Cryo-elektronentomografie Gegevensverzameling op afstand en subtomogrammiddeling
July 12th, 2022
Het huidige protocol beschrijft cryo-elektronentomografie op afstand met hoge resolutie data-acquisitie met behulp van Tomo5 en daaropvolgende gegevensverwerking en subtomogrammiddeling met behulp van emClarity. Apoferritine wordt als voorbeeld gebruikt om gedetailleerde stapsgewijze processen te illustreren om een cryo-ET-structuur met een resolutie van 2,86 Å te bereiken.
Dit protocol biedt een gemakkelijke toegangsroute naar de steeds populairder wordende maar complexere wereld van cryo-elektronentomografie. Zes cellulaire exemplaren kunnen worden afgebeeld. Instituut in een dicht bij inheemse staat.
Micromoleculen kunnen vervolgens met hoge resolutie worden opgelost in hun oorspronkelijke cellulaire omgeving door crow, et en subatoommiddeling te gebruiken. Begin met het starten van de Tomo five-software vanaf de TEM-server-pc. Start de sessie die is ingesteld door de parameters voor het verkrijgen van afbeeldingen aan te passen op het tabblad Voorbereiding, onder voorinstellingen.
Kopieer de parameters van de beeldacquisitie naar alle andere voorinstellingen voor hoge vergroting. Druk op Set "om de belichting op de microscoop in te stellen en get" om de belichtingsinstellingen voor alle andere hoge vergrotingen te krijgen nadat u ze afzonderlijk hebt geselecteerd. Om een atlas te verzamelen, klikt u op de Nieuwe sessie"in de Atlas"tab.
Stel de sessievoorkeuren in. Voer het opslagpad en het uitvoerformaat in en druk op toepassen. Selecteer Screening" en vink alle atlassen aan die moeten worden verkregen.
Selecteer Close Call Valves"Als de microscoop zonder toezicht is, worden de kolomkleppen gesloten. Om vervolgens de screening te starten, drukt u op de startknop. Inspecteer de enkele of meerdere atlassen op doelen door op het raster in het linkerdeelvenster onder Sessie-instelling te klikken"Klik vervolgens met de linkermuisknop en sleep de muis om rond te bewegen en de middelste scroll om in en uit te zoomen.
Kies het raster voor de doelinstellingen. Selecteer het en klik op Sample laden"vanuit de software. Om beeldverschuivingskalibratie uit te voeren, stelt u op het tabblad Automatische functies de voorinstelling in op Eucentrische hoogte"Navigeer naar Auto-Eucentrisch" door trapeling en drukt u op start.
Als de functie tijdens het targeten gecentreerd bleef, sla dan de kalibraties van de beeldverschuiving over. Ga anders naar het tabblad Voorbereiding voor het kalibreren van de beeldverschuiving selecteer Imageverschuiving kalibreren en druk op start. Hiermee worden lagere vergrotingen afgestemd op de functie die is gecentreerd bij belichtingsvergroting.
Voor het instellen van tomografie start u een nieuwe sessie in Session Setup"voor biologische monsters. Kies Slab like"als het monstertype en selecteer Batch" en Lage dosis"Selecteer vervolgens de map Uitvoerformaat en opslag" . Voeg desgewenst een e-mailontvanger toe en druk op Toepassen"Om doelen in te stellen, gaat u naar de atlaspijl, zoekt u een interessante regio en verplaatst u door de opties te selecteren die met de rechtermuisknop verschijnen.
Maak een overzichtsfoto om een goede positie voor eucentrische hoogteverstelling te bevestigen. Druk vervolgens op autoeucentrisch" om de eucentrische kantelingsroutine uit te voeren, verkrijg opnieuw een nieuwe overzichtsafbeelding om de eucentrische hoogte bij te werken. Inspecteer het vierkante overzicht of de verkregen zoekkaart.
Ga naar een interessante regio en druk op acquire search. Inspecteer vervolgens de zoekafbeelding als het interessegebied niet gecentreerd is, klik met de rechtermuisknop op de gewenste positie en herhaal de fase verplaatsen hier"en verkrijg de afbeelding. Pas de focus- en trackinggebieden aan.
Klik met de linkermuisknop om de tracking- en focusgebieden te slepen. Zodra alle parameters zijn ingesteld, drukt u op Positie toevoegen"Om automatische functies uit te voeren, controleert u de instellingen om de uitlijningen uit te voeren via het tabblad Automatische functies door de atlas naar een koolstofgebied te navigeren. Breng dat gebied naar eucentrische hoogte en volg de volgorde van uitlijningen zoals beschreven in het tekstmanuscript.
Start vervolgens de geautomatiseerde verwerving van het tabblad tomografie. Selecteer de plak Data Acquisition"en stel de gewenste parameters in. Stel parameters voor gegevensverzameling in: kantelstap, maximale positieve hoek, maximale negatieve hoek, volgschema.
Selecteer vervolgens Kolomkleppen sluiten" voor het eucentrische hoogteschema. Begin met het voorbereiden van invoerbestanden en mappen. Stel een projectmap in onder de map Project.
Maak nog een nieuwe map vaste stapels en bereid de invoerbestanden voor. Tilt serie één vaste kantelserie 1. XF en tilt serie 1.tlt.
Om de onscherpte te berekenen, werkt u het parameterbestand bij met de microscoop en beeldparameters. Kopieer een parameterbestand naar de projectmap. Wijzig de naam in param_CTF.
M en voer de aangegeven opdracht uit. Controleer vervolgens de CTF-schattingsresultaten. Controleer voor elke stapel de uitgelijnde stapels met behulp van 3D-mod en zorg ervoor dat de fiduciale kralen correct worden gewist.
Zorg ervoor dat de handvaardigheid correct is door de aangegeven opdracht uit te voeren. Controleer vervolgens de onscherptewaarde en zorg ervoor dat deze overeenkomt met de theoretische CTF-schatting. Als u de subregio's wilt definiëren, genereert u een bend tomogram.
Voer in de projectmap de aangegeven opdracht uit. Bepaal de grenzen door zes punten Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin en Zmax te kiezen, om één subregio onder de map bin10 te maken, voert u de aangegeven opdracht uit. Voer vervolgens deeltjesselectie uit voor elke subregio.
Voer voor de apoferritine-dataset een sjabloonzoekopdracht uit in bin zes. Wijzig de onderstrepingshoek van de sjabloon. Zoekparameters om de hoek, het bereik en de intervallen te bepalen voor zoeken in vlak of buiten het vlak in graden.
Voer in de projectmap de aangegeven opdracht uit. Verwijder de onjuiste deeltjes met behulp van 3D mod onder de map. Convmap_wedge_Type2_bin6. Voer de aangegeven opdracht uit.
Initialiseer vervolgens het project. Voer in de projectmap de aangegeven opdracht uit om een database te maken voor EM-helderheid, AppoF.mat. Voer een reconstructie van het tomogram uit vóór sub-tomomiddeling en uitlijning om CTF-gecorrigeerde subregiotomogrammen te genereren bij bin4, voer de aangegeven opdracht uit.
Vervolgens, om sub tomo-gemiddelden en uitlijning uit te voeren, voert u de gemiddelden uit met behulp van de CTF-gecorrigeerde subtelegrammen vanaf bin4. Voer in de projectmap de aangegeven opdracht uit. Blijf uitlijningen uitvoeren en voer de opdracht uit.
Reinig de overlappende deeltjes door de aangegeven opdracht uit te voeren. Voer de definitieve reconstructie uit door de twee halve datasets te combineren. Voer in de projectmap de aangegeven opdrachten uit.
Overzicht van de tomografieworkflow voor de cellulaire en moleculaire tomografie wordt hier getoond voor cellulaire en lamellenmonsters, de strategie voor gegevensverzameling hangt grotendeels af van het monster en het doel van de beeldvormingsstudie. Verzamelparameters voor verschillende cryo ET-studies worden hier weergegeven. Representatieve tomogrammen van moleculaire monsters zoals apoferritine, dunne cellulaire processen en gecentreerde ionenbundel gefreesde lamellen van het dikke cellulaire monster worden hier weergegeven.
Structurele analyse met hoge resolutie kan helpen om bindingsplaatsen voor medicijndoelen te onthullen en tomografie en subtomograle gemiddelden hebben ook bijgedragen aan de ontwikkeling van vaccins tegen SARS-CoV-2.
Overzicht
Dit protocol beschrijft gedetailleerde stappen voor het verwerven en verwerken van gegevens op afstand voor cryo-elektronentomografie (cryo-ET) met hoge resolutie, waarbij apoferritine als modelsysteem wordt gebruikt. De workflow bereikt een cryo-ET structuurresolutie van 2,86 Å, waarmee efficiënte methoden worden gedemonstreerd van dataverzameling tot subtomogram averaging.
Belangrijke studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Cryo-elektronentomografie
- Structurele biologie
- Cellulair beeldvorming
Achtergrond
- Inleiding tot cryo-elektronentomografietechnieken.
- Belang van het beeldvormen van cellulaire specimens in hun natuurlijke toestand.
- Gebruik van apoferritine voor methodologische illustratie.
Gebruikte methoden
- Gegevensverwerving op afstand met Tomo5 software.
- Verwerkingsmethodologieën met behulp van emClarity voor subtomogram averaging.
- Beeldvorming met hoge resolutie in biologische systemen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvol demonstreren van gegevensverzameling en -verwerking met hoge resolutie.
- Beeldvorming van apoferritine bereiken met significante resolutie.
- Gevalideerde methodologieën voor toekomstige cryo-ET studies.
Conclusies
- Deze studie biedt een systematische aanpak voor beeldvorming met hoge resolutie in de structurele biologie.
- De beschreven methodologieën zijn relevant voor het bevorderen van onderzoek naar cryo-elektronentomografie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Cryo-electron tomography (cryo-ET) with remote data collection and subtomogram averaging enables high-resolution structural analysis of macromolecules in near-native cellular environments. This capability is critical for target validation, mechanistic de-risking, and accelerating early discovery decisions in biopharma R&D. The integration of robust remote workflows ensures uninterrupted access to advanced imaging infrastructure, supporting portfolio continuity and cross-site collaboration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of molecular complexes in situ, supporting functional target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing native conformations and interactions.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway interrogation.
Screening & Assay Development
- Provides validated structural templates for downstream assay development.
- Supports reproducible, quantitative imaging outputs for screening readiness.
- Enables standardization of sample preparation and imaging parameters across projects.
Translational & Preclinical Research
- Aligns high-resolution imaging with disease-relevant systems for translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by maintaining native-state structural fidelity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on structural insights.
Pipeline & Workflow Integration
This remote cryo-ET workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by providing high-resolution, quantitative structural data accessible from any location.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct molecular visualization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay standardization.
- Analytics: Enables robust measurement of structural parameters and statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Maintains structural continuity for biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, remote-access imaging capability for multi-program support.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enables remote, scalable data collection.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization and cross-functional advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM instrumentation and data analysis software (Tomo5, emClarity).
- Demands robust IT infrastructure for remote access and data storage.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and analysis protocols.
- Adaptation across diverse sample types may require protocol optimization.
- Practical limitations include sample thickness, imaging throughput, and computational resources.
