Het genereren van 3D-bollen en 2D-lucht-vloeistofinterfaceculturen van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide type 2 alveolaire epitheelcellen

Dit protocol schetst een methode voor het kweken en doorgeven van een belangrijke celpopulatie in de longen en vormt een fysiologisch relevant platform voor blootstelling aan het milieu. Het grote voordeel van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om longbiologie te onderzoeken in de context van homeostase en ziekte. Deze methode kan inzichten geven, met name in longziekten die longblaasjes aantasten, waaronder die veroorzaakt door genetische varianten, blootstelling aan het milieu, infectieuze agentia of een combinatie van deze factoren.

Ikzelf en Rhiannon Werder demonstreren de procedure, bijgestaan door Kristy Abo, een MD, promovenda, en Olivia Hix, een laboratoriummanager van onze laboratoria. Aspirateer eerst al het CK DCI-medium uit de 3D-matrixdruppels met alveolosferen afgeleid van gerichte differentiatie in de 12-putplaat. Voeg één milliliter dispase per druppel toe.

Pipetteer de druppel voorzichtig in de dispase met behulp van een P-1000 pipet. Na incubatie brengen de gedissocieerde organoïden over van één matrixdruppel in de dispase naar een conische buis van 15 milliliter. Voeg 10 milliliter Iscove's Modified Dulbecco's Medium toe en centrifugeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur bij 300 x g.

Aspirateer het bovennatuurlijke zoveel mogelijk. Resuspend de cellen in één milliliter van 0,05% trypsine per druppel en breng het terug naar de 12-well plaat. Incubeer dit bij 37 graden Celsius gedurende 12 tot 15 minuten voordat u de dissociatie onder de microscoop observeert en vermijd overpipetting van de cellen.

Aan het einde van de incubatie wordt een eencellige suspensie verkregen. Stop de werking van trypsine met een gelijk volume foetaal runderserum dat medium bevat, gevolgd door een centrifuge bij 300 x g gedurende vijf minuten. Was de cellen met 10 milliliter IMDM voor de volgende centrifugering.

Resuspend de cellen in een geschikt volume voor het tellen. En tel vervolgens de cellen met behulp van een hemocytometer. Genereer alveolosferen door eencellige suspensie van iAT2-cellen in de 3D-matrix of op celkweekinzetstukken voor lucht-vloeistofinterfacecultuur te platen.

Bepaal na het tellen van de cellen het aantal gewenste cellen dat opnieuw moet worden afgespeeld in de 3D-matrix en centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur bij 300 x g. Verwijder zoveel mogelijk supernatant met een pipet en suspens de cellen in de 3D-matrix snel opnieuw. Doseer een 3D-matrixdruppel in een put van voorgewarmde 12-well plaat met behulp van een P-200 pipet zonder bubbels in de matrixdruppel te creëren en zonder de celsuspensie te laten bezinken tijdens het doseren van meerdere druppels.

Plaats de plaat gedurende 20 tot 30 minuten in een incubator van 37 graden Celsius om de matrixdruppels te laten polymeriseren en voeg vervolgens één milliliter CK DCI 10 micromolair Y-27632-medium per put toe om de matrixdruppel te bedekken. Verander het medium in CK DCI zonder 10 micromolair Y-27632 na 72 uur en vervang het elke 48 tot 72 uur door verse CK DCI. Bereid vers gecoate 6,5 millimeter celkweekinzetstukken een uur voor het gebruik door de 2D-matrix in Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 te verdunnen tot de werkoplossing.

Voeg vervolgens 100 microliter van de verdunde matrix toe per celkweekinzetstuk van 6,5 millimeter. Laat de matrix polymeriseren in een incubator van 37 graden Celsius gedurende 30 minuten of bij kamertemperatuur vanaf een uur. Zuig de overtollige matrix uit de celkweekinzetstukken op met behulp van een pipet.

Spoel het af met DMEM F-12 en zuig deze was onmiddellijk op voordat u de cellen toevoegt. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 300 x g en verwijder zoveel mogelijk bovennatuurlijk materiaal. Resuspend de cellen in het juiste volume om te zaaien met 100 microliter CK DCI 10 micromolaire Y-27632 per celkweekinzet en voeg 100 microliter toe aan het apicale compartiment van de celkweekinzet.

Roer de plaat voorzichtig in een kruispatroon om de gelijkmatige verdeling van cellen te garanderen en controleer deze onder een microscoop met een 10X-objectief. Voeg 500 microliter CK DCI 10 micromolair Y-27632 toe aan het basolaterale compartiment van elke celkweekinzet en zuig 48 uur na het zaaien het apicale medium op met behulp van een pipet om de lucht-vloeistofinterface te initiëren. Verander na 72 uur het basolaterale medium in CK DCI zonder 10 micromolaire Y-27632, gevolgd door het vervangen van het basolaterale medium door verse CK DCI om de 48 tot 72 uur gedurende maximaal 28 dagen na het platen.

De representatieve flowcytometrieresultaten tonen het gemak van visualisatie voor de SPC2-lijn met een tdTomato-reporter gericht op het endogene oppervlakteactieve eiwit C locus en het volgen van type 2 alveolaire epitheelcellenprogramma in de loop van de tijd in cultuur. De IPSC-afgeleide alveolaire type 2 cel oppervlakteactieve stof C tdTomato expressie werd gehandhaafd wanneer opnieuw geplateerd in de 3D matrix als bollen en wanneer verguld op celkweek inserts. Transepitheliale elektrische weerstand kan worden gemeten om de integriteit van de lucht-vloeistof interface cultuur te bepalen.

Vermijd bij het proberen van deze procedure overmatige dissociatie door mechanisch pipetteren of enzymatische spijsvertering, omdat dit kan leiden tot een lage levensvatbaarheid van de cel en een slechte overleving. Aanvullende methoden die na deze procedure worden uitgevoerd, zijn metingen van transepitheliale elektrische weerstand tegen de integriteit van de testbarrière, toevoeging van virussen of verbindingen om de cellen te stimuleren, immunofluorescentie en RNA-, eiwit- of bovennatuurlijke verzameling. Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers om nieuwe longbiologie en ziektevragen te onderzoeken, zoals hoe virussen zoals SARS COVID-2 of verbindingen zoals elektronische sigarettendampen het alveolaire epitheel beïnvloeden.