor en de stater.Ten tweede, controleer en minimaliseer de fluorescentieachtergrond. En tot slot, zorg ervoor dat u de reactie filtert voordat u een klikreactie uitvoert. Deze methode opent een poort om de mechanische sterkte te verkennen, waarbij allerlei polymeren kunnen worden gevouwen en uitgevouwen.Het kunnen andere DNA-structuren, eiwitten of andere polymeren zijn, en hun interactie met andere soorten moleculen. Zoals gezegd kunnen verschillende andere macromoleculen met deze aanpak worden bestudeerd.

ensemble-force-spectroscopy-by-shear-forces

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit is een stap-voor-stap handleiding toont het doel, de werking, en representatieve resultaten van de roman zwaartekracht spectrometer.

Demonstratie van het gebruik van de Novel zwaartekracht Spectrometer te rekken en te meten Stapel-eiwitten

Cellulosomen zijn multi-enzymcomplexen die zijn ontworpen voor het verteren van cellulose. AFM-gebaseerde SMFS werd gebruikt om de mechanische eigenschappen en vouwconfiguratie van cellulosome-geassocieerde eiwitassemblages te bestuderen. We presenteren een complete workflow voor eiwit-immobilisatie, dataverzameling en data-analyse om de interacties van individuele receptor-ligandcomplexen te bestuderen die betrokken zijn bij cellulosome-assemblage.

Onderzoeken Receptor-ligand systemen van de Cellulosome met AFM-gebaseerde Single-molecule Force Spectroscopie

Er wordt een protocol gepresenteerd om een grote verscheidenheid aan enkele moleculen covalent aan een AFM-tip te koppelen. Procedures en voorbeelden om de adhesiekracht en vrije energie van deze moleculen op vaste ondergronden en bio-interfaces te bepalen, worden gegeven.

Onderzoekt Single Molecule Hechting van Atomic Force Spectroscopie

We beschrijven een protocol voor de bereiding van ondersteunde lipide-dubbellagen en de karakterisering ervan met behulp van atoomkrachtmicroscopie en krachtspectroscopie.

Atomic Force Microscopy Imaging en Force Spectroscopie van Ondersteunde lipidendubbellagen

Hier presenteren we een protocol om de kracht van de interacties tussen een goed gedefinieerde anorganische oppervlak en ofwel peptiden of aminozuren door single-molecule force spectroscopy metingen te meten met behulp van een atomic force microscope (AFM). De resultaten van de meting informatie is belangrijk voor een beter begrip van het peptide-anorganisch materiaal interfase.

Inzicht in de interacties van aminozuren en peptiden met anorganische materialen met behulp van enkel-molecuul Force Spectroscopie

We beschrijven de gedetailleerde procedures en de strategieën voor het meten van de mechanische eigenschappen en mechanische ontvouwen trajecten van één eiwitmolecules met behulp van een atomic force microscope. We tonen ook representatieve resultaten als een referentie voor selectie en motivering van goed één eiwit molecuul opnames.

Kracht spectroscopie van één eiwitmolecules met behulp van een Atomic Force Microscope

Dit protocol beschrijft de covalente immobilisatie van eiwitten met een heterobifunctional silane koppelmiddel op siliciumoxide oppervlakken ontworpen voor de atomaire kracht microscopie gebaseerd enkel molecuul kracht spectroscopie die wordt geïllustreerd door de interactie van RrgA (pilus-1 tip antistoffen van S. pneumoniae) met fibronectine.

Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie

Covalente gehechtheid van sondemoleculen aan atoomkrachtmicroscopie (AFM) cantilever tips is een essentiële techniek voor het onderzoek van hun fysieke eigenschappen. Dit stelt ons in staat om de rekkracht, desorptiekracht en lengte van polymeren te bepalen via AFM-gebaseerde single molecule force spectroscopie met een hoge reproduceerbaarheid.

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Hier wordt een uitgebreid protocol gepresenteerd om ultrasnelle krachtklemexperimenten uit te voeren op processieve myosine-5-motoren, die gemakkelijk kunnen worden uitgebreid naar de studie van andere klassen processieve motoren. Het protocol beschrijft alle noodzakelijke stappen, van de opstelling van het experimentele apparaat tot monstervoorbereiding, gegevensverzameling en analyse.

Het ontleden van mechano-enzymatische eigenschappen van processieve myosinen met ultrasnelle krachtklemspectroscopie

Hier beschrijven we een snelle magnetische pincetopstelling die nanomechanische metingen uitvoert op krachtgevoelige biomoleculen met de maximale snelheid van 1,2 kHz. We introduceren de toepassing ervan op DNA-haarspelden en SNARE-complexen als modelsystemen, maar het zal ook van toepassing zijn op andere moleculen die betrokken zijn bij mechanobiologische gebeurtenissen.

High-speed magnetisch pincet voor nanomechanische metingen aan krachtgevoelige elementen

Leer ensemble force spectroscopie voor het bestuderen van DNA-ligand bindingen met hoge doorvoer. Deze methode maakt real-time detectie van biomoleculaire interacties en mechanisch ontvouwen mogelijk.

Ensemble Force Spectroscopie door Shear Forces

Meer video's verkennen