Single-Molecule Analyse van Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motoren

Het protocol biedt een eenvoudige methode voor het zuiveren van actieve moleculaire motoren met behulp van het Sf9 baculovirus-systeem. Het beschrijft ook de beweeglijkheid van één molecuul en multimotorische glijtesten om het regulerende mechanisme van motoreiwitten te bestuderen. Al die traditionele vectorexpressie Sf9 baculovirus expressie en single step affiniteitszuivering, zal leiden tot pure en actieve motoreiwitten om de mechanistische details van Superprocessive Kinesins in single molecule en multi-motor systemen te bestuderen.

Naast kinesinemotoren kan het protocol worden toegepast om biochemische en biofysische eigenschappen van andere op cytoskeleten gebaseerde eiwitten zoals dionine en myosine te bestuderen. Het protocol is gedetailleerd en gemakkelijk te volgen. Enkele suggesties zijn om sf9-cellen zorgvuldig te behandelen omdat ze gevoelig zijn voor besmetting en om de opmerkingen in het protocol te volgen.

Visuele demonstratie is zeer effectief, gemakkelijk te volgen en de kritieke stappen te begrijpen, vooral voor degenen die deze testen nog nooit hebben uitgevoerd. De procedure wordt gedemonstreerd door Pushpanjali Soppina en Dipeshwari Shewale, promovendi die met mij en Pradeep Naik samenwerken. Om te beginnen zaai je de cellen in een schaal van 35 milliliter, met een dichtheid van 4,5 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter.

Meng na 24 uur één microgram bacmide-DNA en 100 microliter niet-aangevulde Grace-media in een buis. Meng zes microliter transfectiereagens in een andere buis met 100 microliter niet-aangevulde Grace-media. Breng de inhoud van de eerste buis voorzichtig over in de tweede buis.

Meng ze en incubeer het mengsel gedurende 45 minuten op kamertemperatuur. Voeg 0,8 milliliter niet-aangevulde Grace-media toe aan het mengsel. Meng en aspirateer de Sf900 SFM-media uit de cellen.

Voeg de bereide transfectiemedia druppelsgewijs toe aan de bovenkant van de cellen en incubeer de plaat gedurende zes uur. Verwijder vervolgens voorzichtig het transfectiemengsel. Voeg twee milliliter SF900 SFM-media toe en incubeer verder bij 28 graden Celsius gedurende 48 uur.

Controleer vervolgens de expressie van het motoreiwit onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Oogst de media met geïnfecteerde cellen en draai gedurende vijf minuten, op 500 G.Verzamel het supernatant en vries de aliquots in. Voeg 10 milliliter SF900 SFM-media met cellen en een milliliter P-zero virusvoorraad toe in een steriele erlenmeyer van 100 milliliter.

Incubeer bij 28 graden Celsius met constant schudden bij 90 tpm. Draai na 72 uur de cellen in een steriele conische buis van 15 milliliter op 500 G gedurende vijf minuten en verzamel het supernatant. Infecteer voor grootschalige eiwitexpressie 30 milliliter van de suspensiecultuur met één milliliter P1-stamvirus.

Controleer 72 uur na de infectie de cellen op eiwitexpressie en verzamel de cellen in steriele, 50 milliliter, conische buizen. Gooi na het spinnen het supernatant weg en verzamel de celpellet. Om de cellen te lyseren, voegt u drie milliliter ijskoude lysisbuffer toe aan de celpellet.

Draai de cel lyseren op 150.000 G gedurende 30 minuten, op vier graden Celsius. Verzamel het supernatant en meng het met 40 microliter 50% ANTI-FLAG M2 affiniteitshars. Incubeer het mengsel bij vier graden Celsius gedurende drie uur met end-to-end tuimelen.

Pelleteer nu de FLAG-hars door een minuut op 500 G te draaien bij vier graden Celsius. Was de FLAG harskorrel drie keer met ijskoude wasbuffer. En na de derde wasbeurt laat je de wasbuffer voorzichtig uitlekken.

Voeg vervolgens 70 microliter wasbuffer met 100 microgram per milliliter FLAG-peptide toe aan de harspellet en incubeer 's nachts bij vier graden Celsius, zoals eerder aangetoond. Verzamel na het spinnen het supernatant met gezuiverd eiwit in een verse buis. Bereid een polymerisatiemengsel zoals beschreven in het manuscript en voeg 10 microliter tubuline toe aan het polymerisatiemengsel.

Breng de buis over in een warmteblok, voorverwarmd bij 37 graden Celsius, en incubeer gedurende 30 minuten. Na het bereiden van de microtubule stabilisatie buffer, warm het, en voeg het toe aan de gepolymeriseerde microtubuli. Zodra de motiliteitsstroomcelkamer is voorbereid, stroomt 30 microliter verdunde microtubulioplossing door de kamer.

Laat na 30 minuten 40 tot 50 microliter blokkerende buffer stromen en incubeer deze. Bereid een motiliteitsmengsel en voeg er een microliter van de gezuiverde motor aan toe. Meng goed en laat de oplossing in de motiliteitskamer stromen.

Sluit beide uiteinden van de motiliteitskamer en het beeld af onder TIRF-verlichting. Focus op de individuele mCitirine gelabelde motoren, die processief bewegen. Meng rhodamine gelabeld tubuline met ongelabelde tubuline in een verhouding van één tot 10.

Voeg na 30 minuten polymerisatie voorzichtig 30 microliter voorverwarmde microtubulistabilisatiebuffer toe en incubeer verder, gedurende vijf minuten, bij 37 graden Celsius. Schuif de microtubuli door te pipetteren met de capillaire laadpunt. Na het voorbereiden van de motiliteitsstroomkamer, stroomt 50 microliter Sf9 gezuiverde GFP-nanobodies en incubeert gedurende 30 minuten.

Blokkeer het afdekvlak door 50 microliter blokbuffer te laten stromen. Bereid 50 microliter van het motormengsel. Laat het in de kamer stromen na het voorzichtig mengen van de oplossing en incubeer gedurende 30 minuten.

Was de kamer twee keer met 50 microliter P12-caseïne. Bereid het glijdende testmengsel en meng het voorzichtig, voordat het in de motiliteitskamer stroomt. Sluit de uiteinden van de motiliteitskamer af en beeld microtubuli die glijden onder TIRF-verlichting.

Na 48 uur transfectie lijken de niet-getransfecteerde cellen klein, rond en stevig gehecht. De getransfecteerde cellen die eiwit tot expressie brachten, waren echter losjes aan het oppervlak bevestigd en vertoonden een vergrote celdiameter. Na 72 uur kwam meer dan 90% van de Sf9-cellen tot expressie met fluorescerend gelabeld, kinesine-3-motor KIF1A en cellen waren losjes gebonden aan het oppervlak.

Kinesine-3 motoreiwit werd gezuiverd uit de getransfecteerde Sf9-cellen. De kymograaf toont kinesine-3 motor die processief langs het microtubulioppervlak loopt. Motiliteitsgebeurtenissen toonden een gemiddelde snelheid en looplengte van respectievelijk ongeveer 2,44 micrometer per seconde en 10,79 micrometer.

De kymograaf duidt op een soepele microtubuli die door de kinesine-3-motoren glijden, met een gemiddelde snelheid van ongeveer 1,37 micrometer per seconde. Het belangrijkste is om de stabilisatiebuffer toe te voegen zonder de microtubulemix te verstoren en de microtubuli niet te scheren. Het protocol zou nuttig zijn voor andere toepassingen, zoals ATPase-metingen, biofysische analyse, mechanismen, in vitro reconstitutietests, et cetera.

Met behulp van sf9-gezuiverde motoren hebben we onlangs aangetoond dat kinesine-3-motoren snel en superprocessief zijn. Interessant is dat deze motoren hoge ATP-omloopsnelheden vertonen in vergelijking met een goed gekarakteriseerde motor, Kinesin-1.