Name: Kwantitatieve 3D-beeldvorming van trypanosoma cruzi-geïnfecteerde cellen, slapende amastigoten en T-cellen in intacte geklaarde organen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Leer lichtveldfluorescentiemicroscopie voor 3D-beeldvorming van Trypanosoma cruzi-parasieten en T-cellen in geklaarde organen. Deze methode verbetert de evaluatie van behandelingsresultaten bij Chagas-ziekte.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dr. Etsuo Susaki voor hun waardevolle hulp en aanbevelingen met betrekking tot weefselzuivering en immunostaining protocollen. Ook zijn we M. Kandasamy van de CTEGD Biomedical Microscopy Core dankbaar voor technische ondersteuning met behulp van LSFM en confocale beeldvorming. We bedanken ook alle leden van Tarleton Research Group voor nuttige suggesties tijdens dit onderzoek.

<ol><li>Schofield, C. J., Jannin, J., Salvatella, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+Chagas+disease+control%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The future of Chagas disease control.</a> Trends in Parasitology. 22 (12), 583-588 (2006).</li>
<li>Marin-Neto, J. A., Cunha-Neto, E., Maciel, B. C., Simoes, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+chronic+Chagas+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of chronic Chagas heart disease.</a> Circulation. 115 (9), 1109-1123 (2007).</li>
<li>Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+in+Trypanosoma+cruzi+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells in Trypanosoma cruzi infection.</a> Seminars in Immunopathology. 37 (3), 233-238 (2015).</li>
<li>Padilla, A. M., Simpson, L. J., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insufficient+TLR+activation+contributes+to+the+slow+development+of+CD8%2B+T+cell+responses+in+Trypanosoma+cruzi+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insufficient TLR activation contributes to the slow development of CD8+ T cell responses in Trypanosoma cruzi infection.</a> Journal of Immunology. 183 (2), 1245-1252 (2009).</li>
<li>Basso, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+immune+response+in+experimental+Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modulation of immune response in experimental Chagas disease.</a> World Journal of Experimental Medicine. 3 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Martin, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T-Cell+responses+to+Trypanosoma+cruzi+are+highly+focused+on+strain-variant+trans-sialidase+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">CD8+ T-Cell responses to Trypanosoma cruzi are highly focused on strain-variant trans-sialidase epitopes.</a> PLOS Pathogens. 2 (8), 77(2006).</li>
<li>Sanchez-Valdez, F. J., Padilla, A., Wang, W., Orr, D., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+dormancy+protects+Trypanosoma+cruzi+during+extended+drug+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Spontaneous dormancy protects Trypanosoma cruzi during extended drug exposure.</a> Elife. 7, 34039(2018).</li>
<li>Sanchez-Valdez, F., Padilla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+dormant+Trypanosoma+cruzi+amastigotes+using+bioluminescent-fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ detection of dormant Trypanosoma cruzi amastigotes using bioluminescent-fluorescent reporters.</a> Methods in Molecular Biology. 1955, 179-186 (2019).</li>
<li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), 199369(2021).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21, 61-79 (2020).</li>
<li>Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guidebook+for+DISCO+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A guidebook for DISCO tissue clearing.</a> Molecular Systems Biology. 17, 9807(2021).</li>
<li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning+reveals+cancer+metastasis+and+therapeutic+antibody+targeting+in+the+entire+body%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Deep learning reveals cancer metastasis and therapeutic antibody targeting in the entire body.</a> Cell. 179 (7), 1661-1676 (2019).</li>
<li>Qi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDISCO%3A+Advanced+solvent-based+clearing+method+for+imaging+whole+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs.</a> Science Advances. 5, 8355(2019).</li>
<li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22, 317-327 (2019).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modeling.</a> The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).</li>
<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+with+single-cell+resolution+by+tissue+decolorization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization.</a> Cell. 159 (4), 911-924 (2014).</li>
<li>Tainaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+landscape+for+tissue+clearing+based+on+hydrophilic+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents.</a> Cell Reports. 24 (8), 2196-2210 (2018).</li>
<li>Murakami, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+single-cell-resolution+whole-brain+atlas+using+CUBIC-X+expansion+microscopy+and+tissue+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing.</a> Nature Neuroscience. 21, 625-637 (2018).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+probing+of+intact+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular probing of intact human organs.</a> Cell. 180 (4), 796-812 (2020).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+a+simple%2C+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+for+mapping+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10, 508-513 (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+whole-organ%2Fbody+staining+and+imaging+based+on+electrolyte-gel+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues.</a> Nature Communications. 11, 1982(2020).</li>
<li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Bustamante, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+drug+regimen+clears+active+and+dormant+trypanosomes+in+mouse+models+of+Chagas+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A modified drug regimen clears active and dormant trypanosomes in mouse models of Chagas disease.</a> Science Translational Medicine. 12 (567), (2020).</li>
<li>Wang, H., Khoradmehr, A., Tamadon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACT+or+PACT%3A+A+comparison+between+free-acrylamide+and+acrylamide-based+passive+sodium+dodecyl+sulfate+tissue+clearing+for+whole+tissue+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Journal%22%5BJournal%5D)">FACT or PACT: A comparison between free-acrylamide and acrylamide-based passive sodium dodecyl sulfate tissue clearing for whole tissue imaging.</a> Cell Journal. 21 (2), 103-114 (2019).</li>
<li>Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+tissue+clearing+and+multi-organ+volumetric+imaging+enable+quantitative+visualization+of+sparse+immune+cell+populations+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation.</a> Frontiers in Immunology. 11, 599495(2020).</li>
<li>Messal, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+and+clearing+for+whole-organ+immunofluorescence+by+FLASH%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval and clearing for whole-organ immunofluorescence by FLASH.</a> Nature Protocols. 16, 239-262 (2021).</li>
<li>Kolesova, H., Capek, M., Radochova, B., Janacek, J., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+and+3D+imaging+techniques+for+visualization+of+GFP-expressing+mouse+embryos+and+embryonic+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts.</a> Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+tiling+light+sheet+microscope+for+imaging+of+cleared+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A versatile tiling light sheet microscope for imaging of cleared tissues.</a> Cell Reports. 33, 108349(2020).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.

De afwezigheid van uitgebreide beeldvorming van het hele orgaan van parasieten en de immuunrespons beperkt het begrip van de complexiteit van de gastheer-parasietinteracties en belemmert de evaluatie van therapieën voor de ziekte van Chagas. De huidige studie heeft de CUBIC-pijplijn aangenomen om intacte organen en weefsels van T. cruzi-geïnfecteerde muizen te verduidelijken en te kleuren.
In deze studie werden meerdere weefselzuiveringsprotocollen getest (PACT32</su...

De ziekte van Chagas, veroorzaakt door de protozoaire parasiet T. cruzi, is een van 's werelds meest verwaarloosde tropische ziekten en veroorzaakt ongeveer 13.000 jaarlijkse sterfgevallen. De infectie evolueert vaak van een acuut naar een chronisch stadium dat cardiale pathologie produceert bij 30% van de patiënten, waaronder aritmieën, hartfalen en plotselinge dood 1,2. Ondanks de sterke immuunrespons van de gastheer die tijdens de acute fase tegen de parasiet werd opgewekt, blijven lage aantallen parasieten chronisch bestaan gedurende het hele leven van de gastheer in weefsels zoals het hart en de skeletspieren. Verschillende factoren, waaronder het vertraagde begin van adaptieve immuunresponsen en de aanwezigheid van niet-replicerende vormen van de parasiet, kunnen bijdragen aan het vermogen van T. cruzi om een volledige eliminatie door het immuunsysteem te voorkomen 3,4,5,6. Bovendien vertonen niet-replicerende slapende vormen van de parasiet een lage gevoeligheid voor trypanocidale geneesmiddelen en kunnen ze gedeeltelijk verantwoordelijk zijn voor het falen van de behandeling dat in veel gevallen wordt waargenomen 7,8.
De ontwikkeling van nieuwe beeldvormingstechnieken biedt de mogelijkheid om inzicht te krijgen in de ruimtelijke verdeling van de parasieten in de geïnfecteerde weefsels en hun relatie met de immuuncellen die betrokken zijn bij hun controle. Deze kenmerken zijn cruciaal voor een beter begrip van de processen van parasietbestrijding door het immuunsysteem en het volgen van de zeldzame slapende parasieten die aanwezig zijn in chronische weefsels.
Light-sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM) is een van de meest uitgebreide en onbevooroordeelde methoden voor 3D-beeldvorming van grote weefsels of organen zonder dunne secties. Light-sheet microscopen gebruiken een dun vel licht om alleen de fluoroforen in het brandpuntsvlak te prikkelen, fotobleaching en fototoxiciteit van monsters te verminderen en beelden van duizenden weefsellagen op te nemen met behulp van ultrasnelle camera's. Het hoge niveau van weefseltransparantie dat nodig is voor de juiste penetratie van het laserlicht in weefsels wordt verkregen door de brekingsindex (RI) te homogeniseren na weefseldelipidatie en ontkleuring, waardoor de verstrooiing van licht wordt verminderd en beelden van hoge kwaliteit 9,10,11 worden weergegeven.
Weefselzuiveringsbenaderingen zijn ontwikkeld voor de beeldvorming van hele muizen 12,13,14, organoïden 15,16,17, organen die reporter fluorescerende markers tot expressie brengen 18,19,20,21,22,23, en onlangs een beperkt aantal menselijke weefsels24 . De huidige methoden voor weefselzuivering zijn ingedeeld in drie families: (1) organische methoden op basis van oplosmiddelen zoals DISCO-protocollen 25,26, (2) op hydrogel gebaseerde methoden, zoals CLARITY27, en waterige methoden, zoals CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails en Computational analysis)18,19,28,29 . CUBIC-protocollen behouden de orgaanvorm en weefselintegriteit, waardoor de fluorescentie van endogene tot expressie gebrachte reportereiwitten behouden blijft. De meest recente update van deze techniek, CUBIC-HistoVision (CUBIC-HV), maakt ook de detectie van epitopen mogelijk met behulp van fluorescerend gelabelde antilichamen en DNA-etikettering28.
In het huidige protocol werd de CUBIC-pijplijn gebruikt voor het detecteren van T. cruzi die fluorescerende eiwitten tot expressie brengt in geklaarde intacte muizenweefsels. Optisch transparante weefsels werden LSFM-beelden, 3D gereconstrueerd en het precieze totale aantal T. cruzi geïnfecteerde cellen, slapende amastigoten en T-cellen per orgaan werden automatisch gekwantificeerd. Ook werd dit protocol met succes aangenomen om uniforme etikettering van geruimde organen met antilichamen en nucleaire vlekken te verkrijgen. Deze benaderingen zijn essentieel voor het begrijpen van de uitbreiding en controle van T. cruzi in geïnfecteerde gastheren en zijn nuttig voor het volledig evalueren van chemo- en immunotherapieën voor de ziekte van Chagas.

```html
<table><tbody><tr><td>1-methylimidazole</td><td>Millipore Sigma</td><td>616-47-7</td><td></td></tr><tr><td>2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolone (Antipyrine</td><td>TCI</td><td>D1876</td><td></td></tr><tr><td>6-wells cell culture plates</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 anti-mouse Fab fragment</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>315-607-003</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 anti-rabbit Fab fragment</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>111-607-003</td><td></td></tr><tr><td>anti-GFP nanobody Alexa Fluor 647</td><td>Chromotek</td><td>gb2AF647-50</td><td></td></tr><tr><td>anti-RFP</td><td>Rockland</td><td>600-401-379</td><td></td></tr><tr><td>anti-&alpha;-SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td></td></tr><tr><td>B6.C+A2:A44g-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Strain #007914</td><td>Common Name: Ai14, Ai14D of Ai14(RCL-tdT)-D</td></tr><tr><td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor tm14(CAG-tdTomato)Hze/J mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Strain #007914</td><td>Common Name: Ai14, Ai14D of Ai14(RCL-tdT)-D</td></tr><tr><td>BOBO-1 Iodide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>#A7906</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J-Tg(Cd8a*-cre)B8Asin/J mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Strain #032080</td><td>Common Name: Cd8a-Cre (E8III-Cre)</td></tr><tr><td>CAPSO</td><td>Sigma</td><td>#C2278</td><td></td></tr><tr><td>Cleaning wipes Kimwipes</td><td>&nbsp;Kimberly-Clark</td><td>T8788</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 790</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-HV 1 3D immunostaining kit</td><td>TCI</td><td>C3699</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-HV 1 3D nuclear staining kit</td><td>TCI</td><td>C3698</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-L</td><td>TCI</td><td>T3740</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-P</td><td>TCI</td><td>T3782</td><td></td></tr><tr><td>CUBIC-R+</td><td>TCI</td><td>T3741</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate-based gel superglue</td><td>Scotch</td><td>571605</td><td></td></tr><tr><td>DiR (DiIC18(7); 1,1’-dioctadecyl-3,3,3’3’-tetramethylindotricarbocyanine iodide) Company: Biotium</td><td>Biotium</td><td>#60017</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Centrifuge tubes 15 mL</td><td>Corning</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Centrifuge tubes 50&nbsp; mL</td><td>Corning</td><td>CLS430290</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>J16920.BBR</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma</td><td>#H3884 or #H4272</td><td></td></tr><tr><td>Imaris File Converter x64</td><td>BitPlane</td><td>v9.2.0</td><td></td></tr><tr><td>Imaris software</td><td>BitPlane</td><td>v9.3</td><td></td></tr><tr><td>ImSpector software</td><td>LaVision BioTec, Miltenyi Biotec</td><td>v6.7</td><td></td></tr><tr><td>Intravenous injection needle 23-G</td><td>Sartori, Minisart Syringe filter</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td>lint free wipes</td></tr><tr><td>Light-sheet fluorescent microscope</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>ULtramicroscope II imaging system</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>041838.K2</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette tips, 10 &micro;L, 200 &micro;L and 1,000 &micro;L</td><td>Axygen</td><td>T-300, T-200-Y and T-1000-B</td><td></td></tr><tr><td>Motorized pipet dispenser</td><td>Fisher Scientific, Fisherbrand</td><td>03-692-172</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Solution</td><td>TCI</td><td>M3294</td><td></td></tr><tr><td>N-butyldiethanolamine</td><td>TCI</td><td>B0725</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>TCI</td><td>N0078</td><td></td></tr><tr><td>N-Methylnicotinamide</td><td>TCI</td><td>M0374</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>RedDot 2 Far-Red Nuclear Stain</td><td>Biotium</td><td>#40061</td><td></td></tr><tr><td>Sacrifice Perfusion System</td><td>Leica</td><td>10030-380</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipettes</td><td>Costar Sterile</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>TAITEC</td><td>BR-43FM MR</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide (NaN3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>447815000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L13098.36</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>447302500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>014707.A9</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX-G Green Nucleic Acid Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr></tbody></table>
```

kwantitatieve 3d-beeldvorming van trypanosoma cruzi-geïnfecteerde cellen, slapende amastigoten en t-cellen in intacte geklaarde organen

Quantitative 3D Imaging of Trypanosoma cruzi-Infected Cells, Dormant Amastigotes, and T Cells in Intact Clarified Organs

De ziekte van Chagas is een verwaarloosde pathologie die wereldwijd miljoenen mensen treft, voornamelijk in Latijns-Amerika. De ziekteverwekker van Chagas, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), is een obligate intracellulaire parasiet met een gevarieerde biologie die verschillende zoogdiersoorten infecteert, waaronder mensen, waardoor cardiale en spijsverteringspathologieën ontstaan. Betrouwbare detectie van T. cruzi in vivo infecties is al lang nodig om de complexe biologie van de ziekte van Chagas te begrijpen en de uitkomst van behandelingsregimes nauwkeurig te evalueren. Het huidige protocol demonstreert een geïntegreerde pijplijn voor geautomatiseerde kwantificering van T. cruzi-geïnfecteerde cellen in 3D-gereconstrueerde, gewiste organen. Light-sheet fluorescerende microscopie maakt het mogelijk om actief prolifererende en slapende T. cruzi-parasieten en immuuneffectorcellen in hele organen of weefsels nauwkeurig te visualiseren en te kwantificeren. Ook werd de CUBIC-HistoVision-pijplijn voor het verkrijgen van uniforme etikettering van geruimde organen met antilichamen en nucleaire vlekken met succes aangenomen. Weefselopruiming in combinatie met 3D-immunostaining biedt een onbevooroordeelde benadering om geneesmiddelenbehandelingsprotocollen uitgebreid te evalueren, het begrip van de cellulaire organisatie van T. cruzi-geïnfecteerde weefsels te verbeteren en zal naar verwachting ontdekkingen bevorderen met betrekking tot anti-T. cruzi immuunresponsen, weefselschade en reparatie bij de ziekte van Chagas.

CUBIC vaste weefsels werden gewassen met PBS om fixatieven te verwijderen en vervolgens geïncubeerd met CUBIC-L cocktails, een basis gebufferde oplossing van aminoalcoholen die pigmenten en lipiden uit het weefsel extraheren, wat resulteert in verkleuring van weefsel met behoud van weefselarchitectuur. Rasterlijnen in het papier zijn te zien door de weefsels die wijzen op een geschikte opruiming van de organen (figuur 2A). Na delipidatie werden weefsels gewassen en ondergedo...

Het huidige protocol beschrijft lichtblad fluorescerende microscopie en geautomatiseerde software-ondersteunde methoden om prolifererende en slapende Trypanosoma cruzi-parasieten en T-cellen in intacte, gewiste organen en weefsels te visualiseren en nauwkeurig te kwantificeren. Deze technieken bieden een betrouwbare manier om behandelingsresultaten te evalueren en bieden nieuwe inzichten in interacties tussen parasieten en gastheer.

Kwantitatieve 3D-beeldvorming van trypanosoma cruzi-geïnfecteerde cellen, slapende amastigoten en T-cellen in intacte geklaarde organen

Chagas disease is a neglected pathology that affects millions of people worldwide, mainly in Latin America. The Chagas disease agent, Trypanosoma cruzi ...

Deze techniek zorgde voor een completer en 3D-beeld van hele transparante organen en was nuttig voor kwantificering, niet alleen van replicerende, maar ook slapende parasiet- en immuunfactorcellen. Deze techniek stelt ons in staat om de speciale associatie van parasieten, immuuncellen en de weefselschade als gevolg van de infectie te bepalen. Epitoop immunostaining en DNA-etikettering waren ook vergelijkbaar met deze techniek.Dit protocol werd effectief gebruikt voor het beoordelen van behandelingsresultaten in muismodellen van de ziekte van Chagas. Een behandeling van hogere individuele doses, minder vaak gegeven gedurende een langere behandelingsperiode, elimineert zowel replicerende als slapende parasieten. Caleb Hawkins, een onderzoekstechnicus uit het laboratorium van Rick Tarleton, demonstreert de procedure.Na het euthanaseren, ontleden en fixeren van de organen van een geïnfecteerde muis zoals beschreven in het manuscript, dompelt u individuele organen onder in 10 milliliter van 50% met water verdunde CUBIC-L, met zacht schudden bij kamertemperatuur in conische buizen van 50 milliliter 's nachts beschermd tegen licht. Vervang de volgende dag 50% CUBIC-L door 10 milliliter 100% CUBIC-L en incubeer gedurende zes dagen bij 37 graden Celsius, terwijl de buis plat op de shaker-incubator blijft. Aan het einde van deze incubatieperiode moeten de weefsels bijna volledig transparant zijn.Was de transparante organen twee keer met PBS gedurende twee uur bij 37 graden Celsius, met zacht schudden. Breng bij elke wasbeurt de weefsels over naar een nieuwe conische buis van 50 milliliter om Triton X-100 te verwijderen. Verdun voor DNA-kleuring de in de handel verkrijgbare nucleïnezuurkleurstof in vijf milliliter kleuringsbuffer op 1:2.500.Dompel vervolgens het weefsel onder in een conische buis van 15 milliliter met nucleaire kleurstofoplossing en incubeer bij 37 graden Celsius, met zachte rotatie gedurende vijf dagen in een staande positie. Was het weefsel drie keer met 15 milliliter 3D nucleaire vlekkenwasbuffer gedurende twee uur bij kamertemperatuur, met zacht schudden. Bereken de vereiste hoeveelheid primaire en secundaire antilichamen.Meng primaire en secundaire antilichamen in een amberkleurige buis van twee milliliter en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 1,5 uur. Meng voor bufferuitwisseling 7,5 milliliter 2x HV1 3D immunostaining buffer met 7,5 milliliter dubbel gedestilleerd water. Dompel het weefselmonster onder in de buffer en incubeer gedurende 1,5 uur bij 32 graden Celsius, met zacht schudden in een conische buis van 15 milliliter in een horizontale positie.Verzamel het weefselmonster uit de bufferuitwisselingsmedia en dompel het onder in de antilichaamkleuringsoplossing. Incubeer weefsels individueel gedurende een week bij 32 graden Celsius en schud de buizen voorzichtig in een staande positie weg van het licht. Verplaats de weefselmonsters naar vier graden Celsius en incubeer in een staande positie.Na het afkoelen van de HV1 3D immunostaining wasbuffer tot vier graden Celsius, wast u het monster tweemaal met 15 milliliter buffer op vier graden Celsius gedurende 30 minuten, elk met zacht schudden in een horizontale positie. Verdun formaline tot 1% in HV1 3D immunostaining wasbuffer en dompel het monster onder in acht milliliter van de oplossing gedurende 24 uur bij vier graden Celsius, met zacht schudden. Incubeer het monster nu gedurende een uur in verse 1% formaline-oplossing bij 37 graden Celsius en was het gedurende twee uur in 15 milliliter PBS bij 25 graden Celsius.Dompel transparante organen onder in een conische buis van 50 milliliter met vijf milliliter 50% water verdunde CUBIC-R +oplossing bij kamertemperatuur, met zacht schudden. Vervang het door vijf milliliter 100% CUBIC-R + en incubeer met zacht schudden gedurende twee dagen. Droog de weefsels met Kimwipes en breng ze vervolgens over naar vijf milliliter montageoplossing in een kweekplaat met zes putten en incubeer ze bij kamertemperatuur.Hecht de weefsels aan de microscoopmonsterhouder met behulp van gelsuperlijm. Dompel de monsters onder in het microscoopkwartscuvet gevuld met 120 milliliter montageoplossing. Stel ze dwars voor op hun lengteas en hecht het hart, met de apex en de aorta horizontaal uitgelijnd.3D gereconstrueerd Trypanosoma cruzi-geïnfecteerd hart vertoonde een hoger aandeel geïnfecteerde cellen in het atrium, vergeleken met ventrikels. Slapende parasieten kunnen in het hart worden geïdentificeerd, zoals afgebeeld in de 3D-vergrote inzetstukken. ZsGreen1-tot expressie brengende T-cellen, evenals Trypanosoma cruzi-geïnfecteerde cellen, werden gevisualiseerd in de skeletspieren van een CD8-reportermuis geïnfecteerd met Trypanosoma cruzi.3D-zoom-ins van 3D-gereconstrueerde afbeeldingen identificeerden T-cellen in het gebied van een geïnfecteerde cel. De interface van T-cellen in gastheer-geïnfecteerde cellen werd gevisualiseerd door confocale microscopie. In het hart van een immunodeficiënte muis werden gastheercellen gedetecteerd die waren geïnfecteerd met twee verschillende stammen van Trypanosoma cruzi, en het snijden door de weefsels toonde overvloedige met parasieten geïnfecteerde cellen in de hartboezems op verschillende weefseldiepten.Immunodetectie van vasculatuur in trypanosoma cruzi-geïnfecteerd en geklaard hart onthult de ingewikkelde vasculatuur van het hart. Met parasieten geïnfecteerde cellen konden worden waargenomen in de hartboezems. Nucleaire kleuring van skeletspieren toonde een opeenhoping van kernen in gebieden met weinig of niet-detecteerbare tdTomato-parasieten.Het stimuleren van tdTomato en GFP parasiet reporter markers met antilichamen tegen RFP, en GFP, en hele geklaarde skeletspieren resulteerde in sterke fluorescentie. De kritieke punten zijn dus de incubatietijd in de CUBIC-buffer, de verdunnings- en incubatietijd in de DNA-kleurstof, de incubatietijd in de antilichamen en de incubatietijd in de gebroken index-matchingoplossing. Het gebruik van extra kleuring, met specifieke antilichamen kleurstof en snelle reactie, zou het potentieel van deze techniek aanzienlijk kunnen vergroten, waardoor de detectie van meerdere cellen, processen en structuur in intacte organen mogelijk wordt.We hebben nu een betere en completere manier om de immuuncellen te verkennen die verantwoordelijk zijn voor het doden van de parasieten, de weefsels waar de parasieten chronisch blijven bestaan en de distributie van de specifieke medicijnen in de weefsels.

quantitative-3d-imaging-trypanosoma-cruzi-infected-cells-dormant

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We tonen de methode voor het uitvoeren van intravitale microscopie van de milt met behulp van GFP transgene malariaparasieten en de kwantificering van de parasiet de mobiliteit en de bloedstroom binnen dit orgaan.

Intravitale Microscopie van de milt: Kwantitatieve Analyse van Parasite Mobiliteit en Blood Flow

We beschrijven een correlatieve microscopie methode die high-speed 3D levende cellen fluorescerend licht microscopie en hoge-resolutie cryo-electron tomografie combineert. We demonstreren het vermogen van de correlatieve wijze dynamische beeldvorming, kleine HIV-1 deeltjes interactie met gastheer HeLa cellen.

Correlatieve microscopie voor 3D Structural Analysis van Dynamic Interactions

Met dit protocol, konden we beeld 160 pm dikke hersencoupes van muizen geïnfecteerd met de parasiet Toxoplasma gondii, die visualisatie en analyse van de ruimtelijke relatie tussen de encysting parasiet besmette neuron maakt.

3-D Imaging en Analyse van Neuronen Infected In Vivo Met Toxoplasma gondii

Dit manuscript beschrijft het gebruik van een bioluminescente stam van Afrikaanse trypanosomen om de tracking van een late infectiefase mogelijk te maken en demonstreert hoe in vivo live beeldvorming kan worden gebruikt om infecties binnen het centrale zenuwstelsel in real-time te visualiseren.

Bioluminescentie Imaging te laat stadium Infectie van Afrikaanse trypanosomiasis Detect

In dit protocol, fluorescently geëtiketteerde T. cruzi werden ingespoten in transparante zebrafish larven en de beweeglijkheid van de parasiet werd waargenomen in vivo met licht blad fluorescentie microscopie.

Oprichting van larvale zebravis als Model van een dier te onderzoeken Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

De Trypanosoma cruzi agent van de ziekte van Chagas produceert langdurig asymptomatische infecties die abrupt tot klinisch erkende pathologie uitgroeien. Het volgende onderzoeksprotocol beschrijft een short-run programma gezinsgerichte epidemiologische studie om te ontrafelen de T. cruzi infectie van bovenliggende seksueel overgedragen aan nakomelingen.

Seksuele transmissie van Amerikaanse trypanosomen van mannetjes en vrouwtjes te naïeve Mates

Dit protocol beschrijft de stappen om een 3D-model van metabolietverdeling tijdens trypanosomatide-infectie te genereren, inclusief monsterverzameling, metabolietextractie, een overzicht van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometriegegevensverzameling, 3D-modelgeneratie en ten slotte gegevensvisualisatie.

Chemische cartografie benaderingen om trypanosomatide infectie te bestuderen

Deze studie toont een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van ultrastructuurexpansiemicroscopie in drie in vitro levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi, de ziekteverwekker die verantwoordelijk is voor de ziekte van Chagas. We nemen de geoptimaliseerde techniek voor cytoskeletale eiwitten en pan-proteoomlabeling op.

Ultrastructurele expansiemicroscopie in drie in vitro levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi

Hier beschrijven we een procedure die orgaanbrede detectie van pathogene bacteriën tijdens infectie en kwantificering van fluorescerende reporteractiviteiten mogelijk maakt.

Driedimensionale tomografie van het hele orgaan met hoge resolutie van microbiële infecties

Het hier verstrekte protocol beschrijft de gedetailleerde stappen om onderzoeken naar de werkzaamheid van geneesmiddelen uit te voeren in een bioluminescent model van Trypanosoma cruzi-infectie , met een focus op gegevensverzameling, -analyse en -interpretatie. Er zijn ook procedures voor probleemoplossing en kwaliteitscontrole om technische problemen tot een minimum te beperken.

Demystificerende in vivo bioluminescentiebeeldvorming van een muismodel van de ziekte van Chagas voor onderzoeken naar de werkzaamheid van geneesmiddelen

Leer lichtveldfluorescentiemicroscopie voor 3D-beeldvorming van Trypanosoma cruzi-parasieten en T-cellen in geklaarde organen. Deze methode verbetert de evaluatie van behandelingsresultaten bij Chagas-ziekte.

Kwantitatieve 3D-beeldvorming van trypanosoma cruzi-geïnfecteerde cellen, slapende amastigoten en T-cellen in intacte geklaarde organen (Video) | JoVE Journal

Kwantitatieve 3D-beeldvorming van trypanosoma cruzi-geïnfecteerde cellen, slapende amastigoten en T-cellen in intacte geklaarde organen

Meer video's verkennen