Inductie van oculaire oppervlakteontsteking en verzameling van betrokken weefsels

Dit protocol beschrijft achtereenvolgens de stappen die betrokken zijn bij de inductie van oogletselontsteking en de verzameling van geassocieerde aangetaste organen die betrokken zijn bij meibomklierdisfunctie. Dit nieuwe model van MGD maakt het onderzoek mogelijk naar het aangeboren immuunaspect van de ziekte, met name de vorming van neutrofiele extracellulaire vallen die de Meibom-klier afsluiten. De techniek die in het protocol wordt getoond, kan worden uitgebreid om actuele therapeutische interventies in een preklinische fase te introduceren.

Bovendien weerspiegelt de verzameling oculaire exsudaten en organen de werkzaamheid van de behandeling. Om intraperitoneale injectie van de immunogene oplossing uit te voeren, houdt u de zeven tot negen weken oude C57 zwarte zes niet-verdoofde vrouwelijke muis zachtjes bij de staart terwijl u het kooirooster vastpakt. Houd vervolgens de huid van de rug en het nekgebied tussen de duim en wijsvinger stevig vast en bevestig de staart en onderste ledematen tussen de ring en de pink tegen de handpalm.

Houd de muis gefixeerd met zijn hoofd naar beneden en injecteer 100 microliter van de bereide immunogene oplossing in het rechter- of linkerkwadrant van de onderbuikholte. Om een oculaire oppervlakte-uitdaging na immunisatie uit te voeren, brengt u vijf microliter ovalbumine of eicellen of zoutoplossing aan per oog van een verdoofde muis en wacht u vijf minuten om de druppel door het oog te laten absorberen. Verzamel vervolgens de oculaire exsudaten door onmiddellijk na de uitdaging 50 microliter steriele zoutoplossing op het oog aan te brengen.

Voor de excisie van oculaire oppervlakteweefsels plaatst u de muis op een gelijkmatig oppervlak en desinfecteert u het orbitale gebied rond het oog met een 70% ethanoldoekje. Om een incisie rond het oog te vormen, maakt u een incisie tussen het oor en de retroorbitale sinus en langs het oppervlak boven het plaveiselbot verticaal, waarbij u de incisie horizontaal onder het onderste ooglid langs het maxillaire bot en boven het bovenste ooglid langs het frontale bot verlengt. Houd het ontleedde weefsel voorzichtig rond het oog met behulp van een gebogen tang en trek het weefsel en de oogbol eruit.

Plaats de weggesneden organen in steriel PBS. Gebruik vervolgens een scalpel onder de stereomicroscoop en trim het overtollige gezichtsspierweefsel rond de weggesneden bovenste oogleden. Om het bindvlies te verzamelen plaatst u het bovenste ooglid op een droge petrischaal.

Pel vervolgens met een fijn pincet en een scalpel de witachtige slijmlaag voorzichtig uit het binnenoppervlak van het ooglid. Naast het ontleden van het hoornvlies, plaats je de oogbol op een nieuwe droge petrischaal bovenop droogijs. Plaats de schotel na drie minuten in een stabiele positie op het bankoppervlak.

Gebruik een fijne, scherpe schaar om een kleine incisie te maken aan de rand van het hoornvlies naast de limbus. Ga door met de incisie met het scalpel rond de oogbol en scheid de sclera van het hoornvlies. Verwijder vervolgens de iris- en lensresten van de achterkant van het hoornvlies door royaal te spoelen met zoutoplossing.

Om de Meibom-klier en zijn openingen te beoordelen, plaatst u de weggesneden oogleden in een rechtopstaande positie onder de stereomicroscoop. Leg vervolgens volgens de belichtingstijd van de camera en de ISO-instellingen beelden vast onder epi-verlichting met wit licht. Om het Meibomian-kliergebied te beoordelen, plaatst u de weggesneden oogleden in een horizontale positie en schakelt u de achtergrondverlichting van de stereomicroscoop in die is uitgerust met een infraroodcamera.

Maak foto's door de belichtingstijd aan te passen aan de ISO van de camera. Met zoutoplossing toegediende muizen vertoonden gezonde oculaire oppervlakken met de ogen wijd open. Ter vergelijking: eiceltoepassing induceert ernstige oogoppervlakontsteking, de smalle opening van de ogen en tekenen van chemose.

De weggesneden oogleden vertoonden grote occlusies die de openingen van de Meibom-klier en oedeem verstopten, in tegenstelling tot de gezonde oogleden met kleine pluggen van de klier die het ooglid bekleden. Verder onderzoek van de infraroodtransilluminatie van de klier onthult het rasmische uiterlijk van de acini van de Meibom-klier. De oogleden van zoutoplossing uitgedaagde muizen toonden de ronde acini.

Ter vergelijking: eicellen veroorzaakten de vernietiging en het verlies van sommige klieren met de allergische oogziekte of AED. De histologische analyse van de oogleden vertoonde verwijde Meibom-klieren in vergelijking met muizen die alleen zoutoplossing kregen toegediend. Het incuberen van de oogbol op droogijs maakte incisie mogelijk bij het hoornvlies naast de limbus en scheiding van het hoornvlies van de sclera.

Deze studie vergemakkelijkte de verzameling van het hoornvlies. Bovendien bracht toediening van eicellen ernstige ontstekingen toe aan het bindvlies met een hyperemisch uiterlijk. Verhoogde niveaus van de chemokine CXCL-1 vergemakkelijken neutrofiele extravasatie, fagocytose en degranulatie, en interleukine-6 die de acute faserespons en neutrofiele infiltratie bemiddelt, werden waargenomen in de supernatanten van AED-muizen.

Aan de andere kant vertoonde de concentratie van interleukine-10 geen significante veranderingen bij zowel naïeve als AED-muizen. Dit nieuwe model maakt de ontwikkeling en evaluatie van de werkzaamheid mogelijk van geneesmiddelen die zich richten op de aangeboren immuunroutes, en is van grote hulp bij datamining op de manier van toediening van ontstekingsremmende middelen. Na de juiste verzameling van organen zijn zeer multiplexmethoden zoals single cell sequencing en imaging mass cytometry compatibel met dit protocol.