Name: Eencellige proteomics voorbereiding voor massaspectrometrie-analyse met behulp van freeze-heat lysis en een isobare drager (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Leer eencellige proteomics voorbereiding met SCoPE2 en massaspectrometrie-analyse. Deze methode kwantificeert duizenden eiwitten uit individuele zoogdiercellen zonder antilichamen, waardoor proteoomheterogeniteit zichtbaar wordt voor kanker- en immunologieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag de herfst 2021 NSF I-Corps Program (Northeastern University site) award erkennen die deze publicatie heeft gefinancierd.

<ol><li>Symmons, O., Raj, A. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27259209/">What's luck got to do with it: single cells, multiple fates, and biological nondeterminism.</a> Molecular Cell. 62 (5), 788-802 (2016).</li>
<li>Paul, I., White, C., Turcinovic, I., Emili, A. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33351222/">Imaging the future: the emerging era of single-cell spatial proteomics.</a> The FEBS Journal. 288 (24), 6990-7001 (2020).</li>
<li>Levy, E., Slavov, N. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30072488/">Single cell protein analysis for systems biology.</a> Essays in Biochemistry. 62 (4), 595-605 (2018).</li>
<li>Nagasawa, S., Kashima, Y., Suzuki, A., Suzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+and+spatial+analyses+of+cancer+cells%3A+toward+elucidating+the+molecular+mechanisms+of+clonal+evolution+and+drug+resistance+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Single-cell and spatial analyses of cancer cells: toward elucidating the molecular mechanisms of clonal evolution and drug resistance acquisition.</a> Inflammation and Regeneration. 41 (1), 22(2021).</li>
<li>Shaffer, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+cell+variability+and+drug-induced+reprogramming+as+a+mode+of+cancer+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rare cell variability and drug-induced reprogramming as a mode of cancer drug resistance.</a> Nature. 555 (7695), 274(2018).</li>
<li>Pan, D., Jia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+single-cell+multi-omics+in+dissecting+cancer+cell+plasticity+and+tumor+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Application of single-cell multi-omics in dissecting cancer cell plasticity and tumor heterogeneity.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 757024(2021).</li>
<li>Segerstolpe, Å, et al. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27667667/">Single-cell transcriptome profiling of human pancreatic islets in health and type 2 diabetes.</a> Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).</li>
<li>Tritschler, S., Theis, F. J., Lickert, H., Böttcher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+single-cell+analysis+provides+new+insights+into+heterogeneity+and+plasticity+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Systematic single-cell analysis provides new insights into heterogeneity and plasticity of the pancreas.</a> Molecular Metabolism. 6 (9), 974-990 (2017).</li>
<li>Hanna, S. J., Tatovic, D., Thayer, T. C., Dayan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+single+cell+rna+sequencing+into+the+immunology+of+type+1+diabetes-+cell+phenotypes+and+antigen+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insights from single cell rna sequencing into the immunology of type 1 diabetes- cell phenotypes and antigen specificity.</a> Frontiers in Immunology. 12, 751701(2021).</li>
<li>Baron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+map+of+the+human+and+mouse+pancreas+reveals+inter-+and+intra-cell+population+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure.</a> Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).</li>
<li>Franks, A., Airoldi, E., Slavov, N. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28481885/">Post-transcriptional regulation across human tissues.</a> PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005535(2017).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpicking+the+proteome+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Unpicking the proteome in single cells.</a> Science. 367 (6477), 512-513 (2020).</li>
<li>Specht, H., Slavov, N. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29945450/">Transformative opportunities for single-cell proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 17 (8), 2565-2571 (2018).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34986167/">Learning from natural variation across the proteomes of single cells.</a> PLoS Biology. , (2021).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Driving+single+cell+proteomics+forward+with+innovation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Driving single cell proteomics forward with innovation.</a> Journal of Proteome Research. 20 (11), 4915-4918 (2021).</li>
<li>Specht, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+proteomic+and+transcriptomic+analysis+of+macrophage+heterogeneity+using+SCoPE2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2.</a> Genome Biology. 22 (1), 50(2021).</li>
<li>Petelski, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+single-cell+proteomics+using+SCoPE2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplexed single-cell proteomics using SCoPE2.</a> Nature Protocols. 16 (12), 5398-5425 (2021).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8683604/">Scaling up single-cell proteomics.</a> Molecular and Cellular Proteomics: MCP. 21 (1), 100179(2022).</li>
<li>Cong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+single-cell+proteomics+workflow+identifies%3E+1000+protein+groups+per+mammalian+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive single-cell proteomics workflow identifies> 1000 protein groups per mammalian cell.</a> Chemical Science. 12 (3), 1001-1006 (2021).</li>
<li>Lombard-Banek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+subcellular+mass+spectrometry+enables+proteo-metabolomic+single-cell+systems+biology+in+a+chordate+embryo+developing+to+a+normally+behaving+tadpole+%28X.+laevis%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">In vivo subcellular mass spectrometry enables proteo-metabolomic single-cell systems biology in a chordate embryo developing to a normally behaving tadpole (X. laevis).</a> Angewandte Chemie. 60 (23), 12852-12858 (2021).</li>
<li>Specht, H., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+accuracy+and+depth+of+protein+quantification+in+experiments+using+isobaric+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Optimizing accuracy and depth of protein quantification in experiments using isobaric carriers.</a> Journal of Proteome Research. 20 (1), 880-887 (2020).</li>
<li>Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCoPE-MS%3A+mass+spectrometry+of+single+mammalian+cells+quantifies+proteome+heterogeneity+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation.</a> Genome Biology. 19 (1), 161(2018).</li>
<li>Specht, H., Harmange, G., Perlman, D. H., Emmott, E. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/10.1101/399774v1">Automated sample preparation for high-throughput single-cell proteomics.</a> BioRxiv. , at https://www.biorxiv.org/content/10.1101/399774v1.abstract (2018).</li>
<li>Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+resolving+proteomes+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Towards resolving proteomes in single cells.</a> Nature Methods. 18 (8), 856(2021).</li>
<li>Huffman, R. G., Chen, A., Specht, H., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DO-MS%3A+Data-driven+optimization+of+mass+spectrometry+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">DO-MS: Data-driven optimization of mass spectrometry methods.</a> Journal of Proteome Research. 18 (6), 2493-2500 (2019).</li>
<li>Chen, A. T., Franks, A., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DART-ID+increases+single-cell+proteome+coverage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">DART-ID increases single-cell proteome coverage.</a> PLoS Computational Biology. 15 (7), 1007082(2019).</li>
<li>Cheung, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+carrier+proteome+limit+for+single-cell+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Defining the carrier proteome limit for single-cell proteomics.</a> Nature Methods. 18 (1), 76-83 (2021).</li>
<li>Leduc, A., Huffman, R. G., Slavov, N. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.04.24.441211v4.article-info">Droplet sample preparation for single-cell proteomics applied to the cell cycle.</a> bioRxiv. , https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.04.24.441211v1.abstract (2021).</li>
<li>Vanderaa, C., Gatto, L. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/14789450.2021.1988571">Utilizing Scp for the analysis and replication of single-cell proteomics data.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Een van de sleutels tot succesvolle voorbereiding en analyse van afzonderlijke cellen door SCoPE2 is de voorbereiding van de drager en referentiekanalen. De voorgestelde dragergrootte is 100 tot 200 cellen; het aantal cellen dat nodig is voor een bepaald eencellig experiment kan echter worden bepaald op basis van principes zoals elders besproken21. Voor de voorgestelde grootte zijn ten minste ~ 11.275 cellen nodig per 384-well plaat, waardoor een 200-cel drager en 5-cel referentie in elke set mogelijk is. Het kan voordelig zijn om meer cellen te isoleren als de gewenste celpopulaties geen beperkende factor zijn, om gewoon extra materiaal te hebben in geval van fouten (zoals in dit protocol werd gedaan, waarbij 22.000 cellen worden geïsoleerd in plaats van 11.275 cellen). De hoeveelheid drager en referentie die nodig is voor het aantal gewenste platen moet in één batch worden bereid om elke batch-tot-batchvariatie te minimaliseren die ertoe kan leiden dat peptide-identificatie of kwantificering tussen batches verschilt.
Voordat u enkele cellen isoleert in putten van een 384-well plaat, is het belangrijk om het ontwerp van de plaatlay-out te overwegen. Binnen elke 384-well plaat wordt aanbevolen om zowel positieve als negatieve controles te implementeren. Negatieve controles zijn putten waarin geen cellen worden toegevoegd, maar dezelfde reagenstoevoegingen en procedures ondergaan als de eencellige putten. Positieve controles zijn putten waarin cellysaat verdund tot 2-5 cellen / μL wordt toegevoegd in plaats van enkele cellen. Dit is vooral belangrijk om te implementeren wanneer eencellige isolatiemethoden niet goed gevalideerd zijn. Elke 384-well plaat zou idealiter een gerandomiseerde verdeling van enkele cellen en controles moeten hebben (bijvoorbeeld geen negatieve of positieve controles in slechts één rij). Elke plaat moet een gelijke verdeling hebben van alle celpopulaties van belang, in plaats van het isoleren van één celtype in één plaat en een tweede celtype in een tweede plaat. Dit voorkomt dat batcheffecten worden gekoppeld aan celtypen van belang. Bovendien, als er meer dan één 384-well plaat nodig is voor analyse, is het raadzaam om cellen in één sessie te isoleren, in plaats van de isolatiestap over meerdere dagen te spreiden, indien mogelijk.
Lysis van zowel enkele cellen als drager/referentie vindt plaats in water via een vrieswarmtecyclus23. Verwacht wordt dat de meeste proteasen tijdens deze stap zijn gedenatureerd. Trypsine wordt dan onmiddellijk na de denaturatiestap toegevoegd in een hoge concentratie, vele ordes van grootte groter in concentratie dan zelfs de meest voorkomende cellulaire proteasen. Door massale actie zullen de meeste producten van protease-activiteit te wijten zijn aan trypsine.
Reductie/alkylering van cysteïneresiduen wordt in dit protocol niet uitgevoerd vóór trypsinevertering. Cysteïnebevattende peptiden vertegenwoordigen ongeveer 10% van de tryptische peptiden uit het menselijke proteoom. We zien minder cysteïnebevattende peptiden met behulp van een aanpak zonder reductie / alkylering. Deze stappen gebruiken reagentia die niet compatibel zijn met etikettering door TMT (NHS-esterchemie) onmiddellijk na de spijsvertering.
In deze TMT-etiketteringsstrategie worden de drager en referenties gelabeld met respectievelijk 126 en 127N, terwijl eencellige en controleputten worden gelabeld met 128C tot en met 135N. De twee labels na de referentie, 127C en 128N, worden niet gebruikt vanwege isotopische kruisbesmetting als gevolg van de drager en referentiekanalen, die duidelijk veel overvloediger zijn in peptidemateriaal dan de afzonderlijke cellen. In totaal zijn er 12 TMT-kanalen per set die kunnen worden gebruikt voor het labelen van afzonderlijke cellen of controleputten met TMTpro-16plex, of 14 TMT-kanalen per set met TMTpro-18plex.
De kritieke stappen in het protocol om eencellige proteomics-metingen uit te voeren met behulp van dit protocol omvatten voorbereiding van de drager, eencellige isolatie, lysis, spijsvertering, barcode-etikettering en de juiste massaspectrometrieparameters. Deze stappen zijn in dit document beschreven en zijn elders uitgebreid beschreven 17,21,25. Elke stap heeft een overeenkomstig perceel of set percelen in DO-MS die een eenvoudige kwaliteitscontrole mogelijk maken. In het geval van een succesvolle creatie van de drager, maken plots met het aantal geïdentificeerde peptiden, de etiketteringsefficiëntie en het percentage miscleavage-snelheid bijvoorbeeld verificatie van de succesvolle bereiding mogelijk. Representatieve DO-MS-rapporten zijn opgenomen in deze publicatie en zijn te zien op http://scope2.slavovlab.net/ voor de oorspronkelijke gegevens16. Deze DO-MS-rapporten maken het mogelijk om de optimalisatie van de methode te beoordelen in richtingen die nog niet door de auteurs zijn onderzocht, zoals langere LC-gradiënten, verschillende spijsverteringsenzymen of alternatieve chemische barcodes.
Momenteel beperkt de seriële analyse van peptiden door gegevensafhankelijke acquisitie-algoritmen het aantal peptiden dat kan worden geanalyseerd in een LC-run van een redelijke lengte. Dit is deels te wijten aan de langere vultijden die nodig zijn voor de succesvolle verwerving van voldoende ionen voor betrouwbare eencellige kwantificering21. Een inherente beperking van het gebruik van de drager is het gebrek aan directe beoordeling van de spijsvertering en etiketteringsefficiëntie van de afzonderlijke cellen. Momenteel is een oplossing voor deze beperking het uitvoeren van kwaliteitscontrole op een groter monster dat naast de afzonderlijke cellen wordt verwerkt.
We stelden een aantal mogelijkheden voor om eencellige proteomics te verbeteren, zoals het bouwen van massaspectrometers met meerdere analyzers. De huidige methode maakt de kwantificering mogelijk van duizenden eiwitten uit afzonderlijke zoogdiercellen met een snelheid van ongeveer 100 cellen per dag met in de handel verkrijgbare reagentia en apparatuur. SCoPE2, de tweede generatie van de SCoPE-MS-benadering, verbeterde aanzienlijk ten opzichte van zijn voorganger met betrekking tot het aantal cellen dat per tijdseenheid kan worden geanalyseerd, het aantal eiwitten dat per tijdseenheid kan worden geanalyseerd, de tijd die nodig is voor monstervoorbereiding, de toegankelijkheid van reagentia en apparatuur, en de totale kosten van voorbereiding en analyse per enkele cel. Membraangebonden eiwitten zijn toegankelijk met behulp van de vrieswarmtelyse en proteasevertering, zoals blijkt uit vergelijking met ureumlysis23. De methode identificeert veel eiwitten uit het bovenste derde deel van het proteoom met betrekking tot abundantie16. Als de gemodificeerde proteoform zich in het bovenste derde deel van het proteoom bevindt en het gemodificeerde peptide vatbaar is voor massaspectrometrie-analyse (ioniseert goed, heeft een massaverschil met ongewijzigd peptide), zal het waarschijnlijker ontvankelijk zijn voor dit protocol. Deze methode kan vruchtbaar worden toegepast in biologische systemen waar sprake is van betekenisvolle heterogeniteit tussen cellen, zoals in differentiatie, senescentie of immunologische reacties (d.w.z. fagocytose).

Eencellige analyse wordt veel gebruikt om het niveau van heterogeniteit binnen biologische systemen te bestuderen dat anders niet te onderscheiden zou zijn door bulkmetingen 1,2,3. Een dergelijke cellulaire diversiteit kan functionele gevolgen hebben die het begrip van integrale biologische processen kunnen bevorderen, van therapeutische resistentietegen kankercellen 4,5,6 tot cel-tot-cel heterogeniteit bij diabetes 7,8,9,10. Veel onderzoeken hebben zich gericht op het meten van nucleïnezuren in afzonderlijke cellen, door genetische of transcriptomische niveaus te meten en hebben de classificatie van celtypen en -toestanden mogelijk gemaakt. Een dergelijke vooruitgang in de nucleïnezuurruimte kan echter niet de kenniskloof van post-transcriptionele regulatieopvullen 11, waardoor de behoefte aan eiwitmetingen met vergelijkbare hoge doorvoer in enkele cellen 12,13,14,15 wordt gestimuleerd.
We hebben SCoPE216,17 ontwikkeld om tegemoet te komen aan de vraag naar rigoureuze en robuuste eencellige proteomica van zoogdiersystemen. Het is een multiplexmethode, die een verhoogde doorvoer mogelijk maakt door veel cellen parallel18 te labelen en te analyseren, in tegenstelling tot labelvrije mthods die één cel tegelijk analyseren19,20. De monstervoorbereidingsmethodologie, massaspectrometriebenadering en daaropvolgende gegevensanalysestappen maken een nauwkeurige kwantificering van honderden tot duizenden eiwitten per enkele cel mogelijk. Deze methode maakt massaspectrometrie-analyse van enkele cellen mogelijk via de isobare drager21, een klein bulkmonster van cellen (meestal 25-200) dat biologisch vergelijkbaar is met de eencellige populatie van belang. Dit dragermateriaal wordt gemultiplext in een set met een referentiekanaal van hetzelfde materiaal en enkele cellen door het gebruik van tandemmassatags (TMT-labels). Het dragerkanaal vermindert het verlies van monsters naar oppervlakten en biedt de ionenbackbonefragmenten voor succesvolle peptide-identificatie. Het referentiekanaal, dat in bulk wordt bereid en vervolgens wordt verdund tot 5-10 celequivalenten voor elke eencellige set, helpt de technische variabiliteit in de analyse te beheersen. In het bijzonder maakt de referentie de normalisatie mogelijk van variabiliteit veroorzaakt door LC-MS / MS-gerelateerde effecten, zoals ionenbemonstering en ionisatie-efficiëntie. Meestal worden de referentie en de dragerkanalen gemaakt van dezelfde celpopulatie.
Dit monstervoorbereidingsprotocol is een methode van de tweede generatie die voortbouwt op SCoPE-MS22 door meerdere synergetische verbeteringen. De verbeteringen omvatten een cellysismethode die het opruimen van monsters vermijdt, wat een veel voorkomende stap is van MS-proteomics-preparaten. Het maakt gebruik van mPOP (minimale proteomic sample preparation)23, een vrieswarmtelysismethode. Deze methode maakte lysis van enkele cellen in kleinere volumes en in multiwell-platen mogelijk in plaats van in flacons, waardoor een hogere doorvoersnelheid en automatisering door thermische cyclers mogelijk werd. Al met al heeft deze methode de kosten per enkele cel verlaagd en de kwantitatieve nauwkeurigheid verhoogd in vergelijking met SCoPE-MS16,24.
Dit protocol beschrijft hoe afzonderlijke cellen moeten worden voorbereid voor proteomische analyse, inclusief hoe de drager- en referentiekanalen kunnen worden voorbereid met behulp van TMTpro 18-plex isobare labels. Zoogdiercellen die zich in eencellige suspensie bevinden en die kunnen worden geïsoleerd in platen met 384 putten, zijn waarschijnlijk vatbaar voor dit protocol. Ook inbegrepen zijn representatieve resultaten van succesvolle eencellige sets, die verschillende kwaliteitscontroleplots weergeven die zijn gegenereerd door een R Shiny-app, DO-MS25. Andere gepubliceerde softwaretools26,27 en experimentele richtlijnen17,21 hebben de adoptie van dit protocol verbeterd. We hopen dat deze visuele gids onderzoekers verder zal helpen bij het uitvoeren van eencellige proteomics-experimenten.

```html
<table><tbody><tr><td>384-well plate, standard PCR plate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB1384</td><td>Polypropyleen platen moeten worden gebruikt, indien vervanging nodig is. Indien vervangen, moeten de niveaus van potentiële polymeerbesmetting van andere platen worden beoordeeld vóór SCoPE2-voorbereiding.</td></tr><tr><td>Acetonitrile (voor bereiding van buffers), Optima LC-MS/MS grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-1</td><td>Deze acetonitrile wordt gebruikt voor alle buffers, namelijk de 50% acetonitrile die wordt gebruikt om door de wells te gaan na het passeren door de drager en referentie bij het combineren van SCoPE2-sets. Waarschuwing: Acetonitrile is een ontvlambare vloeistof. Het kan de huid, ogen, ademhalingswegen en centraal zenuwstelsel irriteren. Zorg ervoor dat u persoonlijke beschermingsmiddelen draagt. Behandel onder een chemische afzuigkap.</td></tr><tr><td>Acetonitrile (voor bereiding van TMT), watervrij, 99,8%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>271004-100ML</td><td>Deze acetonitrile wordt gebruikt om TMT-labels op de concentratie van de fabrikant op te schorsen. Waarschuwing: Acetonitrile is een ontvlambare vloeistof. Het kan de huid, ogen, ademhalingswegen en centraal zenuwstelsel irriteren. Zorg ervoor dat u persoonlijke beschermingsmiddelen draagt. Behandel onder een chemische afzuigkap.</td></tr><tr><td>Kleefbare PCR-plaatfolie</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB0626</td><td></td></tr><tr><td>Autosampler fles schroefdraad doppen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C5000-51B</td><td></td></tr><tr><td>Autosampler fles spinner (bijv. myFuge 5)</td><td>MTC Bio</td><td>C2595</td><td>Dit model heeft geen snelheidsregeling. Het wordt gewoon gebruikt om vloeistof aan de onderkant van autosamplerflessen te verzamelen.</td></tr><tr><td>Benzonase nuclease</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1014-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Doorzichtige glazen schroefdraad flessen, 9 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60180-509</td><td></td></tr><tr><td>Mierenzuur, Pierce, LC-MS/MS grade</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85178</td><td>Waarschuwing: Mierenzuur is een ontvlambare vloeistof. Het kan ernstige oogbeschadiging of huidverbranding veroorzaken. Zorg ervoor dat u persoonlijke beschermingsmiddelen draagt. Behandel in een goed geventileerde ruimte.</td></tr><tr><td>Glazen autosampler inzetstukken, 9 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C4010-630</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxylamine (HA), 50% wt/vol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>467804-50ML</td><td>Waarschuwing: Hydroxylamine kan huidirritatie veroorzaken. Zorg ervoor dat u persoonlijke beschermingsmiddelen draagt.</td></tr><tr><td>Mantis microfluïdische chips, laagvolume 3PFE-chips</td><td>Formulatrix</td><td>MCLVPR2</td><td>Deze chips zijn bedoeld om te worden gebruikt met de Mantis microfluïdische vloeistofdispenser om organische oplossingen te verdelen. Deze kunnen worden gebruikt om TMT-labels te verdelen.</td></tr><tr><td>Mantis microfluïdische chips, laagvolume siliconen chips</td><td>Formulatrix</td><td>MCLVS12</td><td>Deze chips zijn bedoeld om te worden gebruikt met de Mantis microfluïdische vloeistofdispenser om waterige oplossingen te verdelen. Deze kunnen niet worden gebruikt om TMT-labels te verdelen.</td></tr><tr><td>Mantis microfluïdische vloeistofdispenser</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>De vloeistofdispenser kan worden vervangen. Het is echter belangrijk om te controleren of het systeem compatibel is met 100% acetonitrile (zoals in het geval van TMT-labels), en dat het systeem geen polymeerbesmetting of andere vorm van besmetting in de monsters introduceert.</td></tr><tr><td>Mantis PCR-plaatadapter met brede kegelvormige pinnen voor geautomatiseerde plaatverwerking</td><td>Formulatrix</td><td>232400</td><td></td></tr><tr><td>MassPREP peptide mengsel</td><td>Waters</td><td>186002337</td><td>Mengsel van negen nontryptische peptiden</td></tr><tr><td>PCR buis spinner (bijv. 16-plaats microcentrifuge voor 0,2 mL buizen)</td><td>USA Scientific</td><td>2621-0016</td><td>Dit model heeft geen snelheidsregeling. Het wordt gewoon gebruikt om vloeistof aan de onderkant van buizen te verzamelen.</td></tr><tr><td>PCR buizen: TempAssure 0,2 mL PCR 8-buis strips</td><td>USA Scientific</td><td>1402-3900</td><td>Als vervangen, moeten de niveaus van potentiële polymeerbesmetting van andere platen worden beoordeeld vóór SCoPE2-voorbereiding.</td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), 10x, pH 7,4, RNase-vrij</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Plaat spinner (bijv. PlateFuge microcentrifuge)</td><td>Benchmark Scientific</td><td>Model C2000</td><td>Dit model heeft geen snelheidsregeling. Het wordt gewoon gebruikt om vloeistof aan de onderkant van wells te verzamelen.</td></tr><tr><td>Thermische cycler (bijv. C1000 Touch met 384-well module)</td><td>Biorad</td><td>1851138</td><td></td></tr><tr><td>TMTpro 16plex Label Reagent Set, 1 x 5 mg</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A44520</td><td></td></tr><tr><td>Triethylammoniumbicarbonaat (TEAB), 1 M, pH 8,5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7408100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine Gold Mass Spectrometry Grade</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td>Dit trypsine is van zeer hoge zuiverheid. Andere trypsine reagentia kunnen variëren in hun zuiverheidsniveaus. Het zuiverheidsniveau is belangrijk om positieve SCoPE2-resultaten te bereiken. Waarschuwing: Trypsine kan huid-, ademhalings- en oogirritatie veroorzaken. Zorg ervoor dat u persoonlijke beschermingsmiddelen draagt. Behandel onder een chemische afzuigkap.</td></tr><tr><td>Vortex (Analoge vortexmixer)</td><td>VWR</td><td>Model 58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Waterbad sonicator (bijv. 2,8 L ultrasoonreiniger met digitale timer)</td><td>VWR</td><td>97043964</td><td></td></tr><tr><td>Water, Optima LC-MS/MS grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-1</td><td>Alle oplossingen die verdund of gemaakt moeten worden, worden aanbevolen om gemaakt te worden met water van massaspectrometrie-kwaliteit. Alle verdunnings- en/of mastermixen moeten vers worden gemaakt. Besmetting als gevolg van lager kwaliteitswater kan de peptidedetectie en de kwaliteit van single-cell gegevens negatief beïnvloe

eencellige proteomics voorbereiding voor massaspectrometrie-analyse met behulp van freeze-heat lysis en een isobare drager

Single-Cell Proteomics Preparation for Mass Spectrometry Analysis Using Freeze-Heat Lysis and an Isobaric Carrier

Eencellige proteomics-analyse vereist gevoelige, kwantitatief nauwkeurige, breed toegankelijke en robuuste methoden. Om aan deze vereisten te voldoen, is het Single-Cell ProtEomics (SCoPE2) -protocol ontwikkeld als een methode van de tweede generatie voor het kwantificeren van honderden tot duizenden eiwitten uit beperkte monsters, tot op het niveau van een enkele cel. Experimenten met deze methode hebben meer dan 3.000 eiwitten gekwantificeerd in 1.500 enkele zoogdiercellen (500-1.000 eiwitten per cel) in 10 dagen massaspectrometerinstrumenttijd. SCoPE2 maakt gebruik van een vrieswarmtecyclus voor cellyse, waardoor de noodzaak voor het opruimen van afzonderlijke cellen wordt vermeden en bijgevolg monsterverliezen worden verminderd, terwijl de monstervoorbereiding wordt versneld en de automatisering ervan wordt vereenvoudigd. Bovendien maakt de methode gebruik van een isobare drager, die de identificatie van eiwitten bevordert en monsterverliezen vermindert.
Dit videoprotocol biedt gedetailleerde richtlijnen om de toepassing van geautomatiseerde eencellige eiwitanalyse mogelijk te maken met alleen apparatuur en reagentia die breed toegankelijk zijn. We demonstreren kritieke stappen in de procedure voor het voorbereiden van afzonderlijke cellen voor proteomische analyse, van oogsten tot injectie tot vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS / MS) analyse. Bovendien worden kijkers geleid door de principes van experimenteel ontwerp met de isobare drager, kwaliteitscontrole voor zowel isobare drager als eencellige preparaten, en representatieve resultaten met een bespreking van de beperkingen van de aanpak.

Positieve resultaten van het protocol houden in dat wordt gecontroleerd of een aantal kritieke stappen in het protocol met succes zijn uitgevoerd; deze omvatten de voorbereiding van de drager, eencellige isolatie, lysis, spijsvertering, barcode-etikettering en MS-parameteroptimalisatie. DO-MS-plots maken het gemakkelijk om de voltooiing van elke kritieke stap in het protocol te beoordelen. Een succesvol bereide drager, die meestal overeenkomt met 25 en 200 cellen in hoeveelheid (per set), is goed verteerd en goed gelabeld. Plots van DO-MS maken het mogelijk om de intensiteit van het monster te kwantificeren (om de hoeveelheid te schatten), de verteringsefficiëntie (idealiter <25% miscleavages) en de etiketteringsefficiëntie (moet worden >99%). Het meest kritieke is dat dragermonsters die niet volledig zijn gelabeld, de kruisreactie met de barcodes die bedoeld zijn voor enkele cellen mogelijk maken en een vals signaal toevoegen aan de kwantificering van eencellige peptiden.
Negatieve controleputten omvatten alle experimentele reagentia, maar missen een cel. Hierdoor kan niet alleen achtergrondgeluid worden beoordeeld, maar kan ook de efficiëntie van celisolatie worden bepaald door een representatief signaal van een lege put te geven. Het DO-MS-rapport biedt plots om het gemeten signaal van de controleput naast de eencellige putten te beoordelen om het succes van celisolatie en achtergrondgeluid te bepalen. Daarnaast kan de kwaliteit van kwantificering worden beoordeeld met behulp van de SCoPE2-pijplijn (beschikbaar op GitHub: github.com/SlavovLab/SCoPE2) of het SCP Bioconductor-pakket29.
De verterings- en etiketteringsefficiëntie van de afzonderlijke cellen wordt misschien niet direct getest zoals bij de drager, maar DO-MS biedt opnieuw plots die de schatting van de vertering en etiketteringsefficiëntie mogelijk maken. Door een controle van 100-200 cellen op te nemen naast de voorbereiding van de afzonderlijke cellen (d.w.z. dezelfde reagenstoevoegingen ontvangen), kunnen de verterings- en etiketteringsefficiënties voor die controle worden beoordeeld en worden verondersteld te worden gedeeld door de afzonderlijke cellen die ernaast zijn bereid. Een slechte spijsvertering wordt aangegeven door een hoge verhouding van de intensiteit van miscleaved peptiden tot hun volledig gespleten tegenhangers (figuur 1).
Een andere factor om te overwegen in de sets is de fractie van ontbrekende gegevens en de mediane intensiteit van de reporterionen in elk TMT-kanaal (figuur 2). Wanneer afzonderlijke cellen met succes worden voorbereid, is de hoeveelheid ontbrekende gegevens per cel en positieve controle veel lager dan in negatieve controlemonsters. Evenzo is de mediane intensiteit van precursoren veel hoger in afzonderlijke cellen en positieve controles dan bij negatieve controles. De optimalisatie van MS-parameters is elders uitgebreid besproken21, en optimale parameters kunnen worden bepaald met behulp van tools zoals DO-MS of SCP Companion25,27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63802/63802fig01.jpg"> Figuur 1: Kwaliteitscontrole van de dragervoorbereiding. DO-MS-plots die (A) etiketteringsefficiëntie van een succesvol bereide drager op plaatsen van etikettering met TMT weergeven: het primaire amine aan de zijketen van lysine en het peptide N-terminus, en (B) de verteringsefficiëntie bij aminozuurresiduen van tryptische splitsing. Afkorting: TMT = tandem mass tag. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63802/63802fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63802/63802fig02.jpg"> Figuur 2: Kwaliteitscontrole van de eencellige bereiding. DO-MS-plots die (A) de fractie van ontbrekende gegevens in afzonderlijke cellen (C5-10), controles (C13,16), drager (C1) en referentie (C2) en (B) de intensiteit van afzonderlijke cellen en controles weergeven. Tags 127C, 128N, 131C, 132N, 133N en 133C, die overeenkomen met C3, C4, C11, C12 en C15, zijn ongebruikt in deze specifieke set. De positieve controle bestaat uit cellulair materiaal dat in bulk wordt verwerkt tot peptiden en vervolgens wordt verdund tot een niveau van 2-5 cellen / μL voorafgaand aan etikettering. De negatieve controle bestaat uit een put onderworpen aan alle voorbereidende stappen die worden gebruikt voor enkele cellen, alleen zonder de toevoeging van een enkele cel. Afkorting: TMT = tandem mass tag. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63802/63802fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

In dit protocol beschrijven we hoe zoogdiercellen kunnen worden voorbereid op eencellige proteomics-analyse via massaspectrometrie met behulp van in de handel verkrijgbare reagentia en apparatuur, met opties voor zowel handmatig als automatisch pipetteren.

Eencellige proteomics voorbereiding voor massaspectrometrie-analyse met behulp van freeze-heat lysis en een isobare drager

Single-cell proteomics analysis requires sensitive, quantitatively accurate, widely accessible, and robust methods. To meet these requirements, the ...

SCoPE2 kan duizenden eiwitten kwantificeren uit duizenden cellen van enkele zoogdieren zonder antilichamen. Dit protocol kan helpen bij het blootleggen van proteoom heterogeniteit die anders onzichtbaar zou zijn voor bulkanalyses. Single cell proteomics, met behulp van de SCoPE2-benadering, is ontworpen om toegankelijk te zijn voor onderzoekers met een scala aan middelen, van slechts een pipet tot vloeistofbehandelingsrobotica.SCoPE2 is breed toepasbaar op veel onderzoeksgebieden, waaronder kanker en immunologie, door inzicht te geven in hoe eiwitten in overvloed verschillen tussen afzonderlijke cellen uit dezelfde populatie. Om te beginnen, start de cellyseprocedure door een 384-well plaat met gesorteerde enkele cellen in de thermische cycler te plaatsen, deze gedurende 10 minuten te verwarmen bij 90 graden Celsius gevolgd door afkoeling bij 12 graden Celsius. Draai de plaat kort naar beneden in een benchtop plate spinner bij 18 tot 22 graden Celsius.Soniceer de plaat gedurende vijf minuten in een waterbad sonicator bij 18 tot 22 graden Celsius. Leg het vervolgens op ijs. Om verder te gaan met trypsinevertering, bereidt u 100 microliter van de mastermix en voegt u 0,2 microliter van de mastermix toe aan elke put van de 384-well-plaat met behulp van een vloeibare handler.Sluit de plaat, vortex gedurende vijf seconden af en draai af in een benchtop plate spinner bij 18 tot 22 graden Celsius. Verwarm de 384-well plaat gedurende drie uur op 37 graden Celsius met de dekseltemperatuur ingesteld op 52 graden Celsius. Om een tandem mass tagging reactie in te stellen, neem je de 85 millimol voorraden tandem massa tags uit de minus 80 graden Celsius vriezer.Voordat u ze opent, verwarmt u de buizen tot kamertemperatuur en verdunt u de etiketten tot 22 millimol in watervrij acetonitril. Gebruik deze etiketteringsstrategie om 0,5 microliter verdunde tandemmassalabels toe te voegen aan elke put van de 384-wellplaat, met behulp van een vloeistofdoseerrobot of een handmatige pipet. Sluit de plaat, vortex gedurende vijf seconden af en draai af in een benchtop plate spinner bij 18 tot 22 graden Celsius.Laat de etiketteringsreactie een uur lang doorgaan bij 18 tot 22 graden Celsius. Voeg voor het blussen van tandemmassalabelreactie 0,2 microliter 0,5% hydroxylamine, verdund in HPLC-water, toe aan elke put van de 384-wellplaat met behulp van een vloeistofhandler. Sluit de plaat, vortex gedurende vijf seconden af en draai af in een benchtop plate spinner voordat je de plaat gedurende 30 minuten op 18 tot 22 graden Celsius houdt.De LC-MS-analysevoorbereiding wordt gestart door de gecombineerde drager of het referentiemateriaal uit de vriezer van min 80 graden Celsius te verwijderen. Voor elke set pipetteer je één microliter drager en referentiemateriaal in de eerste put, die deel uitmaakt van een enkele set. Pipetteer het volledige volume van de eerste put naar de volgende put.Blijf het volledige volume van de ene put naar de volgende pipetteren totdat alle putten in een enkele set zijn gecombineerd in de uiteindelijke put. Voeg voor elke set vijf microliter 50% acetonitril verdund in water van HPLC-kwaliteit toe voor de eerste eencellige put die in elke set wordt opgenomen. Pipetteer het volledige volume van de eerste put naar de volgende put.Ga door met het pipetteren van het volledige volume van de ene cel naar de volgende, totdat alle putten in een enkele set zijn gecombineerd in de uiteindelijke put. Breng nu elke set over in hun autosampler glazen inzetstukken. Droog de monsters zodra alle sets zijn gecombineerd en in glazen inzetstukken zijn geplaatst.Voeg voorafgaand aan de LC-MS-MS-analyse 1,2 microliter mierenzuur toe aan elke set om de gelabelde peptiden te resuspenderen. Plaats de autosampler-inzetstukken in glazen autosampler-injectieflacons en sluit elk monster met een dop. Vortex elke injectieflacon gedurende vijf seconden om ervoor te zorgen dat de resuspensie voltooid is en draai vervolgens in een injectieflaconspinner bij 18 tot 22 graden Celsius.Zorg ervoor dat elk monster zich aan de onderkant van de insert bevindt in plaats van aan de zijkanten te spatten. Plaats de injectieflacons in de autosampler-lade en injecteer voor elke set een monster van één microliter voor LC-MS-MS-analyse. De verterings- en etiketteringsefficiëntie van de afzonderlijke cellen wordt mogelijk niet direct getest zoals bij de drager, maar DO-MS-software biedt plots die de efficiëntie van de spijsvertering en etikettering schatten.Slechte spijsvertering wordt aangegeven door een hoge verhouding van de intensiteit van miscleaved peptiden tot hun volledig gespleten tegenhangers. Een andere factor om te overwegen in de sets is de fractie van ontbrekende gegevens in de mediane ionenintensiteit van de reporter in elk tandem massa tagging kanaal. Wanneer afzonderlijke cellen met succes worden voorbereid, zijn ontbrekende gegevens per cel en positieve controle veel lager dan negatieve controlemonsters.Zorgvuldige vloeistofbehandeling tijdens de LC-MS-MS-monstervoorbereiding is van cruciaal belang voor maximaal herstel van peptiden. Kleine monsters van ongeveer 100 picogram tot 100 nanogram per put kunnen worden voorbereid voor proteomics-analyse met behulp van een isobare drager. SCoPE2 maakt eencellige proteomics-metingen toegankelijk voor onderzoekers over de hele wereld door alleen gangbare reagentia en commercieel beschikbare apparatuur te gebruiken.Het is vatbaar voor handmatige verwerking of automatisering met hoge doorvoer door robotische vloeistofbehandeling.

single-cell-proteomics-preparation-for-mass-spectrometry-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol is voor de extractie en concentratie van eiwitten en DNA uit microbiële biomassa die is verzameld uit zeewater, gevolgd door de generatie van tryptische peptiden die geschikt zijn voor proteomische analyse op basis van tandem massaspectrometrie.

Een Aquatic Microbial MetaProteomics Workflow: Van cellen tot Tryptic Peptiden geschikt voor Tandem massaspectrometrie-gebaseerde Analyse

Dit protocol beschrijft hoe absolute kwantificeringsanalyses van doeleiwitten binnen complexe biologische monsters kunnen worden uitgevoerd met behulp van geselecteerde reactiebewaking. Het werd gebruikt om eiwitten van de muis macrofaag chemotaxis signaleringsroute nauwkeurig te kwantificeren. Selectie van doelpeptiden, ontwikkeling van analyses en kwalitatieve en kwantitatieve analyses worden in detail beschreven.

Geselecteerde Reaction Monitoring Massaspectrometrie voor Absolute Protein kwantificering

Een protocol voor de uitgebreide extractie van lipiden, metabolieten en eiwitten uit biologische weefsels met behulp van een monster wordt gepresenteerd.

Een eenvoudige gefractieerde extractie methode voor de uitgebreide analyse van metabolieten, lipiden en proteïnen uit een enkele monster

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Hier beschrijven we een op massaspectrometrie gebaseerde proteomische karakterisering van cellijnen met bekende weefsellotgevallen in het gewervelde Xenopus laevis-embryo .

Cel-Lineage geleide massaspectrometrie proteomics in het zich ontwikkelende (kikker) embryo

Hier beschrijven we een proteomics workflow voor de karakterisering van het celoppervlakteproteoom van verschillende celtypen. Deze workflow omvat verrijking van celoppervlakte-eiwitten, daaropvolgende monstervoorbereiding, analyse met behulp van een LC-MS/MS-platform en gegevensverwerking met gespecialiseerde software.

"Celoppervlakvangst"-werkstroom voor labelvrije kwantificering van het celoppervlak-proteoom

Er wordt een gedetailleerd protocol opgesteld voor het reinigen en hergebruiken van ultracentrifugebuisjes van polycarbonaat om extracellulaire blaasjesisolatie uit te voeren die geschikt is voor proteomics-experimenten.

Hergebruik van polycarbonaat ultracentrifugebuis in proteomische analyses van extracellulaire blaasjes

Hier stellen we een op massaspectrometrie gebaseerde proteomische methode op met behulp van geïsoleerde interessegebieden in formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties. Dit protocol wordt gebruikt om proteoom te analyseren van specifieke weefselgebieden in gearchiveerde, in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties.

Een gestroomlijnde aanpak voor proteomics op basis van massaspectrometrie met behulp van geselecteerde weefselregio's

Dit protocol heeft tot doel celmetabolieten te behouden voor eencellige massaspectrometrie (SCMS) door het wassen van vluchtige zoutoplossingen, het snel afschrikken van vloeibare stikstof, vriesdrogen en opslag van -8 °C te combineren. Het toont aan dat het afschrikken van vloeibare stikstof essentieel is voor het behoud van metabolietprofielen, terwijl langdurige koude opslag tot een minimum moet worden beperkt om metabole veranderingen te voorkomen.

Monstervoorbereiding voor eencellige massaspectrometrie Metabolomics-onderzoeken: gecombineerd cellenwassen, afschrikken, drogen en bewaren

Deze video toont de voorbereiding van een ultra-dunne matrix / analyt laag voor het analyseren van peptiden en eiwitten door Matrix-assisted laser desorptie ionisatie massaspectrometrie (MALDI-MS).

MALDI Monstervoorbereiding: de Ultra Thin Layer methode

Leer eencellige proteomics voorbereiding met SCoPE2 en massaspectrometrie-analyse. Deze methode kwantificeert duizenden eiwitten uit individuele zoogdiercellen zonder antilichamen, waardoor proteoomheterogeniteit zichtbaar wordt voor kanker- en immunologieonderzoek.

Eencellige proteomics voorbereiding voor massaspectrometrie-analyse met behulp van freeze-heat lysis en een isobare drager

Meer video's verkennen