Fabricage van engineered vasculaire flappen met behulp van 3D-printtechnologieën

Ons protocol stelt onderzoekers in staat om hiërarchische vaatnetwerken te genereren binnen een volledig ontworpen en implanteerbare flap, wat de weg vrijmaakte voor nieuwe studies over bloedvatgedrag onder integratie in vivo. Deze techniek combineerde de veelzijdigheid van twee 3D-printtechnologieën om vaten op micro- en mesoschaal te maken en te assembleren die direct kunnen worden geanomomoseerd met gastheervaten met behulp van microchirurgie. Volledig gemanipuleerde gevasculariseerde flappen kunnen worden gebruikt om grote weefseldefecten te behandelen en om een platform te bieden voor het bestuderen van weefselontwikkelingen en -integratie.

De voorgestelde methoden kunnen worden uitgebreid om de opname van weefselspecifieke cellen te bestuderen en om het gebruik van verschillende bioink- en ondersteuningsmaterialen te evalueren. Begin met het invullen van de BVOH-mal met 30 microliter van de polymeeroplossing. Centrifugeer de matrijs op 100 maal g gedurende 2 minuten en vul de mal aan met nog eens 20 microliter van de polymeeroplossing om een volledige vulling te garanderen.

Vries de gevulde mallen minstens 30 minuten in bij min 80 graden Celsius om ervoor te zorgen dat alle polymeeroplossing bevriest. Verwijder het oplosmiddel uit de mallen door ze een nacht te lyofiliseren. Om het opofferingsvormmateriaal te verwijderen, brengt u de mallen na het vriesdroogproces over naar een gedeïoniseerd waterbad van 5 liter onder zacht roeren.

Vervang het water in het bad als het troebel wordt. Wanneer alle BVOH is opgelost, droogt u de steigers aan de lucht en bewaart u ze in een vacuümkamer tot gebruik. Breng ongeveer 4 milliliter van het voorbereide, verdichte steunmateriaal over in elke put van een 12-well plaat met behulp van een pipet met positieve verplaatsing.

Tik op de putplaat op een hard oppervlak om het steunmateriaal gelijkmatig in de put te verspreiden. Bereid een suspensie met 2 miljoen HAMEC-ZsGreen en 6 miljoen tandpulpstamcellen in 10 milliliter endotheelcelmedium. Centrifugeer de celsuspensie op 200 maal g gedurende 4 minuten om een celpellet te verkrijgen, adem vervolgens het supernatantmedium aan en resuspendeer de celpellet in 1 milliliter rhCollMA bioink om een bioink te verkrijgen met een totale celconcentratie van 8 miljoen cellen per 1 milliliter bioink.

Plaats een naald met een interne diameter van 0,22 millimeter op een amberkleurige printcartridge van 3 milliliter en plaats de cartridge in een conische buis van 50 milliliter. Breng 1 milliliter van het cellen-bioinkmengsel over naar de printcartridge door deze vanaf de bovenkant te vullen met een pipet met positieve verplaatsing om bubbels te verminderen. Installeer de printcartridge in het juiste gereedschap bij de bioprinter.

Schets een 2D-patroon van een vierkant van 4 millimeter met een cirkelvormig kanaal met een diameter van 2 millimeter in het midden. Extrudeer de schets met 4 millimeter om een kubus van 4 millimeter met een centraal kanaal te verkrijgen. Exporteer dit object als een STL-bestand.

Importeer een 12-well plate STL-sjabloon in het solide modelleringstabblad in de bioprinter-snijsoftware en plaats deze in het aangewezen gebied van het virtuele printbed. Importeer het STL-bestand van de kubusvorm in het tabblad Effen modellering in de software voor het snijden van bioprinters. Klik op het selectievakje Externe slicer gebruiken, gevolgd door slicer configureren onder het gedeelte objecteigenschappen.

Kies in het pop-upvenster een rechtlijnig patroon voor het vulpatroon en typ 30% in de vuldichtheid, klik op accepteren. Klik op de kubus en verplaats deze met de muis om een kopie van de kubusvorm in elke gewenste virtuele put te plaatsen. Klik op de knop Materiaal toevoegen in het tabblad Materialen van de bioprinter snijsoftware om nieuwe materiaalinstellingen voor rhCollMA bioink te maken.

Kies de materiaalinstellingen voor afdrukken. Voor druk, type 2 psi, en voor snelheid type 20 millimeter per seconde in de overeenkomstige dozen. Wijs de waarden voor lijnbreedte en lijnhoogte toe aan 0,24 millimeter en de versnellingswaarde aan 400 millimeter per vierkante seconde.

Klik op het tabblad effen modellering op het kubusobject en klik vervolgens op het rhCollMA-materiaal uit de materiaalsectie om het toe te wijzen aan de kubusvorm. Klik op het tabblad bioassemblage op de knop Afdruktaak verzenden om de afdruktaak naar de bioprinter te verzenden. Plaats de printcartridge geladen met de cellulaire bioink in het 3-milliliter ambient pneumatische doseergereedschap van de 3D-extrusie-gebaseerde bioprinter.

Klik op de knop Koelen onder het tabblad Verwarming of koeling regelen op het interfacescherm van de bioprinter om de temperatuur van het printbed in te stellen op 4 graden Celsius. Plaats de plaat met het steunbad op het printerbed. Klik op het tabblad Afdrukken op het interfacescherm van de bioprinter op de afdruktaak, klik vervolgens op Start, gevolgd door GO om de afdruktaak te starten.

Stel na het printen de putplaat gedurende 30 seconden bloot aan een lichtbron van 405 nanometer met een intensiteit van 3 milliwatt per vierkante centimeter om de crosslinking van de rhCollMA bioink te initiëren. Na crosslinking incubeer je de putplaat op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende ten minste 20 minuten totdat al het steunbad smelt. Adem het vloeibare steunbad voorzichtig op en vervang het door het endotheelcelmedium.

Incubeer de constructies bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Plaats onmiddellijk na het verwijderen van het ondersteunde materiaal van het biogeprinte microvasculaire netwerk een fibronectine-gecoate PLLA: PLGA vasculaire steiger naast de biogeprinte structuur. Plaats de vasculaire steiger in het hoofdkanaal van de biogeprinte structuur.

Incubeer de geassembleerde constructies bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende twee dagen. Bereid een celsuspensie van tdTomato-tot expressie brengende menselijke vetweefselmicrovasculaire endotheelcellen in een concentratie van 10 miljoen cellen per milliliter. Plaats een druppeltje van 20 microliter van deze celsuspensie op een hydrofoob oppervlak.

Plaats de vasculaire steigers voorzichtig bovenop de druppel, zodat het lumen van de steiger aan het ene uiteinde contact maakt met de celdruppel. Zuig de druppel aan van het tegenovergestelde uiteinde van de steiger en vul het lumen met de celsuspensie. Plaats de zittende steiger in een microcentrifugebuis en plaats deze gedurende 60 minuten in een rotator in een bevochtigde incubator.

Breng ten slotte de steiger over in een 12-well plaat en voeg 2 milliliter endotheelcelmedium toe. Het zijaanzicht van een representatieve geconstrueerde flap die vier dagen na de endotheelbekleding van de vasculaire steiger is afgebeeld, wordt hier weergegeven. De bioprinted microvasculatuur wordt weergegeven in het groen, terwijl de endotheelvoering in het rood wordt weergegeven.

De representatieve afbeelding toont de anastomosen tussen de biogeprinte vasculatuur en de endotheelbekleding. Immunostaining voor de gladde spieractine, kernen en endotheelcellen na zeven dagen incubatie wordt hier getoond. De representatieve afbeelding toont voltooide anastomosen van de ontworpen flap met de dijbeenslagader van een rat vóór het verwijderen van de klem en na het verwijderen van de klem.

Deze techniek kan worden gebruikt om de rijping en integratie van 3D-geprinte vasculatuur in vivo te bestuderen en de perfusie van het implantaat in de achterpoot te controleren om het potentieel en de veiligheid vast te stellen voor het gebruik ervan om weefseldefecten te behandelen.