Biochemische zuivering en proteomische karakterisering van amyloïde fibrilkernen uit de hersenen

Amyloïde plaques zijn vereist voor de diagnose van de ziekte van Alzheimer. Ze zijn echter niet voldoende. Ondanks dit feit blijven ze raadselachtig, deels als gevolg van uitdagingen bij het karakteriseren van hun inhoud.

Ons protocol is zeer efficiënt in het isoleren van amyloïde fibrillen bij hoge zuiverheid en is zeer geschikt voor het begrijpen van de fijne details van structuur en samenstelling. Het kennen van het eiwitgehalte van amyloïde plaques kan helpen bij het identificeren van de doelen van therapeutische interventie die hun accumulatie kunnen vertragen, verstoren of voorkomen. Daarom, het uitstellen van het begin van de ziekte.

Deze methode is zeer geschikt voor het extraheren van eiwitafzettingen uit gedegenereerde hersenweefsels en eiwitaggregaten in verschillende andere eiwitroutes. Begin met het plaatsen van een vers ontleed of snap bevroren hersenweefselgebied in een buis van twee milliliter met zes tot acht keramische kralen in vers bereide ijskoude homogenisatiebuffer. Maal vervolgens het weefsel met behulp van een kraalmolenhomogenisator bij 4.000 tpm met twee cycli van 30 seconden aan en uit puls.

Voeg nu negen milliliter ijskoude homogenisatiebuffer toe aan de ene milliliter hersenweefselhomogenaat en een buis van 15 milliliter en sluit af met laboratoriumwasfilmstroken. Om een robuuste oplosbaarheid te garanderen, houdt u de buis 's nachts draaiend op vier graden Celsius. Voeg de volgende dag vaste sucrose toe aan de suspensie van het weefselextract tot een uiteindelijke concentratie van 1,2 mol.

Meng goed en centrifugeer 250.000 x g gedurende 45 minuten bij vier graden Celsius. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, resuspenseert u de pellet in twee milliliter homogenisatiebuffer met 1,9 molaire sucrose door trituratie en centrifugeert u bij 125.000 x g gedurende 45 minuten bij vier graden Celsius. Breng na centrifugeren de bovenste witte vaste laag over naar een verse buis en breng een milliliter ijskoude wasbuffer over door meerdere keren op en neer te aaien.

Omdat de pellet ook verrijkt is met amyloïde fibrillen, gooit u de waterige middelste laag weg en combineert u de pellet met de bovenste laag voor een hogere opbrengst. Centrifugeer de gecombineerde fracties bij 8.000 x g gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Nadat u het supernatant hebt weggegooid, resuspenseert u de pellet in één milliliter ijskoude verteringsbuffer en incubeert u bij kamertemperatuur gedurende drie uur op een vortex.

Centrifugeer het monster opnieuw, was de pellet vervolgens tweemaal in één milliliter ijskoude Tris-buffer en centrifugeer opnieuw. Na de tweede wasbeurt resuspenseer je de pellet in één milliliter oplosbuffer door op en neer te pipetteren en centrifugeer je de buis snel bij 200.000 x g gedurende 60 minuten bij vier graden Celsius. Bewaar de pellet en verlaag vervolgens de sucroseconcentratie van 1,3 naar één kies door 50 millimol Tris-buffer aan het supernatant toe te voegen.

Centrifugeer het supernatant opnieuw en los vervolgens beide pellets en 100 microliter Tris-buffer met 0,5% SDS op. Voor amyloïde zuivering, solubiliteer de amyloïde-rijke pellets met behulp van ultrasone golven in een bad sonicatie-apparaat gedurende 20 cycli, en centrifugeer het materiaal onmiddellijk op 20.000 x g gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Resuspendeer de pellet in 500 microliter van 0,5% SDS Tris-buffer en herhaal het wassen nog vier keer, Na de laatste centrifugatiestap, was de pellet in 200 microliter ultrapuur water en centrifugeer 20.000 x g gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius om het resterende reinigingsmiddel te verwijderen.

Los de laatste pellet met gezuiverde amyloïde fibrillen op in 100 microliter ultrapuur water. Los de gezuiverde 100 microliter amyloïde fibrillen goed op in 400 microliter methanol en vortex. Meng er vervolgens opnieuw 100 microliter chloroform en vortex door.

Voeg vervolgens 300 microliter ultrapuur water toe en vortex grondig. Na centrifugeren bij 12.000 x g gedurende twee minuten bij kamertemperatuur, verwijdert u voorzichtig de bovenste waterige laag zonder de interfacelaag met de eiwitvlok te verstoren en voegt u hetzelfde volume methanol opnieuw toe. Herhaal de centrifugatie, gooi het supernatant weg en droog de pellet aan de lucht.

Voor de spijsvertering, los de pellet op in 50 microliter guanidinehydrochloridebuffer en soniceer in een ijskoud waterbad. Vortex vervolgens grondig gedurende 45 minuten tot een uur bij kamertemperatuur, voeg 50 microliter 0,2% oppervlakteactieve oplossing toe en vortex opnieuw gedurende nog eens 60 minuten. Voeg vervolgens een microliter van 500 millimol TCEP toe en incubeer gedurende 60 minuten.

Voeg vervolgens twee microliter 500 milliimolar jodoacetamide toe en incubeer in het donker gedurende 20 minuten. Doof na de incubatie het jodoacetamide met vijf microliter TCEP-oplossing gedurende 15 minuten. Voeg vervolgens het vereiste volume van 50 millimol ammoniumbicarbonaatoplossing toe aan de buis om de guanidineconcentratie te verlagen tot 1,5 mol.

Voeg ook 1% oppervlakteactieve oplossing toe aan de buis. Voeg vervolgens trypsine toe en laat de tube een nacht op 37 graden Celsius mengen. Voeg de volgende dag mierenzuur toe aan de verteerde peptideoplossing om de pH te verlagen tot 2,0 en activeer vervolgens de C18-spinkolom door 200 microliter 50% methanoloplossing toe te voegen en gedurende twee minuten bij kamertemperatuur bij 1500 x g te draaien.

Breng vervolgens de C18-kolomharsbedden in evenwicht door 200 microliter equilibratiebuffer toe te voegen en opnieuw gedurende twee minuten te draaien. Laad na equilibratie de verzuurde peptideoplossing op de C18-kolom en centrifugeer bij 1500 x g gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Laad de stroom opnieuw door, draai de kolom en gooi de tweede stroom weg.

Was vervolgens de peptiden gebonden aan de C18-hars tweemaal met de wasbuffer. Eluteer het peptide drie keer door 40 microliter elutiebuffer toe te voegen en de kolom te centrifleren. Droog de peptiden in een snelvacuümconcentrator door de waterige oplossing te verdampen.

De droge pellets kunnen enkele weken voor de MS-analyse bij 20 graden Celsius worden bewaard. Congorode kleuring van gezuiverde amyloïden documenteert de verrijking van de amyloïde fibrillen in vergelijking met de SDS-oplosbare fractie. De SDS-oplosbare fractie toonde niet de aanwezigheid van amyloïden.

De structuur van de gezuiverde fibrillen bevestigde de aanwezigheid van bijna zuivere amyloïde fibrillen. Ook bevestigde immunogold-etikettering de aanwezigheid van amyloïde bèta-42-peptiden. Kleuring met behulp van anti-amyloïde beta-42 en anti-fibril antilichamen toonde een relatieve overvloed aan amyloïde beta-42 peptiden in fibrillen.

Gezuiverde amyloïde fracties toonden de aanwezigheid van ongeveer 250 eiwitten, terwijl de fractie verzameld vóór ultrasoonbehandeling en SDS-was meer dan 2.500 eiwitten bevatte. Fibrilkernen vertoonden verrijking van eiwitten geassocieerd met niet-gemene gebonden organel en supramoleculaire complexen. Amyloïden zijn soorten met een lage abundantie, misschien een paar picogrammen tot enkele microgrammen per milligram hersenweefsel.

Je moet dus heel voorzichtig zijn bij het oppakken van de lagen, pallets of het weggooien van het supernatant. Met de ontwikkeling van deze techniek kunt u nu met meer vertrouwen eiwitten identificeren die geassocieerd zijn met de initiële amyloïde zaden, hun structuur karakteriseren en ze richten op therapeutische interventie. Daarom het voorkomen van het begin van deze dodelijke ziekte.