Ensemble Force Spectroscopie door Shear Forces

Dit protocol biedt een high throughput techniek om de intermoleculaire binding tussen DNA en liganden te bestuderen. Deze techniek heeft een hoge doorvoer aangetoond bij het onderzoek van massieve set biomoleculaire structuren. Het doet dit door de mechanische chemische eigenschappen van individuele moleculen om te zetten in die van moleculaire ensembles.

Ik denk dat het een heel stap vooruit is, maar er zijn weinig kritische stappen. Bijvoorbeeld de uitlijning van microscoop, homogenisator en de reactiebuis. Deze drie dingen moeten perfect op elkaar zijn afgestemd om de verandering in fluorescentie nauwkeurig te volgen.

Begin met het monteren van de homogenisator en de microscoop op een montagetafel. Nadat u een bril hebt gedragen, zet u de fluorescentiemicroscoop aan en past u vervolgens de homogenisator aan om ervoor te zorgen dat de excitatielichtstraal door het midden van de dispergeerpunt van de homogenisator gaat. Bereid vervolgens een reactiekamer met platte bodem voor die vijf centimeter hoog is en 1,5 bij 1,5 vierkante centimeter in doorsnede, zodat het geselecteerde kamermateriaal niet fluoresceert om de achtergrond te verminderen.

Klem daarna de reactiekamer op het monsterstadium van de fluorescentiemicroscoop en pas vervolgens de kamer aan om de dispergeerpunt van de homogenisator vast te houden, zodat de punt zich iets boven het onderste oppervlak van de reactiekamer bevindt. Pas vervolgens de verticale positie van de homogenisator en de kamer samen aan om ervoor te zorgen dat de focus van de microscoop op het oppervlak van de dispergeerpunt ligt. Pas vervolgens de horizontale positie van de dispergeerpunt aan om ervoor te zorgen dat het detectiegebied tussen de rotor en de stater is ingesteld.

Schakel de fluorescerende kanalen in, volgens de fluorescerende kleurstof die in het experiment is gebruikt. Vóór het hoge snelheidsschuifexperiment werd gedeïoniseerd water gebruikt om het scheren met een lage schuifsnelheid te testen. Bereid eerst een menselijk telomerisch i-motief-DNA gelabeld met een kleurstof en een quencher aan de twee uiteinden respectievelijk in gedeïoniseerd water zoals beschreven in het manuscript.

Verdun vervolgens het DNA tot vijf micromolaire in 30 millimolaire MES-buffer bij pH 5,5 of pH 7,4. Voeg aan de DNA-oplossing ligand L2H24OTD" toe in een concentratiebereik van nul tot 60 micromolair en meng de oplossing voorzichtig gedurende 10 minuten om de i-motiefstructuren zonder licht te vouwen. Controleer en minimaliseer de achtergrondfluorescentie-intensiteit van de reactiekamer die is gevuld met gedeïoniseerd water met behulp van de fluorescerende microscoop zonder af te scheren.

Stel vervolgens de parameters van de CCD-camera in met behulp van de software met belichtingstijd als 0,5 seconden, CCD-gevoeligheid van 1.600 en opnametijd gelijk aan 20 minuten. Voeg met een lange pipet de DNA-oplossing toe aan de lege en schone reactiekamer en bedek de reactiekamer met een zwarte doos. Start vervolgens de homogenisator om gedurende 20 minuten te scheren met een geselecteerde schuifsnelheid variërend van 9, 724 per seconde tot 97, 245 per seconde, met de CCD-camera ingeschakeld om de gegevens op te nemen.

Verwijder na het experiment de kamer en was deze met gedeïoniseerd water. Bereid i-motief DNA en gedeïoniseerd water. Incubeer vervolgens 10 micromolair i-motief-DNA en 300 microliter 30 millimolar tris buffer aangevuld met 150 micromolelie koperchloride en 300 micromolair ascorbinezuur gedurende 10 minuten om de i-motiefstructuren te vouwen.

Vervolgens ultra filtraat de oplossing met een ultrafiltratie-apparaat met een centrifugale kracht van 14, 300 keer G.Vul de oplossing aan tot ongeveer 500 microliter met 30 millimol tris-buffers aangevuld met 300 micromolaire ascorbinezuur na elke filtratie. Maak na het verzamelen van de restoplossing een laatste volume van 300 microliter door 30 millimol tris toe te voegen, aangevuld met 300 micromolaire ascorbinezuur samen met 20 micromolaire CalFluor 488 Azide, 20 micromolaire HPG en 10 micromolaire TBTA. Zodra de reagentia zijn toegevoegd, verplaatst u de oplossing naar de donkere kamer.

Controleer en minimaliseer vervolgens de achtergrondfluorescentie-intensiteit van de reactiekamer gevuld met gedeïoniseerd water met behulp van de microscoop vóór de afschuifexperimenten. Voeg vervolgens de DNA-oplossing toe aan de lege reactiekamer met een lange pipet en start vervolgens het afschuiven van de homogenisator met een afschuifsnelheid van 63, 209 per seconde gedurende 20 minuten met de CCD-camera ingeschakeld. Verwijder na het experiment de kamer en was deze met gedeïoniseerd water.

De fluorescentie-intensiteit van i-motif DNA werd waargenomen om toe te nemen met de enorme snelheid variërend van 9, 724 per seconde tot 97, 245 per seconde in een pH 5,5 MES-buffer. De fluorescentie-intensiteit werd echter niet verhoogd wanneer hetzelfde i-motief-DNA werd geschoren met een snelheid van 63.209 per seconde, omdat het niet vouwt bij pH 7,4 in MES-buffer. De ligandbinding aan de DNA i-motiefmoleculen die aan de pure stroom werden onderworpen, werd geëvalueerd, waaruit bleek dat de toename van de fluorescentie-intensiteit minder duidelijk werd met toenemende ligandconcentratie.

De dissociatieconstante werd bepaald voor de interactie tussen het ligand en het i-motief en bleek 34 micromol te zijn. Het koperen i-motief werd uitgevouwen met een schuifsnelheid van 63, 209 per seconde, en de vrijgekomen koperen i-motief veroorzaakte de fluorgene klikreactie, wat resulteerde in een verhoogde fluorescentie-intensiteit in de loop van de tijd. Zorg er eerst voor dat het detectiegebied is ingesteld tussen rotor en de stater.

Ten tweede, controleer en minimaliseer de fluorescentieachtergrond. En tot slot, zorg ervoor dat u de reactie filtert voordat u een klikreactie uitvoert. Deze methode opent een poort om de mechanische sterkte te verkennen, waarbij allerlei polymeren kunnen worden gevouwen en uitgevouwen.

Het kunnen andere DNA-structuren, eiwitten of andere polymeren zijn, en hun interactie met andere soorten moleculen. Zoals gezegd kunnen verschillende andere macromoleculen met deze aanpak worden bestudeerd.