Hoge-resolutie Meting van Geur-Driven gedrag in Drosophila Larven

Hallo, mijn naam is Matt Lui. Ik ben een postdoctoraal onderzoeker in het laboratorium van Leslie Sal aan de Rockefeller University. En vandaag wil ik je vertellen over de experimenten die we hebben gedaan om larvale chemotaxis te bestuderen.

Het probleem waarin we geïnteresseerd zijn, is vrij eenvoudig. Het wordt hier gepresenteerd in deze setup. Ik heb net een groep Joseph Larvae overgebracht naar dit oppervlak van agros.

Deze omgeving is vrij vijandig en ze staan op het punt uit te hongeren. Op de een of andere manier moeten deze dieren hun weg naar de dichtstbijzijnde voedselbron vinden en hier zijn enkele bananen die geur uitzenden die de larven zullen aantrekken. Deze omgeving is niet ideaal om chemotaxisgedrag te bestuderen, dus de eerste verbetering zal zijn om de banaan te vervangen door een chemische stof.

Deze chemische stof is iso-acetaat en het is een van de smaken die overheersend is in banaan. Dus dit is onze kunstmatige smaak en door dit te gebruiken hebben we een veel betere controle over de olfactorische stimulus. De volgende verbetering is om een gesloten omgeving te gebruiken en op deze manier te proberen de fluctuatie in de andere verdeling te voorkomen.

Dus hier is de test die we al heel lang in het lab gebruiken. Dit is een petrischaal met een oppervlak van agarro aan de onderkant. Agarro is ideaal voor larvale chemotaxis omdat het ze gehydrateerd houdt.

Aan de twee zijden van de plaat vind je een andere dop die gemaakt is van Teflon en wat we nu gaan doen is isam-acetaat aan de ene kant introduceren en geen orde aan de andere kant. Zodra dit is gedaan, is het idee om de petroschaal te sluiten, even te wachten tot de theodor is gediffundeerd en daarna de schaal te openen. Breng hier een dier in en we laten het dier een bepaalde tijd bewegen.

Deze test is gebaseerd op de veronderstelling dat door het introductie van theodor aan één kant van de schaal, we een gradiënt hebben dat vrij snel tot stand komt en stabiel zal blijven gedurende de periode van de test. Nu is het belangrijkste probleem dat niemand ooit heeft aangetoond dat het gradiënt in de plaat bestaat. Het zou heel goed kunnen zijn dat gelijk na de toevoeging van theodor, je een homogene verdeling van theodor in de plaat hebt op een manier dat het gradiënt erg ondiep zou zijn of het kan zijn dat er enkele minuten nodig zijn om het gradiënt te vestigen.

Dit zal natuurlijk voornamelijk afhangen van de dampdruk van de theodor die wordt gebruikt. Het tweede probleem heeft te maken met wat er tijdens het experiment wordt gekwantificeerd. Stel dat een dier begint hier, de X en na drie minuten wordt gevonden aan dit einde van de plaat, het rode X. Nu zijn er twee mogelijke benaderingen.

Een ding dat je kunt doen is alleen de uiteindelijke positie van het dier na een bepaalde periode van tijd, drie of vijf minuten, opnemen. Dan is de enige informatie die je zou vastleggen de positie van het begin en, en we geloven dat het belangrijk is om een goede resolutie te hebben over het gedrag van het dier in de loop van de tijd. Bijvoorbeeld, een dier zou nauwelijks van de startpositie naar de eindpositie zijn verplaatst, zoals hier, of het zou heel goed kunnen zijn dat het de regio rond de theodor gedurende een aanzienlijk deel van de tijd heeft bezocht en daarvoor is teruggekeerd voor het einde van de proef.

De conclusie die we uit deze twee situaties zouden trekken, is heel verschillend. In het ene geval heeft het dier mogelijk niet op de stimulus gereageerd, terwijl in het andere geval dat zeker het geval is. De twee verbeteringen die we proberen te bereiken, zijn ten eerste het beheersen van de vorm en stabiliteit van het andere gradiënt in de arena.

Ten tweede, het gedrag van het dier in realtime volgen en al deze informatie bijhouden. In de volgende reeks gaat Sylvia je laten zien hoe we orde-verdunning voorbereiden. Mijn naam is S ti.

Ik ben onderzoeksassistent in het VAs-laboratorium dat werkt voor materiaal lui. Vandaag ga ik je laten zien hoe je de materialen voor het kamersysteem voorbereidt dat we gebruiken om dieren te volgen. Het primaire probleem met ons kamersysteem is dat we geuren gebruiken die in lucht zijn verspreid.

Dit betekent dat als de agros-platen die we gebruiken niet vlak zijn, je fluctuaties en concentratie tussen experimenten kunt krijgen, wat ruis in het systeem zal introduceren. Dus ik zal je laten zien en je kleine tips geven om te proberen de ruis in het systeem te verminderen. Dus de materialen voor het voorbereiden van je geurverdunning zijn een glazen pot, bij voorkeur donker glas als je lichtreactieve geuren gebruikt met een aliquot van de geur die je interesseert.

Glazen pipetten om dit aliquot voor te bereiden en een geschikte mechanische pipethelper. Dan paraffine olie pipetten tips, je standaard pipetman en kleine flesjes voor de verdunning. Nogmaals, deze moeten van glas zijn en bij voorkeur donker en dan een weegschaal om nauwkeurige metingen te maken en ruis tussen experimenten te verminderen.

Aangezien geuren zeer vluchtig zijn en sommige ervan giftig, worden ze binnen een afzuigkap gedaan. De eerste stap om een geurverdunning te repareren is om het geur te aliquoteren dat je gaat verdunnen. Om nauwkeurige verdunningen voor te bereiden en de variatie tussen experimenten te minimaliseren, is het noodzakelijk om alles te wegen.

Dus begin met labelen, ga een 1 molaire concentratie ethylbutyraat maken. Eerst bereid je de paraffine olie voor. Paraffin olie is erg stroperig, dus het is belangrijk om te proberen de pipetten punt zo min mogelijk in de paraffin olie te dopen, net genoeg om de paraffin olie op te kunnen zuigen zonder luchtbellen te genereren.

Dan is het goed om de extra paren olie op de zijkant van de fles af te vegen. Nogmaals, omdat paren olie stroperig is, is het erg belangrijk om het langzaam in de fles te laten uitlopen. Zodra je de para olie in je fles hebt gepipetteerd, gooi de punt dan niet meteen weg omdat er meer zal verzamelen op de bodem van de punt.

Het is goed om een ​​rekenblad voor