Name: Fabricage van engineered vasculaire flappen met behulp van 3D-printtechnologieën (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Leer hoe je vasculaire flappen met hiërarchische vaatnetwerken fabriceert met behulp van 3D-printtechnologieën. Deze methode maakt directe anastomose met de rattenfemorale slagader mogelijk voor onderzoek naar bloedvatgedrag.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project ontving financiering van de European Research Council (ERC) in het kader van het Horizon 2020 Research and Innovation Programme van de Europese Unie (subsidieovereenkomst nr. 818808). rhCollMA werd genereus verstrekt door CollPlant (Rehovot, Israël). De auteurs bedanken de Pre-clinical Research Authority van Technion voor de hulp bij dierenverzorging, evenals Janette Zavin, Galia Ben David en Idan Redenski.

<ol><li>Wallace, C. G., Wei, F. -C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+status%2C+evolution+and+future+of+facial+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Chang+Gung+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">The current status, evolution and future of facial reconstruction.</a> Chang Gung Medical Journal. 31 (5), 441-449 (2008).</li>
<li>Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineering complex tissues.</a> Science Translational Medicine. 4 (160), 12(2012).</li>
<li>Duan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-art+review+of+3D+bioprinting+for+cardiovascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">State-of-the-art review of 3D bioprinting for cardiovascular tissue engineering.</a> Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 195-209 (2017).</li>
<li>Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+of+three-dimensional+engineered+tissues+for+regenerative+medicine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications.</a> Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).</li>
<li>Ouyang, L., Armstrong, J. P. K., Chen, Q., Lin, Y., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Void-free+3D+bioprinting+for+in+situ+endothelialization+and+microfluidic+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Void-free 3D bioprinting for in situ endothelialization and microfluidic perfusion.</a> Advanced Functional Materials. 30 (1), 1908349(2020).</li>
<li>Baltazar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+bioprinting+of+a+vascularized+and+perfusable+skin+graft+using+human+keratinocytes%2C+fibroblasts%2C+pericytes%2C+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+-+Part+A%22%5BJournal%5D)">Three dimensional bioprinting of a vascularized and perfusable skin graft using human keratinocytes, fibroblasts, pericytes, and endothelial cells.</a> Tissue Engineering - Part A. 26 (5-6), 227-238 (2020).</li>
<li>Chia, H. N., Wu, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+3D+printing+of+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Recent advances in 3D printing of biomaterials.</a> Journal of Biological Engineering. 9 (1), 4(2015).</li>
<li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of tissues and organs.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).</li>
<li>Guillotin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+assisted+bioprinting+of+engineered+tissue+with+high+cell+density+and+microscale+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Laser assisted bioprinting of engineered tissue with high cell density and microscale organization.</a> Biomaterials. 31 (28), 7250-7256 (2010).</li>
<li>Catros, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+bioprinting+for+creating+on-demand+patterns+of+human+osteoprogenitor+cells+and+nano-hydroxyapatite%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted bioprinting for creating on-demand patterns of human osteoprogenitor cells and nano-hydroxyapatite.</a> Biofabrication. 3 (2), (2011).</li>
<li>Ronca, A., Ambrosio, L., Grijpma, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+designed+poly%28d%2Cl-lactide%29%2Fnanosized+hydroxyapatite+composite+structures+by+stereolithography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Preparation of designed poly(d,l-lactide)/nanosized hydroxyapatite composite structures by stereolithography.</a> Acta Biomaterialia. 9 (4), 5989-5996 (2013).</li>
<li>Lan, P. X., Lee, J. W., Seol, Y. J., Cho, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+3D+PPF%2FDEF+scaffolds+using+micro-stereolithography+and+surface+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Science%3A+Materials+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Development of 3D PPF/DEF scaffolds using micro-stereolithography and surface modification.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 20 (1), 271-279 (2009).</li>
<li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), (2015).</li>
<li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+collagen+to+rebuild+components+of+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart.</a> Science. 365 (6452), 482-487 (2019).</li>
<li>Bhattacharjee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Writing+in+the+granular+gel+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Writing in the granular gel medium.</a> Science Advances. 1 (8), 1500655(2015).</li>
<li>Szklanny, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+engineered+tissue+flaps+with+hierarchical+vessel+networks+%28VesselNet%29+for+direct+host-to-implant+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of engineered tissue flaps with hierarchical vessel networks (VesselNet) for direct host-to-implant perfusion.</a> Advanced Materials. 33 (42), 2102661(2021).</li>
<li>Schleimer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Training+a+sophisticated+microsurgical+technique%3A+interposition+of+external+jugular+vein+graft+in+the+common+carotid+artery+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Training a sophisticated microsurgical technique: interposition of external jugular vein graft in the common carotid artery in rats.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (69), (2012).</li>
<li>Sucher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+hind+limb+transplantation%3A+A+new+composite+tissue+allotransplantation+model+using+nonsuture+supermicrosurgery%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Mouse hind limb transplantation: A new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery.</a> Transplantation. 90 (12), 1374-1380 (2010).</li>
<li>Fensterer, T. F., Miller, C. J., Perez-Abadia, G., Maldonado, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cuff+design+to+facilitate+anastomosis+of+small+vessels+during+cervical+heterotopic+heart+transplantation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Novel cuff design to facilitate anastomosis of small vessels during cervical heterotopic heart transplantation in rats.</a> Comparative Medicine. 64 (4), (2014).</li>
<li>Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+is+the+key+challenge+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Vascularization is the key challenge in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).</li>
<li>Landau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropoelastin+coated+PLLA-PLGA+scaffolds+promote+vascular+network+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation.</a> Biomaterials. 122, 72-82 (2017).</li>
<li>Szklanny, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+scaffold+system+for+studying+the+effect+of+local+geometry+and+topology+on+the+development+and+orientation+of+sprouting+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">High-throughput scaffold system for studying the effect of local geometry and topology on the development and orientation of sprouting blood vessels.</a> Advanced Functional Materials. 1901335, 1-13 (2019).</li>
<li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+transferrable+microvascular+meshes+for+subcutaneous+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Engineering transferrable microvascular meshes for subcutaneous islet transplantation.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li>
<li>Luo, Y., Lode, A., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+plotting+of+three-dimensional+hollow+fiber+scaffolds+based+on+concentrated+alginate+pastes+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Direct plotting of three-dimensional hollow fiber scaffolds based on concentrated alginate pastes for tissue engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 2 (6), 777-783 (2013).</li>
<li>Ying, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+two-phase+emulsion+bioink-enabled+3D+bioprinting+of+porous+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Aqueous two-phase emulsion bioink-enabled 3D bioprinting of porous hydrogels.</a> Advanced Materials. 30 (50), 1-9 (2018).</li>
<li>Rouwkema, J., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+and+angiogenesis+in+tissue+engineering%3A+beyond+creating+static+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks.</a> Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).</li>
<li>Jang, J., Park, J. Y., Gao, G., Cho, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials-based+3D+cell+printing+for+next-generation+therapeutics+and+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biomaterials-based 3D cell printing for next-generation therapeutics and diagnostics.</a> Biomaterials. 156, 88-106 (2018).</li>
<li>Suntornnond, R., An, J., Chua, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+support+materials+in+3D+bioprinting+-+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Bioprinting%22%5BJournal%5D)">Roles of support materials in 3D bioprinting - present and future.</a> International Journal of Bioprinting. 3 (1), 83-86 (2017).</li>
<li>Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+recombinant+type+I+collagen+produced+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+-+Part+A%22%5BJournal%5D)">Human recombinant type I collagen produced in plants.</a> Tissue Engineering - Part A. 19 (13-14), 1527-1533 (2013).</li>
<li>Stein, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+bioactive%2C+post-translationally+modified%2C+heterotrimeric%2C+human+recombinant+type-I+collagen+in+transgenic+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Production of bioactive, post-translationally modified, heterotrimeric, human recombinant type-I collagen in transgenic tobacco.</a> Biomacromolecules. 10 (9), 2640-2645 (2009).</li>
<li>Kaplan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+fabrication+of+precision+polyester+scaffolds+for+axonal+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping fabrication of precision polyester scaffolds for axonal guidance.</a> Biomaterials. , 120062(2020).</li>
<li>Karakurt, I., Lin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printing+technologies%3A+techniques%2C+materials%2C+and+post-processing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Engineering%22%5BJournal%5D)">3D printing technologies: techniques, materials, and post-processing.</a> Current Opinion in Chemical Engineering. 28, 134-143 (2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Engineering gevasculariseerde weefsels is een van de belangrijkste uitdagingen van tissue engineering20. De huidige methoden voor het creëren van gemanipuleerd vasculair weefsel richten zich op het creëren van zelfgeassembleerde microvasculatuur 21,22,23 of het fabriceren van mesoschaal vasculaire steigers 24,25 en niet op het opnieuw creëren van een systeem van hiërarchische vasculatuur, dat onmiddellijk en direct na implantatie kan worden doordrenkt26 . In dit werk beschrijven we een protocol dat gebruik maakt van twee 3D-printmodaliteiten om een hiërarchisch vatnetwerk te fabriceren dat bestaat uit vasculaturen op microschaal en mesoschaal. Het protocol combineert een 3D-bioprinted, zelfgeassembleerd microvasculair netwerk met een mesoschaal vasculaire steiger, waardoor een implanteerbare, gevasculariseerde flap wordt bereikt. Verder presenteert dit artikel een protocol voor het direct anastomeren van deze flap naar de dijbeenslagader van een rat.
3D-bioprinting heeft de afgelopen jaren aan interesse gewonnen vanwege de veelzijdigheid ten opzichte van traditionele tissue engineering-technieken. Hoewel dit protocol de generatie van een microvasculair netwerk in rhCollMA-bioink beschrijft, kunnen de gebruikte methoden met weinig aanpassingen worden toegepast op vele andere bioinks uit de overvloed aan bestudeerde en nieuwe bioinks en ondersteunende baden27,28. We kozen ervoor om rhCollMA als biobaan te gebruiken vanwege de overvloed aan type I collageen in de menselijke ECU, waardoor een geschikte omgeving voor celaanhechting wordt geboden. Bovendien wordt het recombinant geproduceerd in planten en verder gemodificeerd met methacrylaatgroepen, wat fotopolymerisatie en de vorming van stabiele 3D-hydrogelsmogelijk maakt 29,30. Photocrosslinking werd bereikt door de toevoeging van de foto-initiator LAP, waarvan is aangetoond dat deze niet-toxisch is en wordt geactiveerd door blootstelling aan 405 nm blauw licht, waardoor de mogelijke fototoxiciteit van UV-licht wordt verminderd. Het gebruik van lichtgevoelige bioinks vereist echter het gebruik van een fenolroodvrij kweekmedium voor de bereiding van de bioink en het dragermateriaal. Verder beschrijft het protocol het gebruik van gelatine-ondersteuningsmateriaal, dat de high-fidelity extrusie van bioinks zoals rhCollMA mogelijk maakt. Het is dus van cruciaal belang om het gebruik van koud medium te garanderen tijdens de bereiding en de koeling van het printerbed. Overmatige verwarming kan optreden als gevolg van de lichtbron die wordt gebruikt voor crosslinking of van verhoogde omgevingstemperaturen.
Een op extrusie gebaseerde bioprinter is hier gebruikt om het bioprinted microvasculaire netwerk te creëren, en er zijn momenteel veel commercieel verkrijgbare bioprinters die vergelijkbare constructies kunnen genereren. Bovendien kunnen de voorgestelde methoden eenvoudig worden gewijzigd en toegepast om verschillende geometrieën, maten en invulpatronen te bestuderen. In dit werk is gekozen voor een rechtlijnig invulpatroon om onderling verbonden poriën te creëren, en dit kan relatief snel met hoge getrouwheid worden afgedrukt.
Luchtbellen vormen een aanzienlijke uitdaging bij het afdrukken van extrusiebioprinting, vooral in ondersteunende materialen. Daarom is het van cruciaal belang om de aanwezigheid en vorming van deze bellen te minimaliseren door pipetten met positieve verplaatsing te gebruiken voor de overdracht van het ondersteuningsmateriaal, de voorbereiding van de bioink-celsuspensie en hun overdracht naar de printcartridges.
In dit werk werden menselijke vetweefsel-afgeleide endotheelcellen en tandpulpstamcellen gebruikt als ondersteunende cellen vanwege hun relatief eenvoudige isolatie van patiënten. Bovendien werd gekozen voor een totale celconcentratie van 8 x 106 cellen/ml, omdat is aangetoond dat deze concentratie de meest ontwikkelde vasculaire netwerken tot stand brengt16. Hoewel dit protocol kan worden gebruikt om microvasculatuur te genereren met behulp van verschillende celtypen en bronnen, evenals verschillende bioinks, moet een kalibratie van de celconcentratie worden uitgevoerd om de beste omstandigheden voor de ontwikkeling van het microvasculaire netwerk vast te stellen. Bovendien kunnen weefselspecifieke cellen (d.w.z. myoblasten of osteoblasten) in de bioink worden opgenomen om weefselspecifieke gevasculariseerde flappen te bereiken.
De mal voor de poreuze vasculaire steiger werd vervaardigd met behulp van 3D-geprint wateroplosbaar materiaal op een in de handel verkrijgbare extrusie 3D-printer. Dit resulteert in een kosteneffectieve techniek op basis van rapid prototyping-platforms, zodat veel verschillende geometrieën en maten van vasculaire steigers snel kunnen worden bestudeerd en gescreend31. Niettemin is een beperking van deze methode de resolutielimiet van de meeste 3D-printers32. Met de snel evoluerende industrie rond additieve productie, wordt echter verwacht dat deze limieten in de loop van de tijd zullen verbeteren. Het gebruik van organische oplosmiddelen voor het fabricageproces is een andere beperking van het protocol, omdat de meeste organische oplosmiddelen giftig zijn voor cellen, waardoor het niet mogelijk is om de bioprintingprocedure te combineren met het vasculaire steigerfabricageproces.
De beschreven methode om het lumen van de steiger te zaaien met behulp van aspiratie in tegenstelling tot het duwen van de celsuspensie heeft grote effecten op de lokalisatie van de gezaaide cellen. Het gebruik van negatieve druk maakt endotheelisatie van het binnenste lumen van de steiger mogelijk, terwijl het morsen van de celsuspensie door de perforaties op de wand van de steiger wordt geminimaliseerd16.
De beschreven "manchet" -methode voor microchirurgische anastomosen kan eenvoudig worden gewijzigd en aangepast aan verschillende vasculaire steigermaterialen of -maten, evenals aan verschillende slagaders en aderen in een breed scala van diermodellen. De aanpassingen aan het protocol zouden verschillende polyimide buismaten en hechtingsgroottes omvatten. Deze methode vereist geen perforatie van de steigerwand, wat kan leiden tot de ontwikkeling van defecten. Dit werk presenteert een protocol dat kan worden uitgebreid naar vele toepassingen. De kritieke aspecten van dit protocol, waaronder de fabricage van meso- en microschaal vasculatuur en hun assemblage en implantatie, vertegenwoordigen kritieke aspecten van gemanipuleerde flappen, zowel voor reconstructieve toepassingen als voor vasculaire en andere tissue engineering studies.

Ernstige weefseldefecten worden veroorzaakt door traumatische verwondingen, aangeboren afwijkingen of ziekte, en de huidige gouden standaard voor de behandeling van deze defecten is door het gebruik van autologe transplantaten, gevasculariseerde weefselflappen en microvasculaire vrije flappen als weefselvervangers. Deze opties hebben echter de nadelen van beperkte donorplaatsweefsel en morbiditeit op de donorplaats1. Er is dus een groeiende vraag naar alternatieve weefselvervangers die kunnen worden gebruikt om deze defecten te corrigeren2. De dikte van de gemanipuleerde weefselconstructies wordt beperkt door de diffusie van voedingsstoffen en gassen naar de cellen, en daarom is een goed vasculair netwerk essentieel voor het genereren van grote, dikke en goed gevoede steigers.
Verschillende benaderingen zijn toegepast om de vascularisatie van gemanipuleerde implantaten te bevorderen3, waaronder de in vivo rekrutering van vasculaire ondersteuning van de gastheer, de levering van groeifactoren en cytokines in de steigers, de prevascularisatie van implantaten, het genereren van een perfuseerbaar vertakkend microvesselbed met behulp van micropatterningtechnieken4, het gebruik van opofferingsmaterialen voor vasculaire kanaal- / netwerkvorming5 , evenals het creëren van kanalen binnen 3D bioprinted constructen 5,6. Vascularisatie van dikke weefsels vereist de integratie van een hiërarchisch vasculair netwerk bestaande uit bloedvaten op macroschaal en microcapillaire schaal. De bloedvaten op macroschaal verdelen het bloed effectief door het hele construct en maken microchirurgische anastomosen met de bloedvaten van de gastheer mogelijk, terwijl de bloedvaten op microcapillaire schaal de diffusie van voedingsstoffen mogelijk maken.
Bioprinting heeft de afgelopen jaren veel aandacht gekregen vanwege de voordelen die het biedt ten opzichte van conventionele tissue engineering-methoden. Weefsels en organen zijn complexe en ingewikkelde 3D-objecten met een specifieke architectuur. 3D-bioprinting, met zijn vermogen om lagen biomaterialen in hoge resolutie af te zetten, maakt het mogelijk om complexe weefsel- en orgaanvervangers (bijv. Nier, long, lever) te creëren 7. Verschillende printtechnologieën zijn aangepast voor bioprinting, waaronder extrusie-gebaseerde, inkjet8, laser-assisted deposition 9,10 en stereolithografie-gebaseerde11,12 bioprinting. De op extrusie gebaseerde technologieën zijn afhankelijk van het extruderen van het materiaal door een mondstuk door druk uit te oefenen op het materiaalmassaoppervlak tegenover het mondstuk.
Free-form reversible embedding of suspended hydrogels (FRESH) is een bioprinttechniek13,14 waarbij gebruik wordt gemaakt van een granulair ondersteuningsmateriaal waarin het geëxtrudeerde materiaal wordt afgezet en op zijn plaats wordt gefixeerd door het steunbad. Het steunbad biedt mechanische ondersteuning voor de geëxtrudeerde, vooraf verknoopte bioink tot de crosslinking. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het steunbad het mogelijk maakt om materialen met een lage viscositeit te extruderen die hun vorm niet kunnen behouden na extrusie en vóór crosslinking15. Dit vergroot de pool van beschikbare materialen die als bioinks kunnen worden gebruikt.
Dit artikel presenteert een protocol voor het genereren van een gevasculariseerde flap die vasculatuur op microschaal en mesoschaal combineert. Om dit te bereiken, worden bioprinted, zelfassemblerende, microvasculaire netwerken gegenereerd in recombinant humaan collageenmethacrylaat (rhCollMA) hydrogel, dat vervolgens verbinding maakt met het binnenste van een grotere, implanteerbare, vasculaire steiger, wat resulteert in een volledig gemanipuleerde weefselflap16. Om een snelle en directe perfusie van gemanipuleerde weefsels tot stand te brengen, is een directe microchirurgische anastomose naar gastheervaten vereist. De vasculaire steiger heeft niet voldoende hechtsterkte om te worden geanastomoseerd met behulp van traditionele microchirurgische vaatwand hechting. Daarom beschrijven we een "manchet"17,18,19 methode om een anastomose te bereiken met de gemeenschappelijke dijbeenslagader van een rat. Bij deze methode worden de uiteinden van het vat vastgezet met omtreknaden, zonder dat de vaatwand hoeft te worden geperforeerd.
Hoewel het voorgestelde protocol is voorbereid om hiërarchische vasculatuur in de rhCollMA-omgeving te bestuderen, kan deze aanpak worden uitgebreid en toegepast op een verscheidenheid aan nieuwe toepassingen. Het protocol kan worden toegepast op het bioprinten van verschillende weefselspecifieke cellen in verschillende bioinks. Bovendien kunnen de geometrie en grootte van de constructies eenvoudig worden aangepast aan specifieke vereisten, zoals grote weefselreconstructie of biologische studies.

```html
<table><tbody><tr><td>1,4-Dioxaan</td><td>Biosolve Chemical</td><td>42405</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 0,5" puntsnuitverdeelnaalden</td><td>CML supply</td><td>901-27-050</td><td></td></tr><tr><td>3cc barnsten kleurige spuitenvat &amp; zuigerset</td><td>Nordson EFD</td><td>7012085</td><td>Barnsten kleurige spuiten worden gebruikt om licht te blokkeren en voortijdige crosslinking te voorkomen</td></tr><tr><td>5-0 AssuCryl PGA absorbeerbare hechtingsdraad</td><td>Assut Sutures</td><td></td><td>Absorbeerbare hechtingsdraad gebruikt voor sluiting van huidwonden</td></tr><tr><td>6-0 polypropyleen hechtingsdraad</td><td>Assut Sutures</td><td>9351</td><td></td></tr><tr><td>Acland klemmen</td><td>S&amp;T</td><td>B-1V</td><td></td></tr><tr><td>Adventitia schaar</td><td>S&amp;T</td><td>SAS-15</td><td></td></tr><tr><td>Gebogen nr. 3 juwelierstangen</td><td>S&amp;T</td><td>JFAL-3-18</td><td></td></tr><tr><td>BioAssemblyBot 400 3D Bioprinter</td><td>Advanced Solutions</td><td></td><td>een 6-assige 3D bioprinter</td></tr><tr><td>Rund albumine serum Probumin</td><td>Millipore</td><td>&nbsp;82-045-1</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfine</td><td>vetmarket</td><td>B15100</td><td></td></tr><tr><td>BVOH filament</td><td>Verbatim</td><td>55903</td><td>een wateroplosbaar 1,75 mm diameter filament</td></tr><tr><td>Klamp aanbrengtang</td><td>S&amp;T</td><td>CAF-4</td><td></td></tr><tr><td>Tandpulp stamcellen</td><td>Lonza</td><td>PT-5025</td><td></td></tr><tr><td>Dietrich bulldog klemmen</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>18039-45</td><td></td></tr><tr><td>di-Natriumwaterstoffosfaat (Na2HPO4)</td><td>Carlo Erba Reagents</td><td>480141</td><td></td></tr><tr><td>Dissectieschaar</td><td>S&amp;T</td><td>18039-45</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, Hoge Glucose, Geen Fenol Rood</td><td>Sartorius</td><td>01-053-1A</td><td></td></tr><tr><td>Duratears</td><td>Alcon</td><td>DJ03</td><td></td></tr><tr><td>ECM media + bullet kit</td><td>Sciencell</td><td>#1001</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96%</td><td>Gadot-Group</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>glutaminevervanger</td></tr><tr><td>Geit anti-muis Cy3 antilichaam</td><td>Jackson</td><td>115-166-072</td><td></td></tr><tr><td>Heparine Sodium&nbsp; 5.000 I.U./mL</td><td>Panpharma</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Menselijke adipose microvasculaire cellen</td><td>Sciencell</td><td>#7200</td><td></td></tr><tr><td>Menselijke fibronectine</td><td>Sigma</td><td>F0895-5MG</td><td>Een stockconcentratie van 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Isofluraan, USP Terrell</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-011-25</td><td></td></tr><tr><td>LifeSupport</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5244</td><td>een gelatine ondersteuningsslurry voor FRESH 3D bioprinting</td></tr><tr><td>Litium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat (LAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900889</td><td></td></tr><tr><td>DMEM met lage glucose</td><td>Biological Industries</td><td>01-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>MICROMAN E M1000E, 100-1.000 &micro;L</td><td>Gilson</td><td>FD10006</td><td></td></tr><tr><td>Muis anti-SMA antilichaam</td><td>Dako</td><td>M0851</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140068</td><td></td></tr><tr><td>Naaldhouder</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde oplossing 4% in PBS</td><td>ChemCruz</td><td>&nbsp;SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine-Nystatine oplossing</td><td>Biological Industries</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethyleenoxide), M.W. 250.000 tot 400.000</td><td>Acros Organics</td><td>178602500</td><td></td></tr><tr><td>Poly(L-melkzuur), IV 5,0 dl/g (PLLA)</td><td>Polysciencse, Inc.</td><td>18582-10</td><td></td></tr><tr><td>Polyimide buis, ID: 0,0249", OD: 0,0273"</td><td>Cole-Parmer</td><td>95820-05</td><td>Een dunne wandbuis gebruikt voor het fabriceren van manchetten voor microchirurgische anastomosen</td></tr><tr><td>Prusa I3 MK2.5 3D Printer</td><td>Prusa Research</td><td>http://www.prusa3d.com/</td><td>een populaire commerciële 3D printer</td></tr><tr><td>Resomer&nbsp;RG 503 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA)</td><td>Evonik Industries</td><td>719870</td><td></td></tr><tr><td>rhCollMA</td><td>CollPlant</td><td>https://collplant.com/</td><td>vriendelijk verstrekt door CollPlant (Rehovot, Israel)</td></tr><tr><td>Rond handvat naaldhouder</td><td>S&amp;T</td><td>B-15-8</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel handvat - #3</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Kleine fijne rechte schaar</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Biosolve Chemical</td><td>19030591</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat dibasisch (NaH2PO4)</td><td>Riedel-de Haen</td><td>4276</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks</td><td>Dassault Systems</td><td></td><td>CAD software</td></tr><tr><td>Rechte nr. 3 juwelierstangen</td><td>S&amp;T</td><td>JF-3-18</td><td></td></tr><tr><td>Rechte gekartelde tangen</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisch scalpelblad nr. 15</td><td>Swann-Morton Limited</td><td>305</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>BioLab LTD</td><td>57836</td><td></td></tr><tr><td>TSIM</td><td>Advanced Solutions</td><td></td><td>3D slicing en design software voor de BioAssembly Bot</td></tr><tr><td>Vessel dilator</td><td>S&amp;T</td><td>D-5a.1</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Tivato 700 chirurgische microscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
```

fabricage van engineered vasculaire flappen met behulp van 3d-printtechnologieën

Fabrication of Engineered Vascular Flaps Using 3D Printing Technologies

Engineering implanteerbare, functionele, dikke weefsels vereist het ontwerpen van een hiërarchisch vasculair netwerk. 3D-bioprinting is een technologie die wordt gebruikt om weefsels te creëren door laag op laag printbare biomaterialen, bioinks en cellen op een ordelijke en automatische manier toe te voegen, waardoor zeer ingewikkelde structuren kunnen worden gecreëerd die traditionele weefselmanipulatietechnieken niet kunnen bereiken. 3D-bioprinting is dus een aantrekkelijke in vitro benadering om de inheemse vasculatuurcomplexstructuur na te bootsen, variërend van millimetrische vaten tot microvasculaire netwerken. 
Vooruitgang in 3D-bioprinting in granulaire hydrogels maakte de extrusie met hoge resolutie van extracellulaire matrixgebaseerde bioinks met lage viscositeit mogelijk. Dit werk presenteert een gecombineerde 3D-bioprinting en op offervorm gebaseerde 3D-printbenadering voor het fabriceren van gemanipuleerde gevasculariseerde weefselflappen. 3D-bioprinting van endotheel- en ondersteuningscellen met behulp van recombinant collageen-methacrylaatbioink in een gelatine-ondersteuningsbad wordt gebruikt voor de fabricage van een zelfgeassembleerd capillair netwerk. Deze geprinte microvasculatuur is geassembleerd rond een mesoschaalvatachtige poreuze steiger, vervaardigd met behulp van een opofferende 3D-geprinte mal, en is bezaaid met endotheelcellen. 
Deze assemblage induceert het endotheel van het mesoschaalvat tot anastomose met het omliggende capillaire netwerk, waardoor een hiërarchisch vasculair netwerk ontstaat binnen een gemanipuleerde weefselflap. De gemanipuleerde flap wordt vervolgens direct geïmplanteerd door chirurgische anastomose in een heupslagader van een rat met behulp van een manchettechniek. De beschreven methoden kunnen worden uitgebreid voor de fabricage van verschillende gevasculariseerde weefselflappen voor gebruik in reconstructiechirurgie en vascularisatiestudies.

Dit protocol beschrijft de fabricage van een gemanipuleerde flap bestaande uit een vasculaire steiger (figuur 1Ai) en een bioprint microvasculatuur (figuur 1Aii), die werden geassembleerd om mesoschaal- en microschaalvaculaturen te bereiken (figuur 1Aiii). Volgens het protocol werden BVOH-mallen van de vasculaire steiger ontworpen en 3D-geprint (figuur 1B, C). De verkregen geprinte structuren werden visueel geïnspecteerd op kleine strengen BVOH, die kunnen worden gevonden in de lege ruimtes van de mallen (figuur 1D). Deze strengen geven meestal onjuiste materiaalinstellingen aan of dat de BVOH vocht heeft opgenomen. Deze strengen moeten worden verwijderd omdat ze kunnen leiden tot onvolledige vulling van de mal en structurele defecten in de resulterende vasculaire steiger. Vervolgens werden de mallen gevuld met PLLA:PLGA-oplossing, gevolgd door het vriesdroogproces en de wasstappen, zoals beschreven in het protocol. De verkregen PLLA:PLGA vasculaire steiger werd visueel geïnspecteerd om de integriteit van de vaatwand en de doorgankelijkheid van het lumen te verifiëren (figuur 1E).
Een geneutraliseerde rhCollMA bioink in een concentratie van 10 mg/ml werd bereid en gecombineerd in een verhouding van 1:1 met de PEO:LAP oplossing. Menselijke vetweefselmicrovasculaire endotheelcellen gelabeld met Zs-Green1 en tandpulpstamcellen werden geresuspendeerd met de rhCollMA-bioink en de oplossing werd in een printcartridge en op de printer geladen. Doosvormen met een centraal kanaal met een rechtlijnig patroon (figuur 1D) werden gebioprint in het gelatine-steunbad. Na het printen werden de constructies verknoopt en werd het steunbad opgelost en gewassen. Na 4 dagen cultuur werden de constructies live in beeld gebracht om te controleren op microvasculaire netwerkzelfassemblage. Figuur 1D toont een voorbeeld van een hoog ontwikkeld HAMEC-ZsGreen1 microvasculair netwerk in het bioprinted construct.
Vervolgens werd een met fibronectine gecoate vasculaire steiger in het centrale kanaal van het geprinte construct ingebracht (figuur 2A). De geassembleerde constructies werden gedurende 2 dagen gekweekt, waarbij de cellen de gel samentrekken en stevig aan de vasculaire steiger hechtten. Vervolgens werd de vasculaire steiger bekleed met HAMEC's die tdTomato tot expressie brachten, volgens het protocol. Na 7 dagen cultuur werden de constructies gefixeerd en in beeld gebracht. Figuur 2B toont een zijaanzicht van de geassembleerde constructies waar de endotheelcellen in de biogeprinte microvasculatuur in het groen zijn afgebeeld, terwijl de endotheelbekleding van de vasculaire steiger in rood is afgebeeld. De afbeelding toont een groene microvasculaire zelfassemblage in de bioprinted gel, terwijl de vasculaire steiger is bekleed met rode endotheelcellen. Bij een hogere vergroting worden spruiten afkomstig van de rode endotheelbekleding gezien die ontkiemen en anastomoseren met het biogeprinte microvasculaire netwerk (figuur 2C). Vervolgens werden de constructen gekleurd voor α-smooth muscle actin (SMA) als marker voor de stamcellen van de tandpulp. Na de immunostaining werden de constructen in beeld gebracht met behulp van een laserscanende confocale microscoop (figuur 2D).
Ten slotte werden de gemanipuleerde flappen na 7 dagen kweken microchirurgisch anastomosueel geanomoseerd naar de dijbeenslagader van een rat, zoals beschreven in het protocol. Een video van een representatieve procedure is te zien in Aanvullende Video S1. Figuur 2E toont een representatief beeld van een voltooid anastomos voorafgaand aan het verwijderen van de klem, en figuur 2F toont een representatief beeld van de anastomosenplaats na het verwijderen van de klem en hemostase. Er mag geen bloeding zichtbaar zijn voorafgaand aan de wondsluiting.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63920/63920fig01.jpg"> Figuur 1: Representatieve beelden van de gefabriceerde meso- en microschaalvaten. (A) Schematisch overzicht van de stappen van het protocol. Gereproduceerd met toestemming16. (B) CAD-ontwerp voor de offerschimmel van de vasculaire steiger. (C) Zijaanzicht van een representatieve 3D-geprinte offermal (schaalbalk = 0,5 mm). (D) Bovenaanzicht van offerschimmel (schaalbalk = 0,5 mm) (E) Representatieve vasculaire steiger vervaardigd met behulp van het beschreven protocol (schaalbalk = 5 mm). (F) CAD-ontwerp voor het 3D-bioprinted rhCollMA microvasculaire netwerk. Rasterlijnen = 1 mm. (G) Representatieve afbeelding van een hoog ontwikkeld biogeprint vasculair netwerk met HAMEC-ZsGreen1 in het groen. Schaalbalk = 200 μm. Afkortingen: CAD = computer-aided design; rhCollMA = recombinant humaan collageenmethacrylaat; HAMEC = humane vet microvasculaire endotheelcellen; PLLA = poly-L-melkzuur; PLGA = polymelk-co-glycolzuur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63920/63920fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63920/63920fig02.jpg"> Figuur 2: Representatieve beelden van de geassembleerde gevasculariseerde flap. (A) Een foto van een representatieve assemblage van bioprinted microvasculatuur en de vasculaire scaffold. Schaalbalk = 1 mm. (B) Zijaanzicht van een representatieve ontworpen flap afgebeeld 4 dagen na de endotheelbekleding van de vasculaire steiger. De bioprinte microvasculatuur wordt weergegeven in het groen (HAMEC-ZsGreen1), terwijl de endotheelvoering in het rood wordt weergegeven (HAMEC-tdTomato). Schaalbalk = 1 mm. (C) Representatief beeld van anastomosen tussen de biogeprinte vasculatuur in groen en de endotheelvoering in rood. Schaalbalk = 200 μm. (D) Representatief beeld van immunostaining voor gladde spieractine (rood), kernen (blauw) en endotheelcellen (groen) na 7 dagen incubatie. Schaalbalk = 0,1 mm. (E) Representatief beeld van een voltooid anastomos van de ontworpen flap met de dijbeenslagader van een rat vóór het verwijderen van de klem en (F) na het verwijderen van de klem. Afkortingen: HAMEC = human adipose microvasculaire endotheelcellen; SMA = gladde spier actine; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63920/63920fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende video S1: Representatieve microchirurgische procedure voor het anastomoseren van de vasculaire steiger naar de dijbeenslagader van een rat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63920/supplementary%20video%201%20(1).mp4" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>

Ontworpen flappen vereisen een geïntegreerd functioneel vasculair netwerk. In dit protocol presenteren we een methode voor het fabriceren van een 3D-geprinte weefselflap met een hiërarchisch vasculair netwerk en de directe microchirurgische anastomosen naar de dijbeenslagader van ratten.

Fabricage van engineered vasculaire flappen met behulp van 3D-printtechnologieën

Engineering implantable, functional, thick tissues requires designing a hierarchical vascular network. 3D bioprinting is a technology used to create ...

Ons protocol stelt onderzoekers in staat om hiërarchische vaatnetwerken te genereren binnen een volledig ontworpen en implanteerbare flap, wat de weg vrijmaakte voor nieuwe studies over bloedvatgedrag onder integratie in vivo. Deze techniek combineerde de veelzijdigheid van twee 3D-printtechnologieën om vaten op micro- en mesoschaal te maken en te assembleren die direct kunnen worden geanomomoseerd met gastheervaten met behulp van microchirurgie. Volledig gemanipuleerde gevasculariseerde flappen kunnen worden gebruikt om grote weefseldefecten te behandelen en om een platform te bieden voor het bestuderen van weefselontwikkelingen en -integratie.De voorgestelde methoden kunnen worden uitgebreid om de opname van weefselspecifieke cellen te bestuderen en om het gebruik van verschillende bioink- en ondersteuningsmaterialen te evalueren. Begin met het invullen van de BVOH-mal met 30 microliter van de polymeeroplossing. Centrifugeer de matrijs op 100 maal g gedurende 2 minuten en vul de mal aan met nog eens 20 microliter van de polymeeroplossing om een volledige vulling te garanderen.Vries de gevulde mallen minstens 30 minuten in bij min 80 graden Celsius om ervoor te zorgen dat alle polymeeroplossing bevriest. Verwijder het oplosmiddel uit de mallen door ze een nacht te lyofiliseren. Om het opofferingsvormmateriaal te verwijderen, brengt u de mallen na het vriesdroogproces over naar een gedeïoniseerd waterbad van 5 liter onder zacht roeren.Vervang het water in het bad als het troebel wordt. Wanneer alle BVOH is opgelost, droogt u de steigers aan de lucht en bewaart u ze in een vacuümkamer tot gebruik. Breng ongeveer 4 milliliter van het voorbereide, verdichte steunmateriaal over in elke put van een 12-well plaat met behulp van een pipet met positieve verplaatsing.Tik op de putplaat op een hard oppervlak om het steunmateriaal gelijkmatig in de put te verspreiden. Bereid een suspensie met 2 miljoen HAMEC-ZsGreen en 6 miljoen tandpulpstamcellen in 10 milliliter endotheelcelmedium. Centrifugeer de celsuspensie op 200 maal g gedurende 4 minuten om een celpellet te verkrijgen, adem vervolgens het supernatantmedium aan en resuspendeer de celpellet in 1 milliliter rhCollMA bioink om een bioink te verkrijgen met een totale celconcentratie van 8 miljoen cellen per 1 milliliter bioink.Plaats een naald met een interne diameter van 0,22 millimeter op een amberkleurige printcartridge van 3 milliliter en plaats de cartridge in een conische buis van 50 milliliter. Breng 1 milliliter van het cellen-bioinkmengsel over naar de printcartridge door deze vanaf de bovenkant te vullen met een pipet met positieve verplaatsing om bubbels te verminderen. Installeer de printcartridge in het juiste gereedschap bij de bioprinter.Schets een 2D-patroon van een vierkant van 4 millimeter met een cirkelvormig kanaal met een diameter van 2 millimeter in het midden. Extrudeer de schets met 4 millimeter om een kubus van 4 millimeter met een centraal kanaal te verkrijgen. Exporteer dit object als een STL-bestand.Importeer een 12-well plate STL-sjabloon in het solide modelleringstabblad in de bioprinter-snijsoftware en plaats deze in het aangewezen gebied van het virtuele printbed. Importeer het STL-bestand van de kubusvorm in het tabblad Effen modellering in de software voor het snijden van bioprinters. Klik op het selectievakje Externe slicer gebruiken, gevolgd door slicer configureren onder het gedeelte objecteigenschappen.Kies in het pop-upvenster een rechtlijnig patroon voor het vulpatroon en typ 30% in de vuldichtheid, klik op accepteren. Klik op de kubus en verplaats deze met de muis om een kopie van de kubusvorm in elke gewenste virtuele put te plaatsen. Klik op de knop Materiaal toevoegen in het tabblad Materialen van de bioprinter snijsoftware om nieuwe materiaalinstellingen voor rhCollMA bioink te maken.Kies de materiaalinstellingen voor afdrukken. Voor druk, type 2 psi, en voor snelheid type 20 millimeter per seconde in de overeenkomstige dozen. Wijs de waarden voor lijnbreedte en lijnhoogte toe aan 0,24 millimeter en de versnellingswaarde aan 400 millimeter per vierkante seconde.Klik op het tabblad effen modellering op het kubusobject en klik vervolgens op het rhCollMA-materiaal uit de materiaalsectie om het toe te wijzen aan de kubusvorm. Klik op het tabblad bioassemblage op de knop Afdruktaak verzenden om de afdruktaak naar de bioprinter te verzenden. Plaats de printcartridge geladen met de cellulaire bioink in het 3-milliliter ambient pneumatische doseergereedschap van de 3D-extrusie-gebaseerde bioprinter.Klik op de knop Koelen onder het tabblad Verwarming of koeling regelen op het interfacescherm van de bioprinter om de temperatuur van het printbed in te stellen op 4 graden Celsius. Plaats de plaat met het steunbad op het printerbed. Klik op het tabblad Afdrukken op het interfacescherm van de bioprinter op de afdruktaak, klik vervolgens op Start, gevolgd door GO om de afdruktaak te starten.Stel na het printen de putplaat gedurende 30 seconden bloot aan een lichtbron van 405 nanometer met een intensiteit van 3 milliwatt per vierkante centimeter om de crosslinking van de rhCollMA bioink te initiëren. Na crosslinking incubeer je de putplaat op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende ten minste 20 minuten totdat al het steunbad smelt. Adem het vloeibare steunbad voorzichtig op en vervang het door het endotheelcelmedium.Incubeer de constructies bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Plaats onmiddellijk na het verwijderen van het ondersteunde materiaal van het biogeprinte microvasculaire netwerk een fibronectine-gecoate PLLA: PLGA vasculaire steiger naast de biogeprinte structuur. Plaats de vasculaire steiger in het hoofdkanaal van de biogeprinte structuur.Incubeer de geassembleerde constructies bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende twee dagen. Bereid een celsuspensie van tdTomato-tot expressie brengende menselijke vetweefselmicrovasculaire endotheelcellen in een concentratie van 10 miljoen cellen per milliliter. Plaats een druppeltje van 20 microliter van deze celsuspensie op een hydrofoob oppervlak.Plaats de vasculaire steigers voorzichtig bovenop de druppel, zodat het lumen van de steiger aan het ene uiteinde contact maakt met de celdruppel. Zuig de druppel aan van het tegenovergestelde uiteinde van de steiger en vul het lumen met de celsuspensie. Plaats de zittende steiger in een microcentrifugebuis en plaats deze gedurende 60 minuten in een rotator in een bevochtigde incubator.Breng ten slotte de steiger over in een 12-well plaat en voeg 2 milliliter endotheelcelmedium toe. Het zijaanzicht van een representatieve geconstrueerde flap die vier dagen na de endotheelbekleding van de vasculaire steiger is afgebeeld, wordt hier weergegeven. De bioprinted microvasculatuur wordt weergegeven in het groen, terwijl de endotheelvoering in het rood wordt weergegeven.De representatieve afbeelding toont de anastomosen tussen de biogeprinte vasculatuur en de endotheelbekleding. Immunostaining voor de gladde spieractine, kernen en endotheelcellen na zeven dagen incubatie wordt hier getoond. De representatieve afbeelding toont voltooide anastomosen van de ontworpen flap met de dijbeenslagader van een rat vóór het verwijderen van de klem en na het verwijderen van de klem.Deze techniek kan worden gebruikt om de rijping en integratie van 3D-geprinte vasculatuur in vivo te bestuderen en de perfusie van het implantaat in de achterpoot te controleren om het potentieel en de veiligheid vast te stellen voor het gebruik ervan om weefseldefecten te behandelen.

fabrication-engineered-vascular-flaps-using-3d-printing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Tot op heden worden defecten in dik weefsel meestal gereconstrueerd door autologe weefselflaps of geconstrueerde weefsels aan te brengen. In dit protocol presenteren we een nieuwe methode voor het maken van een gevasculariseerd weefselflap met een autologe steel, die dient als alternatief voor autologe flaps.

Engineered Gevasculariseerd Muscle Flap

Schaalbare engineered bloedvaten zou de klinische toepasbaarheid te verbeteren. Gebruik gemakkelijk aanzienlijke 3D gedrukte geleiders, ringen van vasculaire gladde spieren zijn gemaakt en gestapeld in een buisvormige vorm, die een vasculair transplantaat. Enten kan worden aangepast aan de reeks van menselijke kransslagader afmetingen voldoen door eenvoudig de 3D gedrukte handleiding te wijzigen.

Het schalen van Engineered Vascular Enten Met behulp van 3D-Gedrukt Gidsen en de Ring Stapelen Method

Wij bieden een veralgemeende protocol gebaseerd op een strategie van de bioprinting microfluidic voor een vezelige vasculaire bed, waar een secundaire celtype verder zou kunnen worden uitgezaaid in de interstitiële ruimte van deze vezelige structuur voor het genereren van gevacuoliseerd weefsels en organoids engineering.

Microfluidic Bioprinting voor Engineering gevacuoliseerd weefsels en Organoids

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van drie dimensionale gedrukte modellen voor pre-operatieve planning en intraoperatieve reorganisatie van ingewikkelde vasculaire locaties bij de behandeling van een aangeboren aorta anomalie.

Drie-dimensionale afdrukken van een complexe aorta anomalie

Dit protocol beschrijft de productie van polycaprolactone (PCL) gloeidraad met ingesloten polylactic acid (PLA) microsferen waarin decellularized matrices (DM) voor afdrukken in 3D van structurele weefsel engineering constructies.

Nieuwe proces voor afdrukken in 3D Decellularized Matrices

Gepresenteerd hier is een eenvoudig te gebruiken, Core/shell, driedimensionale bioprinten set-up voor één stap fabricage van holle steigers, geschikt voor weefsel engineering van vasculaire en andere buisvormige structuren.

Kern/shell druk steigers voor weefsel engineering van buisvormige constructies

Het huidige protocol beschrijft het porcine fascio-cutane flap model en het potentiële gebruik ervan in gevasculariseerd samengesteld weefselonderzoek.

Een betrouwbaar porcine fascio-cutaan flapmodel voor gevasculariseerde composiet allografts bio-engineering studies

Het protocol beschrijft de chirurgische verkrijging en daaropvolgende decellularisatie van gevasculariseerde varkensflappen door de perfusie van natriumdodecylsulfaatwater door de flapvasculatuur in een aangepaste perfusiebioreactor.

Inkoop en perfusie-decellularisatie van porcine gevasculariseerde flappen in een aangepaste perfusiebioreactor

Dit artikel beschrijft hoe je fototunable hydrogels in 3D bioprint om extracellulaire matrixverstijving en fibroblastactivering te bestuderen.

3D-bioprinting Phototunable Hydrogels om de activering van fibroblasten te bestuderen

We presenteren een protocol voor high-throughput productie van vasculaire kanalen met flexibele afmetingen en gewenste patronen op een standaard plaat met zes putjes met behulp van 3D-bioprinttechnologie, ook wel vessels-on-a-plate (VOP) genoemd. Dit platform heeft het potentieel om de ontwikkeling van therapieën voor de aandoeningen die verband houden met gecompromitteerd endotheel te bevorderen.

High-throughput bioprinting-methode voor het modelleren van vasculaire permeabiliteit in standaard zeswellsplaten met maat- en patroonflexibiliteit

Leer hoe je vasculaire flappen met hiërarchische vaatnetwerken fabriceert met behulp van 3D-printtechnologieën. Deze methode maakt directe anastomose met de rattenfemorale slagader mogelijk voor onderzoek naar bloedvatgedrag.

Fabricage van engineered vasculaire flappen met behulp van 3D-printtechnologieën

Meer video's verkennen