Name: Mycobacterium tuberculose Extracellulaire vesikelverrijking door grootte-uitsluitingschromatografie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Leer een reproduceerbare methode voor het verrijken van Mycobacterium tuberculosis extracellulaire vesikels via grootte-uitsluitingschromatografie. Deze techniek minimaliseert co-verrijking van niet-EV-eiwitten en vereenvoudigt het isolatieproces.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag de steun erkennen van het College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences Experiential Award en College Research Council Shared Research Program aan NKG en financiering door ATCC (award # 2016-0550-0002) aan KMD. We willen ook Anne Simpson bedanken voor technische ondersteuning en BEI Resources, NIAID, NIH voor de volgende reagentia: Monoklonale Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763), IT-54 (geproduceerd in vitro), NR-13792, Monoklonale Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gen Rv3418c), Clone IT-3 (SA-12) (geproduceerd in vitro), NR-49223, en Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35 (geproduceerd in vitro), NR-13811.

Het Colorado State University Institutional Biosafety Committee keurde de huidige studie goed (19-046B). De teelt van Mycobacterium tuberculosis en het oogsten van EV-rijke kweeksupernatanten werden uitgevoerd door getraind personeel in een laboratorium met hoge containment. De materialen werden uit het gebied met hoge insluiting verplaatst nadat een geldige inactiveringsmethode was uitgevoerd, bevestigd en goedgekeurd door het institutionele bioveiligheidsbeleid. Hoewel het repliceren van het protocol, als gevalideerde inactivatie of steriele filtratiemethode niet haalbaar is, moeten de volgende procedures worden uitgevoerd in een laboratorium met een hoge containment.
1. Bereiding van ruw MTB EV-concentraat
OPMERKING: Voor gedetailleerde procedures voor de teelt van Mtb en de bereiding van kweekfiltraateiwit (CFP), zie referenties11,12. Het wordt aanbevolen dat bacteriële kweekmedia vrij zijn van groeisupplementen met EV-bevattende of eiwithoudende componenten, zoals Oleic Albumin Dextrose Catalase (OADC) en detergentia zoals Tween. Het wordt ook aanbevolen om de kwaliteit van de bacteriecultuur en het geoogste GVB te screenen om een beperkte celdood en lysis13,14 te garanderen.
<ol><li>Bereid een 100 kDa moleculair gewichtsafsnijding (MWCO) centrifugaalfilter (zie Materiaaltabel) door de volledige volumecapaciteit van fosfaat-gebufferde zoutoplossing (1x PBS) toe te voegen. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 2.800 x g bij 4 °C. OPMERKING: Als u een filter zonder dead stop volume gebruikt, moet ervoor worden gezorgd dat het monstervolume niet onder het filterniveau daalt, wat resulteert in volledige filterdroging tijdens centrifugatie.</li>
	<li>Gooi de doorstroom en eventuele resterende PBS weg voordat u de monsterkamer met Mtb CFP tot de maximale capaciteit vult. Centrifugeer bij 2.800 x g bij 4 °C totdat het volume is teruggebracht tot het minimumvolume van het ultrafiltratieapparaat. Herhaal indien nodig en voeg meer GVB toe aan de eenheid totdat het volledige monster voldoende is verkleind. OPMERKING: Bewaar indien gewenst een deel van het 100 kDa doorstroommateriaal (100F) voor downstream kwalificatie. Bewaren bij 4 °C.</li>
	<li>Voeg 1x PBS toe aan de filtereenheid met het concentraat tot de totale apparaatcapaciteit. Verlaag het volume zoals beschreven in 1.2. Herhaal deze stap vijf keer om te zorgen voor volledig wassen en bufferuitwisseling.</li>
	<li>Herstel het 100 kDa geconcentreerde CFP-retentaat (100R) volgens de specificaties van het ultrafiltratieapparaat (zie Materiaaltabel). Zodra de 100R is hersteld, wast u het filter minstens drie keer met een minimaal volume van 1x PBS en poolt u de was met de 100R om het herstel te maximaliseren.</li>
	<li>Kwantificeer het 100R-materiaal met een bicinchoninische assay (BCA) volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel). Gebruik voor het uitvoeren van de test verschillende verdunningen van monsters 1:2, 1:5 en 1:10 in PBS. Test het monster in drievoud. OPMERKING: Bewaar indien gewenst een deel van het 100R-materiaal voor downstream-kwalificatie. Bewaren bij 4 °C.</li>
</ol>2. Grootte-uitsluitingschromatografie voor de verrijking van MTB EV's van CFP
OPMERKING: De volgende procedure is specifiek voor het gebruik van 3 mg 100R Mtb CFP met SEC-kolom en automatische fractiecollector (AFC, zie Materiaaltabel). Het kan worden aangepast voor andere startconcentraties en kolomtypen door de specificaties van de fabrikant te volgen. Bovendien wordt de gebruikers aangeraden om de gebruikershandleiding van de automatische breukverzamelaar te lezen en te begrijpen.
<ol><li>Laat de SEC-kolom in evenwicht brengen tot kamertemperatuur.</li>
	<li>Schakel de AFC in met behulp van de aan/uit-schakelaar aan de achterkant van de toreneenheid en pas de instellingen voor de loadcel aan, indien nodig, door op SETUP te drukken op het touchscreen van het hoofdmenu. De loadcel mag alleen worden gekalibreerd bij het eerste gebruik, na elke software-update en als inconsistentie in de volumes van de fractieverzameling wordt opgemerkt.</li>
	<li>Lijn in het scherm SETUP de carrousel uit door CARROUSEL > KALIBREREN te selecteren. Plaats de carrousel met de 13 kleine gaatjes naar boven in de AFC-toren en stel de carrousel zo in dat het vloeistofmondstuk zich direct boven de spoelpositie bevindt door op de knoppen - en / of + te drukken.</li>
	<li>Verwijder de doppen uit de gebalanceerde SEC-kolom. Schuif de SEC-kolom in de juiste kolombevestiging en installeer deze zorgvuldig op de AFC-toren. Zorg ervoor dat de RFID-tag (Radio Frequency Identification) op de kolom naar de AFC is gericht en controleer of de verbinding tussen de kolom en de klep veilig is. Plaats de afvaluitlaatbuis in een opvangbak.</li>
	<li>Selecteer in het scherm SETUP de optie Collectieschema en stel het aantal in op 13 en de grootte op 0,5 ml door op de knoppen - en/of + te drukken. Laat de instelling "Buffervolume" als de standaardinstelling van 2,7 ml en sluit vervolgens het venster "Collectieschema" door op X te drukken.</li>
	<li>Selecteer COLLECTIE STARTEN in het startscherm en bevestig de collectieparameters door JA te selecteren. Laad 13 gelabelde microcentrifugebuizen van 1,7 ml met de deksels open en gericht op het carrouselcentrum.</li>
	<li>Ga verder met de AFC door OK te selecteren, monteer vervolgens het kolomreservoir en ga opnieuw verder door op OK te drukken. Selecteer de optie om de kolom leeg te maken door op JA te drukken en voeg één kolomvolume van 0,2 μm gefilterd PBS toe om eventuele opslagbuffers te verwijderen. Zodra de spoeling is voltooid, gaat u verder met de AFC door op OK te drukken.</li>
	<li>Plaats het carrouseldeksel over de AFC en druk op OK. Bereid één kolomvolume van 0,2 μm gefilterd PBS voor. Gebruik een pipet om overtollige buffer uit de kolom te verwijderen.</li>
	<li>Breng 3 mg 100R monster zoals gekwantificeerd in stap 1,5 tot 500 μL met 1x PBS. Voeg het monster van 3 mg toe aan de bovenkant van de kolom. Zet de AFC vooruit en laat het monster in de friet lopen. Zodra het monster volledig in de kolom is gekomen, voegt u het in stap 2.6 voorbereide PBS toe aan het reservoir.</li>
	<li>Controleer de uitvoering van de AFC terwijl deze eerst het leegtevolume en vervolgens de opgegeven fracties verzamelt. Nadat de run is voltooid en de carrousel terugkeert naar de afvalpositie, verwijdert u de afdekking en verwijdert u de fractiebuizen uit de carrousel. Bewaar de fracties bij 4 °C voorafgaand aan de kwantificering (stap 3) en kwalificatie (stap 4).</li>
	<li>Als de kolom opnieuw moet worden gebruikt, selecteert u de optie om de kolom schoon te maken door op JA te drukken; druk anders op NEE. Volg de instructies op de AFC. OPMERKING: Zodra de kolom is gewassen en de opslagbuffer is doorgelopen, kan deze worden verwijderd, afgedekt en bewaard bij 4 °C.</li>
</ol>3. Kwantificering van de MTB EV's
<ol><li>Meet de eiwitconcentratie voor elke fractie met behulp van BCA en micro BCA12.<ol>
<li>Gebruik voor 0,5 ml fracties verzameld uit 3 mg 100R Mtb CFP de micro BCA met een 1:3 verdunning voor fracties genummerd 1-7 van elk monster in drievoud.</li>
		<li>Gebruik voor 0,5 ml fracties genummerd 5-13 de BCA zonder verdunning voor elk monster in drievoud. OPMERKING: Het overlappen van de assays voor breuken 5-7 helpt ervoor te zorgen dat alle fracties een leesbare output hebben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kwantificeer de deeltjesconcentratie voor elke fractie met behulp van nanodeeltjes tracking analyse (NTA).<ol>
<li>Verdun de monsters in 1 ml 1x PBS met behulp van de volgende voorgestelde startverhoudingen; gebruik voor fracties 1-3 1:100 en gebruik vervolgens voor de resterende fracties een verdunning van 1:10.</li>
		<li>Vortex de verdunde oplossingen en trek het monster vervolgens in een wegwerpspuit van 1 ml. Plaats de spuit in een automatische spuitpomp indien beschikbaar.</li>
		<li>Stel de spuitpomp in op 30 μL/min en gebruik de video-opname-instellingen met een schermversterking van 10-12 en een cameraniveau van 10-12. Pas de focus voor elk monster aan.</li>
		<li>Verzamel minimaal drie video's op 30 s elk met behulp van een constante stroom.</li>
		<li>Voer de analyse uit met de softwaredetectiedrempel ingesteld op vijf. OPMERKING: Het is mogelijk dat het niet mogelijk is om NTA-gegevens voor de meest recente fracties (>7) te verkrijgen zonder een aanzienlijk monstervolume op te offeren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Kwalificatie van MTB EV's
<ol><li>Visualiseer het algemene eiwitprofiel van elke fractie met behulp van een zilvergekleurde eiwitgel. OPMERKING: Gedetailleerde procedures voor SDS-PAGE en zilvervlek zijn te vinden in Referentie15.<ol>
<li>Voeg sds-monsterbuffer toe aan 10 μl van elke fractie en 5 μg CFP, 100R en 100F. Kook gedurende 5 minuten bij 100 °C en laad vervolgens op een 4% -12% Bis-Tris Gel met een moleculaire gewichtsladder voor polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) (zie Materiaaltabel).</li>
		<li>Laat de gel draaien met behulp van 1x 2-[N-morpholino]ethaansulfonzuur (MES) lopende buffer (zie Tabel van materialen) en een 200 V stroom gedurende 35 min.</li>
		<li>Verwijder de gel van de cassette en ga verder met zilverkleuring15.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Evalueer de aan- of afwezigheid van EV-markers in elke fractie door Western blot. OPMERKING: Gedetailleerde procedures voor Western blotting zijn te vinden in Referentie15.<ol>
<li>Voer een SDS-PAGE-gel uit zoals beschreven in stap 4.1.1-4.1.2.</li>
		<li>Verwijder de gel van de cassette en breng de opgeloste eiwitten over naar een nitrocellulosemembraan van 0,2 μm (zie materiaaltabel) door minimaal 1 uur een stroom van 50 V toe te passen.</li>
		<li>Voer Western blot-analyse uit om interessante eiwitten te evalueren. Primaire antilichamen tegen LpqH, lipoarabinomannan (LAM) en GroES (zie Materiaaltabel) worden aanbevolen.</li>
		<li>Poolfracties op basis van de aan- of afwezigheid van markers zoals van toepassing voor de downstreamtoepassing.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bevestig de aanwezigheid van intacte blaasjes door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM).<ol>
<li>Fixeer 15 μL van het blaasjesmonster door 15 μL 4% EM-klasse paraformaldehyde toe te voegen en bewaar het bij 4 °C 's nachts.</li>
		<li>Bereid een 200 mesh formvar-carbon gecoat koper TEM-rooster voor door het oppervlak te reinigen en een hydrofiel substraat te maken. OPMERKING: Plasmareiniging met 95% argon, 5% zuurstof en 30% plasmavermogen gedurende 1 minuut wordt aanbevolen.</li>
		<li>Laat 10 μL van het vaste monster op het rooster vallen en laat het monster gedurende 10 minuten hechten en veeg vervolgens de overtollige vloeistof weg met filterpapier.</li>
		<li>Drijf het rooster op een druppel ultrapuur water gedurende 30 s en veeg vervolgens overtollige vloeistof weg.</li>
		<li>Laat het rooster gedurende 2 minuten op een d% EM-kwaliteit uranylacetaatdruppel drijven en de overtollige vloeistof vervolgens wegvegen.</li>
		<li>Laat het rooster volledig aan de lucht drogen.</li>
		<li>Afbeelding met een TEM (zie Materiaaltabel) bij 100 kV of iets dergelijks. OPMERKING: Andere EV-kwantificerings- en karakteriseringsmethoden moeten worden gebruikt op basis van downstreamtoepassingen. De minimale informatie voor studies van extracellulaire blaasjes18 moet worden geraadpleegd voor richtlijnen om de striktheid en reproduceerbaarheid van alle EV-onderzoeken te waarborgen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Gill, S., Catchpole, R., Forterre, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+membrane+vesicles+in+the+three+domains+of+life+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Extracellular membrane vesicles in the three domains of life and beyond.</a> FEMS Microbiology Reviews. 43 (3), 273-303 (2019).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLOBAL+TUBERCULOSIS+REPORT+2021%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">GLOBAL TUBERCULOSIS REPORT 2021.</a> World Health Organization. , (2021).</li>
<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacteria+release+active+membrane+vesicles+that+modulate+immune+responses+in+a+TLR2-dependent+manner+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1471-1483 (2011).</li>
<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+membrane+vesicles+administered+systemically+in+mice+induce+a+protective+immune+response+to+surface+compartments+of+mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial membrane vesicles administered systemically in mice induce a protective immune response to surface compartments of mycobacterium tuberculosis.</a> mBio. 5 (5), 01921(2014).</li>
<li>Prados-Rosales, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+mycobacterium+tuberculosis+membrane+vesicles+in+iron+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Role for mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquisition.</a> Journal of Bacteriology. 196 (6), 1250-1256 (2014).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+derived+from+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of extracellular vesicles derived from Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 15 (19), 3331-3337 (2015).</li>
<li>Athman, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Membrane+Vesicles+Inhibit+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation.</a> The Journal of Immunology. 198 (5), 2028-2037 (2017).</li>
<li>Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quirós, S., Luque-Garcia, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+membrane+vesicle-associated+proteins+in+Gram-positive+bacteria+and+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria.</a> MethodsX. 1, 124-129 (2014).</li>
<li>Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 23111(2014).</li>
<li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes%3A+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731(2017).</li>
<li>Wallace, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Culturing mycobacteria.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 1-58 (2021).</li>
<li>Lucas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+separation+of+mycobacterial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Extraction and separation of mycobacterial proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 2314, 77-107 (2021).</li>
<li>Walker, S. A., Kennedy, M. T., Zasadzinski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+bilayer+vesicles+by+self-assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of bilayer vesicles by self-assembly.</a> Nature. 387 (6628), 61-64 (1997).</li>
<li>Edwards, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+vesicle+formation+at+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Spontaneous vesicle formation at lipid bilayer membranes.</a> Biophysical Journal. 71 (3), 1208(1996).</li>
<li>Dobos, K. Production Manuals & SOPs. SP007: Running of polyacrylamide gels, SP011: Western blot, and SP0012: Silver staining protocols. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/">https://labs.vetmebiosci.colostate.edu/dobos/bei-resources/</a> (2022).</li>
<li>Engers, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+of+a+World+Health+Organization-sponsored+workshop+to+characterize+antigens+recognized+by+mycobacterium-specific+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Results of a World Health Organization-sponsored workshop to characterize antigens recognized by mycobacterium-specific monoclonal antibodies.</a> Infection and Immunity. 51 (2), 718-720 (1986).</li>
<li>Chatterjee, D., Lowell, K., Rivoire, B., McNeil, M. R., Brennan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoarabinomannan+of+Mycobacterium+tuberculosis.+Capping+with+mannosyl+residues+in+some+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipoarabinomannan of Mycobacterium tuberculosis. Capping with mannosyl residues in some strains.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 6234-6239 (1992).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Palacios, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+extracellular+vesicle-associated+lipoprotein+LpqH+as+a+potential+biomarker+to+distinguish+paratuberculosis+infection+or+vaccination+from+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis extracellular vesicle-associated lipoprotein LpqH as a potential biomarker to distinguish paratuberculosis infection or vaccination from tuberculosis infection.</a> BMC Veterinary Research. 15 (1), 1-9 (2019).</li>
<li>Ziegenbalg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+mycobacterial+vesicles+in+humans%3A+Identification+of+a+new+tuberculosis+antibody+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of mycobacterial vesicles in humans: Identification of a new tuberculosis antibody biomarker.</a> Tuberculosis. 93 (4), 448-455 (2013).</li>
<li>Chiplunkar, S. S., Silva, C. A., Bermudez, L. E., Danelishvili, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+membrane+vesicles+released+by+Mycobacterium+avium+in+response+to+environment+mimicking+the+macrophage+phagosome%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of membrane vesicles released by Mycobacterium avium in response to environment mimicking the macrophage phagosome.</a> Future Microbiology. 14 (4), 293-313 (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Mycobacterium tuberculosis extracellulaire blaasjes zijn zeer antigene reservoirs, die ze presenteren als een aantrekkelijke manier voor het ontwikkelen van diagnostische hulpmiddelen en toekomstige vaccins 4,19,20. Historisch gezien is ultracentrifugatie van de dichtheidsgradiënt gebruikt om Mtb EV's te scheiden van ander oplosbaar, uitgescheiden materiaal8. Hoewel dit proces effectief is, is he...

Extracellulaire vesicle (EV) afgifte door pathogenen kan de sleutel zijn tot het ontsluiten van nieuwe technologieën om infectieziekten te beheersen1. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is een ziekteverwekker van hoge betekenis, infecteert ongeveer een derde van de wereldbevolking en eist elk jaar het leven van miljoenen mensen2. Ev-productie door Mtb is goed gedocumenteerd maar ongrijpbaar in de biogenese en gevarieerde rollen (d.w.z. immunostimulerend, immunosuppressief, ijzer- en nutriëntenacquisitie) van deze EV's in de context van infectie 3,4,5. Inspanningen om de samenstelling van Mtb EV's te begrijpen onthulden 50-150 nm lipidemembraan-ingesloten bollen afgeleid van het plasmamembraan met lipiden en eiwitten van immunologische betekenis 3,6. Onderzoek naar de rol van MTB EV's in de bacteriële fysiologie heeft het belang van bacteriële EV-modulatie als reactie op omgevingsstress voor overleving aan het lichtgebracht 5. Gastheer-pathogeen interactiestudies zijn ingewikkelder om te interpreteren, maar er zijn aanwijzingen dat Mtb EV's de immuunrespons van de gastheer kunnen beïnvloeden en mogelijk kunnen dienen als een effectieve vaccinatiecomponent 3,4,7.
De meeste studies van Mtb EV's tot nu toe hebben vertrouwd op dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie voor blaasjesverrijking8. Dit is effectief geweest voor kleinschalige studies; deze techniek heeft echter verschillende technische en logistieke uitdagingen. Alternatieve workflows koppelen meerstaps centrifugatie, voor het verwijderen van hele cellen en groot puin, met een laatste ultracentrifugatiestap naar pellet-EV's. Deze methodologie kan variëren in efficiëntie en resulteert vaak in een lage opbrengst en co-zuivering van oplosbare niet-blaasjes geassocieerde biomoleculen, terwijl het ook de integriteit van blaasjes beïnvloedt9. Bovendien is dit proces tijdrovend, handmatig intensief en zeer beperkt in doorvoer vanwege apparatuurbeperkingen.
Het huidige protocol beschrijft een alternatieve techniek voor ultracentrifugatie van dichtheidsgradiënt: grootte-exclusiechromatografie (SEC). Deze methode is gedemonstreerd voor omgevingsmycobacteriën en in het huidige werk is het geëxtrapoleerd naar Mtb10. Een in de handel verkrijgbare kolom en automatische fractiecollector kunnen de consistentie in de vesische bereiding verbeteren en de noodzaak voor specifieke, dure apparatuur verminderen. Het is ook mogelijk om dit protocol in een fractie van de tijd te voltooien in vergelijking met ultracentrifugatie van de dichtheidsgradiënt, waardoor de doorvoer toeneemt. Deze techniek is technisch minder uitdagend, waardoor het gemakkelijker te beheersen is en kan de reproduceerbaarheid tussen / intra-laboratoria vergroten. Ten slotte heeft SEC een hoge scheidingsefficiëntie en is zachtaardig, waardoor de integriteit van de blaasjes behouden blijft.

<table><tbody><tr><td>20x MES SDS Running Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate</td><td>Corning</td><td>15705-066</td><td></td></tr><tr><td>Automatic Fraction Collector</td><td>IZON Science</td><td>AFC-V1-USD</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark Pre-stained Protein Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10748010</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra 6R</td><td></td></tr><tr><td>Centricon Plus - 70 Centrifugal filter, 100 kDa cutoff</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC710008</td><td>Ultrafiltratie apparaat gebruikt in stap 1.1</td></tr><tr><td>Electroblotting System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>09-528-135</td><td></td></tr><tr><td>EM Grade Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 200 mesh Cu Grids</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>FCF200H-Cu-TA</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG H&amp;L (Alkaline Phosphatase), whole molecule, 1 mL</td><td>AbCam</td><td>ab6790</td><td>Secundaire antilichaam</td></tr><tr><td>JEM-1400 Transmission Electron Microscope</td><td>JOEL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>BIOTEK</td><td>Epoch</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis GroES (Gene Rv3814c)</td><td>BEI Resources</td><td>NR-49223</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LpqH (Gene Rv3763)</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13792</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>Monocolonal Anti-Mycobacterium tuberculosis LAM, Clone CS-35</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13811</td><td>Primair antilichaam</td></tr><tr><td>NanoClean 1070</td><td>Fischione Instruments</td><td></td><td>Voor plasma schoonmaak van de TEM grid</td></tr><tr><td>Nanosight uitgerust met spuitpomp en computer met NanoSight NTA software</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane, Roll, 0.2 &mu;m</td><td>BioRad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline, 1X without calcium and magnesium</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>BioRad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>qEV Original 35 nm 5/pk</td><td>IZON Science</td><td>SP5-USD</td><td>SEC kolom</td></tr><tr><td>SDS sample buffer</td><td>Boster</td><td>AR1112</td><td>In-house recept gebruikt in deze procedure, echter is dit product equivalent</td></tr><tr><td>SDS-PAGE gel chamber</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Sigmafast BCIP/NBT</td><td>Millipore Sigma</td><td>B5655</td><td></td></tr><tr><td>Silver Stain Plus Kit</td><td>BioRad</td><td>1610449</td><td>In-house protocol gebruikt in deze procedure, echter is deze kit equivalent</td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

mycobacterium tuberculose extracellulaire vesikelverrijking door grootte-uitsluitingschromatografie

Mycobacterium tuberculosis Extracellular Vesicle Enrichment through Size Exclusion Chromatography

De rol van extracellulaire blaasjes (EV's) in de context van bacteriële infectie is naar voren gekomen als een nieuwe weg voor het begrijpen van microbiële fysiologie. Specifiek spelen Mycobacterium tuberculosis (Mtb) EV's een rol in de gastheer-pathogeen interactie en reactie op omgevingsstress. Mtb EV's zijn ook zeer antigeen en hebben potentieel als vaccincomponenten. De meest gebruikelijke methode voor het zuiveren van Mtb EV's is ultracentrifugatie van de dichtheidsgradiënt. Dit proces heeft verschillende beperkingen, waaronder een lage doorvoer, lage opbrengst, afhankelijkheid van dure apparatuur, technische uitdagingen en het kan een negatieve invloed hebben op de resulterende voorbereiding. Size exclusion chromatography (SEC) is een zachtere alternatieve methode die veel van de beperkingen van ultracentrifugatie bestrijdt. Dit protocol toont aan dat SEC effectief is voor Mtb EV-verrijking en produceert hoogwaardige Mtb EV-preparaten met een verhoogde opbrengst op een snelle en schaalbare manier. Bovendien toont een vergelijking met ultracentrifugatie van dichtheidsgradiënt door kwantificerings- en kwalificatieprocedures de voordelen van SEC aan. Terwijl de evaluatie van ev-kwantiteit (nanodeeltjestrackinganalyse), fenotype (transmissie-elektronenmicroscopie) en inhoud (Western blotting) is afgestemd op Mtb EV's, kan de geleverde workflow worden toegepast op andere mycobacteriën.

Kweekfiltraateiwit (CFP) van Mycobacterium tuberculosis (Mtb) werd geconcentreerd, gekwantificeerd en vervolgens werd 3 mg materiaal aangebracht op een sec-kolom (size exclusion chromatography). De eiwit- en deeltjesconcentraties werden opgesomd door respectievelijk BCA en NTA. De verwachte marges voor eiwit- en deeltjesterugwinning plus de exacte waarden die voor deze resultaten zijn verkregen, worden weergegeven in tabel 1. Waarden die veel hoger zijn dan deze bereiken kunnen wijzen op verontr...

Dit protocol beschrijft grootte-uitsluitingschromatografie, een gemakkelijke en reproduceerbare techniek voor het verrijken van Mycobacterium tuberculosis extracellulaire blaasjes uit kweeksupernatanten.

Mycobacterium tuberculose Extracellulaire vesikelverrijking door grootte-uitsluitingschromatografie

The role of extracellular vesicles (EVs) in the context of bacterial infection has emerged as a new avenue for understanding microbial physiology. ...

Dit protocol vermindert de technische complexiteit en tijd die nodig is voor de verrijking van extracellulaire blaasjes van Mycobacterium tuberculosis, Mtb EV's. Het biedt een zacht alternatief voor traditionele ultracentrifugatie en op dichtheid gebaseerde technieken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gemakkelijk uit te voeren is, waardoor het beter reproduceerbaar is.Het biedt een hoge opbrengst van Mtb EV's met minimale niet-EV eiwit co-verrijking. De procedure wordt gedemonstreerd door Joanie Ryan, een voormalige afgestudeerde student van ons lab. Bereid om te beginnen een centrifugaalfilter met moleculair gewichtsafsluiting van 100 kilodalton voor door de volledige volumecapaciteit van PBS toe te voegen.Centrifugeer gedurende vijf minuten op 2.800 maal G bij 4 graden Celsius. Gooi de flowthrough en eventuele resterende PBS weg en vul de monsterkamer met Mtb CFP tot de maximale capaciteit. Centrifugeer bij 2.800 maal G bij 4 graden Celsius totdat het volume is teruggebracht tot het minimumvolume van het ultrafiltratieapparaat.Herhaal dit zo nodig totdat het gehele monster voldoende is verkleind. Voeg 1X PBS toe aan de filtereenheid die het concentraat bevat tot de totale apparaatcapaciteit. Verminder het volume zoals eerder beschreven en herhaal deze stap vijf keer om volledig wassen en bufferuitwisseling te garanderen.Herstel vervolgens het geconcentreerde CFP-retentaat van 100 kilodalton of 100R, volgens de specificaties van het ultrafiltratieapparaat. Was het filter minstens drie keer met een minimaal volume van 1X PBS en trek de was met de 100R om het herstel te maximaliseren. Gebruik verschillende verdunning van monsters in PBS en kwantificeer het 100R-materiaal met een bicinchoninische assay.Test het monster in drievoud. Laat de grootte-uitsluitingschromatografie, of SEC-kolom, in evenwicht brengen met kamertemperatuur. Schakel de AFC in met de aan/uit-schakelaar aan de achterkant van de toreneenheid en druk indien nodig op Setup op het aanraakscherm van het hoofdmenu om de instellingen voor de loadcel aan te passen.Lijn in het installatiescherm de carrousel uit door Carrousel te selecteren, gevolgd door Kalibreren. Plaats de carrousel met de 13 kleine gaatjes naar boven in de AFC-toren en pas de carrousel aan door op de min- of plusknoppen te drukken, zodat het vloeistofmondstuk zich direct boven de spoelpositie bevindt. Verwijder de doppen uit de gebalanceerde SEC-kolom en schuif de SEC-kolom in de juiste kolombevestiging.Installeer het zorgvuldig op de AFC-toren. Zorg ervoor dat het radiofrequentie-identificatielabel op de kolom naar de AFC is gericht en controleer of de verbinding tussen de kolom en de klep veilig is. Plaats de afvaluitlaatbuis in een opvangbak.Selecteer in het installatiescherm Collectieschema en stel het aantal in op 13 en de grootte op 0,5 milliliter door op de min- of plusknoppen te drukken. Laat de instelling voor het buffervolume staan als de standaardinstelling van 2,7 milliliter en sluit vervolgens het venster met het verzamelschema. Selecteer Verzameling starten in het startscherm en bevestig de collectieparameters door Ja te selecteren.Laad 13 gelabelde microcentrifugebuizen van 1,7 milliliter met de deksels open en gericht naar het carrouselcentrum. Ga verder met de AFC door OK te selecteren, monteer vervolgens het kolomreservoir en ga opnieuw verder door op OK te drukken. Selecteer de optie om de kolom leeg te maken door op Ja te drukken en voeg één kolomvolume van 0,2 micrometer gefilterd PBS toe om eventuele opslagbuffers te verwijderen. Zodra de spoeling is voltooid, gaat u verder met de AFC door op OK te drukken. Plaats het carrouseldeksel over de AFC en druk op OK. Gebruik een pipet om overtollige buffer uit de kolom te verwijderen.Breng drie milligram 100R monster naar 500 microliter met 1X PBS en voeg het monster toe aan de bovenkant van de kolom. Bereid één kolomvolume van 0,2 micrometer gefilterd PBS voor. Zet de AFC vooruit en laat het monster in de fret lopen.Zodra het monster volledig in de kolom is gekomen, voegt u de eerder voorbereide PBS toe aan het reservoir. Controleer de uitvoering van de AFC terwijl deze eerst het leegtevolume en vervolgens de opgegeven fracties verzamelt. Nadat de run is voltooid en de carrousel terugkeert naar de afvalpositie, verwijdert u de afdekking en de fractiebuizen uit de carrousel.Voor 0,5 millimeter fracties verzameld uit drie milligram 100R Mtb CFP, meet de eiwitconcentratie met behulp van de micro-BCA met een 1: 3 verdunning voor fracties genummerd 1 tot 7 van elk monster in drievoud. Gebruik voor 0,5 milliliter fracties genummerd 5 tot 13 de BMA zonder verdunning voor elk monster in drievoud. Voeg sds-monsterbuffer toe aan 10 microliter van elke fractie en vijf microgram CFP en 100R.Kook vijf minuten op 100 graden Celsius. Laad vervolgens een 4 tot 12% Bis-Tris-gel met een moleculaire gewichtsladder voor polyacrylamidegelelektroforese of PAGE. Voer een SDS-PAGE-gel uit met behulp van 1X MES-loopbuffer en een 200-volt stroom gedurende 35 minuten.Verwijder de gel van de cassette en breng gedurende minimaal een uur een stroom van 50 volt aan om de opgeloste eiwitten over te brengen naar een nitrocellulosemembraan van 0,2 micrometer. Voer ten slotte de Western blot-analyse uit om de eiwitten te evalueren. Een SDS-PAGE gel gekleurd met zilver toont het algemene eiwitprofiel voor elke fractie.Uit de gegevens blijkt dat de latere fracties meer eiwit bevatten en lijken op het 100R-materiaal. Western blots die LAM, LpqH en GroES detecteren, tonen aan dat eiwitmarker verandert over de fracties. Transmissie-elektronenmicroscopie, of TEM-beelden, van SEC-fracties 1 tot 3 getrokken voorafgaand aan fixatie worden hier weergegeven.De ultracentrifugatie van de dichtheidsgradiënt van Mtb EV's was negatief gekleurd voor TEM-beeldvorming. De nanodeeltjes tracking analyse, of NTA-verdeling, van SEC-fracties 1 tot 3 wordt hier weergegeven. De dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie MTB EV's werden geanalyseerd met nanodeeltjes tracking analyse, en de grootteverdeling wordt hier weergegeven.Dit protocol is geoptimaliseerd voor EV-zuivering vanaf drie milligram 100R. Als de eiwitbelasting varieert, kan de aanbevolen verdunnings- en BCA-strategie voor resulterende fracties moeten worden aangepast. Mtb EV's die met deze techniek zijn bereid, kunnen worden gebruikt voor downstream compositionele en op omics gebaseerde studies.Ze zijn ook geschikt voor in vitro en in vivo experimenten. Deze techniek biedt een gemakkelijke en efficiënte manier om hoogwaardige Mtb EV-preparaten te produceren, waardoor de weg wordt vrijgemaakt voor een verhoogde reproduceerbaarheid in toekomstige Mtb EV-experimenten.

mycobacterium-tuberculosis-extracellular-vesicle-enrichment-through

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the stepwise isolation of extracellular vesicles (EVs) from Mycobacterium tuberculosis cultured under iron-limiting conditions that mimic the host environment. It outlines the use of ultrafiltration, differential centrifugation, and density gradient separation to enrich and identify EV-containing fractions.

Isolation of Siderophore-Containing Extracellular Vesicles from Mycobacterium tuberculosis

Source: Watson, D. C., et.al. Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the isolation and concentration of extracellular vesicles (EVs) derived from the outer membrane of genetically engineered bacteria. The process involves culturing the bacteria to release EVs, followed by sequential centrifugation and filtration steps to remove cells and debris. Finally, ultrafiltration is used to...

Isolation and Enrichment of Outer Membrane-Derived Extracellular Vesicles from Bacteria

Source: Watson, D. C., et al. Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the use of size exclusion chromatography with porous resin beads to isolate bacterial extracellular vesicles (EVs) from a bacterial culture filtrate. Larger EVs elute early by bypassing the resin pores, while smaller proteins enter the pores and elute later.

Isolation of Bacterial Extracellular Vesicles Using Size-Exclusion Chromatography 

In this video, we demonstrate a technique–size exclusion chromatography–to separate a heterogenous population of outer membrane vesicles or OMVs derived from bacteria. These vesicles are nanosized spherical structures and are separated into large and small subpopulations based on their size through Size Exclusion Chromatography.

Size Exclusion Chromatography Based Separation of Bacterial Extracellular Vesicles: A Technique to Separate Heterogenous Population of Gram-Negative Bacterial Outer Membrane Vesicles Based on Their Size

This video demonstrates the isolation and concentration of bacterial culture filtrate proteins, which include bacterial extracellular vesicles, using ultrafiltration. The concentrated extracellular vesicles serve as diagnostic markers for disease detection.

Bacterial Culture Filtrate Protein Concentration using an Ultrafiltration Device

This video demonstrates the size exclusion chromatography (SEC) technique for purifying bacterial extracellular vesicles (EVs) from the culture filtrate of Mycobacterium tuberculosis (Mtb). The technique utilizes a porous resin-packed column to obtain purified fractions of EVs. The porous particles selectively allow smaller proteins to enter the pores, resulting in slower elution. At the same time, EVs are excluded from entering the pores due to their larger size and are eluted first.

A Size Exclusion Chromatography Technique to Purify Mycobacterial Extracellular Vesicles

Mycobacterium tuberculose vertoont een verhoogde productie en afgifte van extracellulaire blaasjes als reactie op lage ijzer omstandigheden. Dit werk Details een protocol voor het genereren van lage ijzer omstandigheden en methoden voor de zuivering en karakterisering van mycobacteriële extracellulaire blaasjes vrijgegeven in reactie op ijzertekort.

Isolatie en karakterisering van extracellulaire vesicles geproduceerd door ijzer-beperkte mycobacteriën

Bacteriële blaasjes spelen een belangrijke rol bij pathogenese en hebben veelbelovende biotechnologische toepassingen. De heterogeniteit van blaasjes bemoeilijkt analyse en gebruik; daarom is een eenvoudige, reproduceerbare methode nodig om verschillende groottes van blaasjes te scheiden. Hier demonstreren we het gebruik van grootte-uitsluitingschromatografie om heterogene blaasjes geproduceerd door Aggregatibacter actinomycetemcomitanste scheiden .

Grootte uitsluiting chromatografie om bacteriële buitenste membraanblaasje heterogeniteit te analyseren

Bacteriën scheiden nanometergrote extracellulaire blaasjes (EV's) af die bioactieve biologische moleculen dragen. EV-onderzoek richt zich op het begrijpen van hun biogenese, rol in microbe-microbe en gastheer-microbe interacties en ziekte, evenals hun potentiële therapeutische toepassingen. Een workflow voor schaalbare isolatie van EV's van verschillende bacteriën wordt gepresenteerd om standaardisatie van EV-onderzoek te vergemakkelijken.

Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën

Dit protocol beschrijft de verrijking van inheemse mycobacteriële extracellulaire vesikels (mEV's) uit axenische culturen van Mycobacterium smegmatis (Msm) en hoe mCherry (een rode fluorescerende reporter)-bevattende recombinante MsmEV's kunnen worden ontworpen en verrijkt. Ten slotte verifieert het de nieuwe aanpak met de verrijking van MsmEV's die het EsxA-eiwit van Mycobacterium tuberculosis bevatten.

Verrijking van inheemse en recombinante extracellulaire blaasjes van mycobacteriën

Dit protocol beschrijft de isolatie van kleine extracellulaire blaasjes uit muisskeletspier en beenmerg met behulp van enzymatische vertering en grootte-uitsluitingschromatografie, waardoor reproduceerbare terugwinning van vesikelverrijkte fracties uit structureel complexe, laagopbrengstweefsels mogelijk is voor downstream moleculaire analyse.

Isolatie van kleine extracellulaire blaasjes uit muisskeletspier en beenmerg door grootte-uitsluitingschromatografie

Leer een reproduceerbare methode voor het verrijken van Mycobacterium tuberculosis extracellulaire vesikels via grootte-uitsluitingschromatografie. Deze techniek minimaliseert co-verrijking van niet-EV-eiwitten en vereenvoudigt het isolatieproces.

Mycobacterium tuberculose Extracellulaire vesikelverrijking door grootte-uitsluitingschromatografie

Meer video's verkennen