Hoge-resolutie Meting van Geur-Driven gedrag in Drosophila Larven

Hallo, mijn naam is Matt Lui. Ik ben postdoctoraal onderzoeker in het laboratorium van Leslie Sal aan de Rockefeller University. Vandaag wil ik u vertellen over de experimenten die we hebben uitgevoerd om de chemotaxis van larven te bestuderen.

Het probleem waar we ons op richten is vrij eenvoudig. Het wordt hier in deze opstelling weergegeven. Ik heb zojuist een groep Joseph-larven op dit agar-oppervlak overgebracht.

Deze omgeving is vrij vijandig en de dieren staan op het punt te verhongeren. Op de een of andere manier zullen deze dieren hun weg naar de dichtstbijzijnde voedselbron moeten vinden, en hier zijn enkele bananen die een geur verspreiden die de larven zal aantrekken. Deze omgeving is niet ideaal om chemotaxisgedrag te bestuderen, dus de eerste verbetering zal zijn om de banaan te vervangen door een chemische stof.

Deze chemische stof is iso-acetaat en het is een van de smaakstoffen die dominant aanwezig zijn in banaan. Dit is onze kunstmatige smaakstof en door deze te gebruiken hebben we een veel betere controle over de olfactorische stimulus. De volgende verbetering is het gebruik van een gesloten omgeving om fluctuaties in de overige distributie op deze wijze te voorkomen.

Dit is de assay die we in het laboratorium al geruime tijd gebruiken. Dit is een Petrischaal met een laag agar op de bodem. Agar is ideaal voor larven bij chemotaxis, omdat het hen gehydrateerd houdt.

Aan de twee zijden van de plaat bevindt zich een andere dop van Teflon; wat we nu gaan doen is isamylacetaat aan de ene zijde aanbrengen en geen geur aan de andere zijde. Zodra dit is gebeurd, is het de bedoeling de petrischaal te sluiten, een korte tijd te wachten zodat de geur kan diffunderen, en vervolgens de schaal te openen. Plaats hier een dier, waarna we het dier gedurende een bepaalde periode laten bewegen.

Deze assay is gebaseerd op de aanname dat er, door theodor aan één zijde van de schaal toe te voegen, een gradiënt ontstaat die relatief snel wordt vastgesteld en stabiel blijft gedurende de testperiode. Het belangrijkste probleem is nu dat nog nooit is aangetoond dat deze gradiënt daadwerkelijk in de plaat bestaat. Het is heel goed mogelijk dat er kort na de toevoeging van theodor een homogene verdeling van theodor in de plaat optreedt, waardoor de gradiënt zeer gering zou zijn, of dat er meerdere minuten nodig zijn voordat de gradiënt is vastgesteld.

Dit zal uiteraard hoofdzakelijk afhangen van de dampdruk van het gebruikte theodor. Het tweede punt heeft betrekking op wat er tijdens het experiment wordt gekwantificeerd. Stel dat een dier hier begint, bij de X, en na drie minuten wordt aangetroffen bij deze eindplaat, de rode X. Er zijn nu twee mogelijke benaderingen.

Een mogelijkheid is om alleen de eindpositie van het dier na een bepaalde periode, bijvoorbeeld drie of vijf minuten, vast te leggen. In dat geval zou u enkel de start- en eindpositie registreren, maar wij geloven dat een goede resolutie van het gedrag van het dier over de tijd essentieel is. Een dier zou bijvoorbeeld nauwelijks kunnen zijn bewogen van de startpositie naar de eindpositie, zoals hier, of het zou zeer goed kunnen zijn dat het dier gedurende een aanzienlijk deel van de tijd de regio rondom theodor heeft bezocht en daarvóór het einde van de trial is teruggekeerd.

De conclusie die we uit deze twee situaties zouden trekken, is zeer verschillend. In het ene geval heeft het dier mogelijk niet gereageerd op de stimulus, terwijl het in het andere geval zeker wel heeft gereageerd. De twee verbeteringen die we proberen te realiseren zijn enerzijds het beheersen van de vorm en stabiliteit van de andere gradiënt in de arena.

Ten tweede volgt u het gedrag van het dier in realtime en bewaart u al deze informatie. In de volgende sequentie zal Sylvia u laten zien hoe we een verdunningsreeks voorbereiden. Mijn naam is S ti.

Ik ben een onderzoeksassistent in het VA-laboratorium waar ik werk aan materiaalgebruik. Vandaag ga ik u laten zien hoe u de materialen voorbehandelt voor het kamersysteem dat we gebruiken om dieren te volgen. Het belangrijkste aspect van ons kamersysteem is dat we geurstoffen gebruiken die in de lucht zijn verspreid.

Dit betekent dat wanneer de agarplaten die we gebruiken bijvoorbeeld niet vlak zijn, er schommelingen in de concentratie tussen experimenten kunnen optreden, wat ruis in het systeem zal introduceren. Daarom zal ik u enkele kleine tips geven om te proberen de ruis in het systeem te verminderen. De materialen voor het bereiden van uw geurverdunning zijn een glazen pot, bij voorkeur van donker glas voor het geval dat u lichtgevoelige geuren gebruikt, met een aliquot van de geur waarin u geïnteresseerd bent.

Glazen pipetten om deze aliquot voor te bereiden en een geschikte mechanische pipethulp. Vervolgens paraffine-olie pipetpunten, uw standaard micropipet en kleine vials voor de verdunning. Nogmaals, deze moeten van glas zijn en bij voorkeur donkergekleurd, en vervolgens een weegschaal om nauwkeurige metingen te verrichten en ruis tussen experimenten te verminderen.

Omdat geuren zeer vluchtig zijn en sommige ervan giftig zijn, worden deze handelingen in een zuurkast uitgevoerd. De eerste stap bij het bereiden van een geurendilutie is het aliquoteren van de geurstof die u gaat verdunnen. Om nauwkeurige verdunningen te bereiden en de variatie tussen experimenten te minimaliseren, is het noodzakelijk om alles te wegen.

Begin met het labelen; er wordt een een molaire concentratie ethylbutyraat gemaakt. Bereid eerst de paraffineolie voor. Paraffineolie is zeer viskeus, dus het is belangrijk om de pipetpunt zo min mogelijk in de paraffineolie te dompelen, net genoeg om de paraffineolie op te kunnen zuigen zonder bellen te vormen.

Veeg vervolgens de overtollige paraffineolie van de zijkant van het flesje af. Nogmaals, omdat paraffineolie viskeus is, is het zeer belangrijk om het langzaam in het vial te laten lopen. Zodra u de paraffineolie in uw flesje heeft gepipetteerd, dient u de pipetpunt niet onmiddellijk weg te gooien, omdat er onderin de punt nog extra olie zal samenkomen.

Het is raadzaam om voorafgaand aan het verdunnen een berekeningsblad op te stellen waarin u het volume en het gewicht van de paraffineolie die u zult toevoegen al heeft bepaald, en hetzelfde te doen voor de geurstof, inclusief het gewicht. Op deze manier kunt u op de weegschaal controleren of u voldoende paraffineolie en geurstof heeft. Indien nodig voegt u meer paraffineolie toe en weegt u opnieuw tot het juiste gewicht is bereikt.

Zodra u het juiste gewicht aan paren-olie heeft, hoeft u alleen het geurelement toe te voegen volgens dezelfde principes. Goed. Hier ga ik laten zien hoe u larven voorbehandelt voor tracking.

Meestal gebruiken we larven die zes dagen oud zijn. We doen dit omdat ze groot genoeg zijn om gemakkelijk door onze software te worden gedetecteerd en omdat ze nog zeer actief zijn. Om te bepalen of de larven te oud zijn voor gebruik bij tracking, moet u controleren of er larven tegen de wanden opklimmen. Als er larven tegen de wand opklimmen, dan zijn ze te oud en zullen ze niet bijzonder actief zijn.

De eerste stap bij het voorbereiden van uw larven is om ze onder te dompelen in 15% sucrose. De reden waarom we 15% sucrose gebruiken, is dat de larven in deze oplossing zullen drijven en het voedsel in plaats daarvan ofwel gedeeltelijk oplost of naar de bodem zinkt. Giet voldoende sucrose zodanig dat dit ongeveer, ik denk iets minder dan een inch van de bovenkant van uw fles of flacon bevindt.

Neem vervolgens een spatel. De larven zijn al naar boven aan het drijven; graaf voorzichtig in het voeder om dieren die zich in het voeder hebben ingegraven los te maken, roer het geheel een beetje rond om ze van het voeder te scheiden en laat het vervolgens een paar minuten staan. Zodra het voeder en de larven voldoende gescheiden zijn, neemt u een vooraf gelabelde Petrischaal en giet u ze in het diepere gedeelte.

Bewaar deksel van de petrischaal, aangezien u deze met water vult en als reservoir voor gevolgde larven gebruikt, zodat u kunt onderscheiden welke larven al zijn gevolgd en welke nog niet. Nu u de larven in de petrischaal heeft gegoten, moet u 30 minuten wachten zodat ze kunnen wennen aan de sucrose en een staat van uithongering bereiken. Dit zorgt ervoor dat ze zich tijdens de 30 minuten aanpassing beter zullen gedragen in de tracking-opstelling.

Tijdens de sucrose-stap is het een goed moment om de platen voor het volgen voor te bereiden. Dit zijn bovenkanten van 96-well platen. Deze kunnen apart worden gekocht en dit is een 3% agarose-oplossing die al is opgewarmd.

We gebruiken 3% omdat dit voorkomt dat de larven graven, maar het is ook compact genoeg zodat ze erop kunnen lopen en bevochtigd blijven op het oppervlak van elke plaat. Pipetteer 25 ml agarose. Het is belangrijk om te proberen de vorming van grote bellen in de gel te vermijden.

Het is daarnaast belangrijk om de platen op een vlak oppervlak te plaatsen; anders kunnen de gels schuin komen te staan, wat het gedrag van de larven kan beïnvloeden. Nadat de gels zijn gestold, stapelen we de bovenkanten en wikkelen we deze in vershoudfolie om uitdroging te voorkomen. Dit houdt ze gedurende enkele dagen in een goede staat voor tracking.

In deze reeks zal ik onze gedragsanalyse presenteren, die enigszins verschilt van de analyse in de petri-schaal waar ik eerder over sprak. U heeft hiervoor 96-well platen nodig, evenals platen die de agarlaag bevatten. De analyses bestaan uit drie deksels die op elkaar gestapeld zijn.

De eerste lip bevat niets, is leeg en wordt uitsluitend gebruikt om het systeem te isoleren van het oppervlak waarop het rust. De tweede laag bevat Diego agro surface. Hier worden de dieren op het oppervlak geplaatst en nu, zoals ik u vervolgens zal laten zien, introduceren we theodor in de plaat.

Het is belangrijk om elke keer een nieuw en schoon dopje te gebruiken wanneer u de Theodor vult. Dit is om kruiscontaminatie tussen experimenten te voorkomen. U heeft daarnaast andere verdunningen nodig.

Normaal gesproken gebruiken we geen kleurstof om theodor te laden, maar hier zal ik het om illustratieve redenen wel doen. Dit is een hoge concentratie theodor. Terwijl deze zeer verdund is, is mijn doel om een gradiënt langs een lijn te creëren.

Zeg deze regel, en we willen dat de concentratie van links naar rechts toeneemt. Om dit te bereiken, gebruik ik verschillende druppels in de condensatiering met een toenemende concentratie. Ik begin met de hoogste concentratie, die aan het uiteinde wordt geplaatst.

Het is belangrijk om het in de ring te verspreiden. Nu ga ik verder met de volgende concentratie, die twee keer is verdund ten opzichte van de eerste, en ik breng deze aan in deze ring. Dus nu heb ik zes druppels.

De eerste bevat een concentratie van bijvoorbeeld 1. De tweede een concentratie van 0,5, wat de helft is van de eerste. De derde heeft een concentratie van 0,25, enzovoort.

We hebben dus een meetkundige reeks langs de lijn. De volgende stap bestaat uit het omkeren van dit deksel op het AAL-oppervlak, waardoor alle druppeltjes nu door oppervlaktespanning aan de bovenkant van het deksel blijven hangen. We hebben een techniek ontwikkeld op basis van infraroodspectroscopie om alle concentraties in de plaat te meten.

Door deze techniek toe te passen, konden we aantonen dat wanneer er een meetkundige reeks langs de geurstoffenlijn is, er een concentratie van de geurstof over de lengte ontstaat die exponentieel toeneemt, zoals hier is weergegeven, en over de breedte van de plaat een profiel hebben dat piekt direct onder de geurstoffenlijn. Hier is hoe de feitelijke geometrie van de gradiënt eruitziet.

Wat betreft de concentratie van theodor in de lucht, is het positieve aspect dat we konden aantonen dat de geometrie van de gradiënt gedurende ten minste 15 minuten stabiel blijft. Na het plaatsen van het bovenste deksel wachten we 30 seconden zodat de gradiënt zich kan stabiliseren. Vervolgens introduceren we het dier in de arena.

Het dier wordt aan de andere zijde geïntroduceerd tussen positie drie en vier; we gebruiken een kleine pin om de larven van de sucrose-oplossing naar het agar-oppervlak over te brengen. De overdracht vindt plaats door een larve rond de kop van de pin te vissen. We openen snel het deksel en de larve wordt op het agar-oppervlak geplaatst.

Sluit vervolgens het deksel. Het is belangrijk om de tijd dat het deksel open blijft te minimaliseren. Neem daarna de beweging van het dier drie of vijf minuten lang op.

De eigenlijke opname wordt gemaakt. Met deze tracking-opstelling maken we gebruik van een camera die is aangesloten op een computer. De gebruikte software voor beeldtracking is Aton vision van Nordis, waarmee informatie over de beweging van het dier wordt verzameld en als digitaal bestand wordt opgeslagen.

We gaan nu beginnen met het gedragsexperiment. We hebben het deksel met de aro-laag en we hebben de verdunningen.

Diego blijft steken bij het eerste dopje. Voordat theodor wordt geladen, is het belangrijk om elk vials te vortexen. We gebruiken onze verdunningen met de laagste concentratie links en de hoogste hier rechts.

Alle zes de druppels worden tegelijkertijd op de plaat geladen. Om geurverlies te voorkomen, gebruiken we hier een meerkanaalpipetteur; er wordt 10 µL van de geur uit elk verdunningsmonster genomen en de geur wordt gelijktijdig geladen. Na het laden wordt het deksel nu omgekeerd op het oppervlak van agros geplaatst.

De gradiënt is in de afgelopen 30 seconden in de plaat aangemaakt, zoals ik u eerder heb laten zien. Nu ga ik een dier op het Diego-oppervlak plaatsen. Zodra het dier is geplaatst, start ik de opname.

Het dier is aanwezig en de beweging ervan wordt nu gevolgd. Zoals u kunt zien, volgt het dier de geurlijn en beweegt het zich in de richting van het punt met de hoogste concentratie van de gradiënt. Houd er rekening mee dat de concentratie van links naar rechts toeneemt met een exponentieel verloop.

Zoals u kunt zien, wordt de bewegingsrichting constant gecorrigeerd. Met betrekking tot de stimulus heeft het dier nu het punt met de hoogste concentratie van de gradiënt bereikt, waarna we het van de plaat verwijderen. Het dier wordt op een andere plaat geplaatst om er zeker van te zijn dat we hetzelfde individu niet direct twee keer volgen.

Nadat we een nieuwe larve hebben geïntroduceerd en een nieuwe opname zijn gestart, volgen we deze regels voor de tracking. We stoppen de tracking zodra het dier de rij met de hoogste concentratie van de plaat heeft bereikt, wat overeenkomt met deze hier. Daarnaast wordt de tracking onderbroken als een dier tegen de wand botst, omdat we elke interferentie willen voorkomen.

De eerste vraag die we stelden was vrij eenvoudig. We wilden weten of een dier een geur bij een bepaalde concentratie kon ruiken of niet. Om een dergelijke test uit te voeren, maken we gewoonlijk gebruik van één enkele geurbron in plaats van meerdere.

Dit stelt u in staat om één vrijheidsgraad te hebben bij het wijzigen van de concentratie in de theodor-druppel. Hier heeft u bijvoorbeeld een druppel met een hoge concentratie, en hier heeft u een druppel met een lage concentratie. Wat we doorgaans doen, is het dier op het Diego-oppervlak direct onder de theodor-druppel introduceren om te zien of het dier in staat is de aanwezigheid ervan te detecteren en in de nabijheid ervan te blijven.

Nu wil ik onze assay op een meer geavanceerde manier gebruiken. Stel dat u één druppel met orde heeft en u registreert verschillende trajecten die hier over elkaar heen zijn gelegd, en u heeft er drie. U heeft één individu dat dit groene spoor genereert.

Er is een oranje spoor dat minder gecentreerd is, en vervolgens is er een roze traject dat een dier representeert dat schijnbaar rond de bron cirkelt. We geloven dat er veel informatie te verkrijgen is over de details van de trajecten. Om deze reden importeren we het traject als een reeks posities in MATLAB en voeren we de analyse vervolgens uit met MATLAB.

Hier is de afstand tot de bron, waarschijnlijk als functie van de tijd. Voor de drie trajecten die eerder werden getoond, ziet u het groene traject, dat zeer dicht bij de bron blijft. U ziet het oranje traject, dat aanzienlijk meer ruis vertoont.

En dan is er deze paarse trajectlijn, die interessant genoeg liet zien dat het dier de bron verliet om op een afstand te blijven, wat waarschijnlijk overeenkwam met een concentratie die optimaal was. Hier ziet u de illustratie van 10 trajecten van dieren die niet kunnen ruiken. Dit zijn mutanten of drie B-mutanten, die non-smellers zijn.

En zoals u kunt zien, illustreren al deze trajecten dat de dieren er niet in slaagden de bron van de geur te detecteren en deze simpelweg verlieten. In schril contrast hiermee hebben we hier 10 opeenvolgende trajecten opgenomen voor witte ratten. Deze dieren kunnen uiteraard wel ruiken en, zoals u kunt zien, accumuleren ze allemaal direct onder de geurenbron.

De zojuist gepresenteerde 20 trajecten werden in feite verkregen zonder de identiteit van de dieren te kennen. Dit demonstreert de efficiëntie en betrouwbaarheid van onze assay. Om vast te stellen of bepaalde Mutanten hier in staat zijn om via een exponentiële gradiënt te ruiken, genereren we verschillende tracks om een beeld te krijgen van hoe goed de dieren de stimulus aan het andere uiteinde kunnen volgen.

Ik zal u nu 15 afzonderlijk opgenomen trajecten laten zien, en zoals u kunt zien, doen de dieren het uitstekend bij het volgen van de stimulus aan de andere kant van de lijn. Nu willen we overgaan tot een eenvoudige controle. Het is zeer goed mogelijk dat de dieren in de exponentiële gradiënt de lijn volgden omdat er sprake was van een stimulus ongeacht de concentratie, en dat de dieren simpelweg rechtdoor gingen.

Om dus aan te tonen dat zij inderdaad de concentratie, of iets dat daarmee samenhangt, berekenen en dit gebruiken om hun beweging te sturen, hebben we nu deze geometrie, die op een zadeldak lijkt. De larve wordt hier zoals gebruikelijk geïntroduceerd, en we verwachten dat ze langs de lijn bewegen en vervolgens detecteren dat de concentratie na dit punt daalt, waarna ze terugkeren. We hebben de test uitgevoerd met vijf dieren.

We hebben de trajecten verzameld en we presenteren deze nu over elkaar heen op deze dia. Zoals u kunt zien, zijn de dieren hier gestart, langs de lijn bewogen, vervolgens het gebied met de hoogste concentratie verkend en daar hoofdzakelijk gebleven. Dit suggereert sterk dat ze in staat zijn om andere concentraties in real-time te berekenen met behulp van de single source assay.

We waren in staat om hoofdzakelijk één grote vraag te beantwoorden. Kan een dier een geur detecteren bij een bepaalde concentratie met behulp van een apparaat met meerdere bronnen? We hebben meer flexibiliteit in het aanpassen van de vorm van de gradiënt en het bepalen of een dier in staat is om gebruik te maken van deze informatie.

Ik wil dit idee illustreren door een eenvoudig experiment uit te voeren. In de gradiënten die we tot nu toe hebben opgezet, hadden we een exponentiële vorm langs de lens. Nu is de vraag of de cellen nog steeds in staat zijn hun weg naar de andere eindlijn te vinden als we ze verder uitdagen door de concentratie lineair langs de lens te laten toenemen.

Deze grafiek stelt de twee typen gradiënten voor. We hebben de exponentiële gradiënt in het paars en de lineaire gradiënt in het groen getest. Dit is de lineaire gradiënt, en ik ga de verschillende concentraties isam-acetaat opschrijven die verdund zijn in paren-olie.

Dit is een rekenkundige reeks. Er wordt een lineaire gradiënt tot stand gebracht en, zoals u kunt zien, is de helling vrij gering in vergelijking met de exponentiële gradiënt hier, waarbij de concentratie aan de uiteinden ook 0,5 is, maar oploopt tot 0,03. De vraag is of navi in staat zijn tot chemotaxis wanneer zij worden geconfronteerd met een dergelijke geringe gradiënt?

Hier wordt de werkelijke concentratie acetaat getoond die is gebruikt in de zes druppels voor de exponentiële gradiënt en voor de lineaire gradiënt. Zoals u kunt zien, is hoewel de hoogste concentraties in beide gevallen voor de lineaire gradiënt gelijk zijn, de laagste concentratie hier vrij hoog. We voeren het experiment uit met de lineaire gradiënt, en hier zijn 15 trajecten van wild-type dieren weergegeven; we geloven dat het vrij duidelijk is dat deze dieren in staat waren de lineaire gradiënt te detecteren en dit signaal langs de deodorantlijn te volgen.

Ik denk dus dat ons punt duidelijk is. Voordat we hier afsluiten, wil ik kort spreken over toekomstige richtingen voor deze tracking-opstelling. Hoewel deze tracking-opstelling u in staat stelt om veel interessante zaken te doen, zoals het observeren van complex gedrag bij larven over een groter gebied en een langere periode, kent het wel enkele beperkingen.

U bent bijvoorbeeld beperkt door de afmetingen van uw plaat, wat de duur van de tracking en de complexiteit van de observeerbare gedragingen beperkt. Het zou daarom wenselijk zijn als we een systeem kunnen ontwikkelen waarbij de plaat groter is of waarbij u helemaal niet beperkt wordt door de randen van een plaat. Een ander probleem is dat het met de huidige software moeilijk is om meer dan één dier tegelijkertijd te tracken, waardoor het niet mogelijk is om populatiegedrag in real-time te observeren.

Een ander interessant aspect van het gedrag dat we met deze opstelling niet kunnen testen, zijn de daadwerkelijke driedimensionale bewegingen van de larven in de ruimte. Wanneer u de dieren volgt, zult u zien dat ze bijvoorbeeld, wanneer ze een geurdruppel bereiken, hun kop kunnen optillen of hun kop heen en weer kunnen bewegen om veranderingen in de concentratie te detecteren. Dit is mogelijk momenteel niet mogelijk met onze specifieke opstelling, dus het zou waardevol zijn om iets te ontwikkelen dat ons hiervoor in staat stelt.