Eencellige proteomics voorbereiding voor massaspectrometrie-analyse met behulp van freeze-heat lysis en een isobare drager

SCoPE2 kan duizenden eiwitten kwantificeren uit duizenden cellen van enkele zoogdieren zonder antilichamen. Dit protocol kan helpen bij het blootleggen van proteoom heterogeniteit die anders onzichtbaar zou zijn voor bulkanalyses. Single cell proteomics, met behulp van de SCoPE2-benadering, is ontworpen om toegankelijk te zijn voor onderzoekers met een scala aan middelen, van slechts een pipet tot vloeistofbehandelingsrobotica.

SCoPE2 is breed toepasbaar op veel onderzoeksgebieden, waaronder kanker en immunologie, door inzicht te geven in hoe eiwitten in overvloed verschillen tussen afzonderlijke cellen uit dezelfde populatie. Om te beginnen, start de cellyseprocedure door een 384-well plaat met gesorteerde enkele cellen in de thermische cycler te plaatsen, deze gedurende 10 minuten te verwarmen bij 90 graden Celsius gevolgd door afkoeling bij 12 graden Celsius. Draai de plaat kort naar beneden in een benchtop plate spinner bij 18 tot 22 graden Celsius.

Soniceer de plaat gedurende vijf minuten in een waterbad sonicator bij 18 tot 22 graden Celsius. Leg het vervolgens op ijs. Om verder te gaan met trypsinevertering, bereidt u 100 microliter van de mastermix en voegt u 0,2 microliter van de mastermix toe aan elke put van de 384-well-plaat met behulp van een vloeibare handler.

Sluit de plaat, vortex gedurende vijf seconden af en draai af in een benchtop plate spinner bij 18 tot 22 graden Celsius. Verwarm de 384-well plaat gedurende drie uur op 37 graden Celsius met de dekseltemperatuur ingesteld op 52 graden Celsius. Om een tandem mass tagging reactie in te stellen, neem je de 85 millimol voorraden tandem massa tags uit de minus 80 graden Celsius vriezer.

Voordat u ze opent, verwarmt u de buizen tot kamertemperatuur en verdunt u de etiketten tot 22 millimol in watervrij acetonitril. Gebruik deze etiketteringsstrategie om 0,5 microliter verdunde tandemmassalabels toe te voegen aan elke put van de 384-wellplaat, met behulp van een vloeistofdoseerrobot of een handmatige pipet. Sluit de plaat, vortex gedurende vijf seconden af en draai af in een benchtop plate spinner bij 18 tot 22 graden Celsius.

Laat de etiketteringsreactie een uur lang doorgaan bij 18 tot 22 graden Celsius. Voeg voor het blussen van tandemmassalabelreactie 0,2 microliter 0,5% hydroxylamine, verdund in HPLC-water, toe aan elke put van de 384-wellplaat met behulp van een vloeistofhandler. Sluit de plaat, vortex gedurende vijf seconden af en draai af in een benchtop plate spinner voordat je de plaat gedurende 30 minuten op 18 tot 22 graden Celsius houdt.

De LC-MS-analysevoorbereiding wordt gestart door de gecombineerde drager of het referentiemateriaal uit de vriezer van min 80 graden Celsius te verwijderen. Voor elke set pipetteer je één microliter drager en referentiemateriaal in de eerste put, die deel uitmaakt van een enkele set. Pipetteer het volledige volume van de eerste put naar de volgende put.

Blijf het volledige volume van de ene put naar de volgende pipetteren totdat alle putten in een enkele set zijn gecombineerd in de uiteindelijke put. Voeg voor elke set vijf microliter 50% acetonitril verdund in water van HPLC-kwaliteit toe voor de eerste eencellige put die in elke set wordt opgenomen. Pipetteer het volledige volume van de eerste put naar de volgende put.

Ga door met het pipetteren van het volledige volume van de ene cel naar de volgende, totdat alle putten in een enkele set zijn gecombineerd in de uiteindelijke put. Breng nu elke set over in hun autosampler glazen inzetstukken. Droog de monsters zodra alle sets zijn gecombineerd en in glazen inzetstukken zijn geplaatst.

Voeg voorafgaand aan de LC-MS-MS-analyse 1,2 microliter mierenzuur toe aan elke set om de gelabelde peptiden te resuspenderen. Plaats de autosampler-inzetstukken in glazen autosampler-injectieflacons en sluit elk monster met een dop. Vortex elke injectieflacon gedurende vijf seconden om ervoor te zorgen dat de resuspensie voltooid is en draai vervolgens in een injectieflaconspinner bij 18 tot 22 graden Celsius.

Zorg ervoor dat elk monster zich aan de onderkant van de insert bevindt in plaats van aan de zijkanten te spatten. Plaats de injectieflacons in de autosampler-lade en injecteer voor elke set een monster van één microliter voor LC-MS-MS-analyse. De verterings- en etiketteringsefficiëntie van de afzonderlijke cellen wordt mogelijk niet direct getest zoals bij de drager, maar DO-MS-software biedt plots die de efficiëntie van de spijsvertering en etikettering schatten.

Slechte spijsvertering wordt aangegeven door een hoge verhouding van de intensiteit van miscleaved peptiden tot hun volledig gespleten tegenhangers. Een andere factor om te overwegen in de sets is de fractie van ontbrekende gegevens in de mediane ionenintensiteit van de reporter in elk tandem massa tagging kanaal. Wanneer afzonderlijke cellen met succes worden voorbereid, zijn ontbrekende gegevens per cel en positieve controle veel lager dan negatieve controlemonsters.

Zorgvuldige vloeistofbehandeling tijdens de LC-MS-MS-monstervoorbereiding is van cruciaal belang voor maximaal herstel van peptiden. Kleine monsters van ongeveer 100 picogram tot 100 nanogram per put kunnen worden voorbereid voor proteomics-analyse met behulp van een isobare drager. SCoPE2 maakt eencellige proteomics-metingen toegankelijk voor onderzoekers over de hele wereld door alleen gangbare reagentia en commercieel beschikbare apparatuur te gebruiken.

Het is vatbaar voor handmatige verwerking of automatisering met hoge doorvoer door robotische vloeistofbehandeling.