Isolatie en identificatie van watergedragen antibioticaresistente bacteriën en moleculaire karakterisering van hun antibioticaresistentiegenen

Onze methode beantwoordt belangrijke vragen, zoals wat is de totale belasting van antibioticaresistente bacteriën in het watermonster? Wat is de identiteit van deze bacteriën en wat zijn verschillende soorten antibioticaresistente eigenschappen en genen die ze dragen? Het voordeel van ons protocol is dat het zelfs bacteriën kan detecteren die niet in het laboratorium kunnen worden gekweekt, die een aanzienlijk deel van de totale bacteriën in het watermonster vormen.

Vandaar dat theoretisch geen enkele bacterie of zijn resistente eigenschappen worden weggelaten. Deze combinatorische techniek met zowel op cultuur gebaseerde als cultuuronafhankelijke technieken kan worden gerepliceerd en aangepast voor elk monster dat wordt verkregen uit rioolwater, farmaceutische of ziekenhuisuitvloeiing, klinische en niet-klinische omgevingen en meer. Samen met Devika zullen Harshali Shinde en Maitri Mishra, beide senior research fellows van mijn laboratorium, de experimentele procedures demonstreren.

Verwerk om te beginnen het watermonster aseptisch door het door een steriele mousselinedoek te filteren om eventuele deeltjes te verwijderen. Verdun vervolgens het gefilterde watermonster serieel voor verdere analyse. Om de totale bacteriële belasting te bepalen, plaatst u 100 microliter van de juiste verdunningen van het gefilterde watermonster op de gestolde R2A-agarplaten en duplicaten en verspreidt u gelijkmatig.

Incubeer alle monsterspreadplaten bij 35 tot 37 graden Celsius gedurende 48 uur. Tel na de incubatietijd de kolonies en druk de totale bacteriële belasting uit in kolonievormende eenheden per milliliter. Om het antibioticaresistente aantal bacteriën te bepalen, voegt u de antibiotica afzonderlijk toe aan buizen met 20 milliliter steriel gesmolten R2A-agar, ongeveer gemodificeerd bij 40 graden Celsius.

Draai om gelijkmatig te mengen en giet op steriele petriplaten voordat de agar stolt. Voor kwaliteitscontrole en om de werkzaamheid van de antibiotica te controleren, verspreidt u 100 microliter bacteriële suspensie op hun respectieve antibioticum dat R2A agar gemodificeerde platen bevat. Incubeer de platen bij 35 tot 37 graden Celsius gedurende 48 uur en bepaal vervolgens het aantal bacteriën.

Om het DNA-sjabloon van de isolaten voor PCR voor te bereiden, neemt u met behulp van een steriele tandenstoker een enkele geïsoleerde zuivere kolonie van het isolaat dat op een petriplaat groeit. Suspensie de bacteriekolonie in 100 microliter steriel dubbel gedestilleerd water in een microcentrifugebuis en kook het in een kokend waterbad of een droog bad gedurende 10 minuten bij 100 graden Celsius. Centrifugeer de suspensie op 10.000 g gedurende twee minuten om het puin te pelleteren en breng het supernatant over naar een verse steriele microcentrifugebuis om te gebruiken als het ruwe DNA-sjabloon.

Om het V3-gebied van het 16S-rRNA-gen door PCR te versterken, bereidt u 40 microliter van het reactiemengsel in een PCR-buis. Plaats de buis in het thermische blok en voer het juiste programma uit in de PCR thermische cycler. Voor het oplossen en visualiseren van de PCR-amplicons, meng 10 microliter van het versterkte PCR-product in twee microliter 6x gellaadbuffer en laad dit mengsel in de putten van een 1,5% agarose-gel samen met een 100 base paired DNA-ladder voor het schatten van de grootte van de amplicons.

Voer elektroforese uit van de gel in de TAE-tankbuffer op 80 tot 100 volt totdat de trackingkleurstof 3/4 van de gel loopt. Visualiseer vervolgens de ampliconbanden onder een UV-transilluminator. Om het entmateriaal te bereiden, ent u aseptisch een enkele geïsoleerde gezuiverde antibioticaresistentiekolonie in met behulp van een steriele lus in twee milliliter Luria-Bertani, of LB, bouillon zonder enig antibioticum en incubeer bij 37 graden Celsius bij 80 rpm 's nachts.

Voeg de volgende dag 100 tot 150 microliter van de 's nachts gekweekte cultuur toe aan twee milliliter verse niet-selectieve LB-bouillon en incubeer gedurende twee tot vier uur totdat de optische dichtheid op 600 nanometer 0,4 tot 0,5 bereikt. Verdun de vers gekweekte kweeksuspensie met een steriele zoutoplossing van 0,85% en meng voorzichtig om de cellen gelijkmatig te verdelen om een kweekdichtheid te bereiken die overeenkomt met de McFarland-standaard van 0,5. Dompel binnen 15 minuten na verdunning een steriel wattenstaafje in het entmateriaal en verwijder de overtollige suspensie om overmatige inenting van de platen te voorkomen.

Verdeel vervolgens de cultuur gelijkmatig over de voorbereide Mueller Hinton-agarplaat, beginnend vanaf de bovenkant en heen en weer gaande van rand naar rand. Draai vervolgens de plaat 60 graden en begin opnieuw te vegen. Om de antibioticaschijven te plaatsen, gebruikt u een vlam gesteriliseerde tang en brengt u de antibioticaschijven aseptisch over op de geënte agarplaten.

Druk zachtjes op de schijven om volledig contact met de agar te garanderen. Plaats het juiste aantal antibioticaschijven op de agarplaat door rekening te houden met het organisme het gebruikte antibioticum en de plaatgrootte om overlapping van de remmingszones te voorkomen. Binnen 15 minuten na het aanbrengen van de antibioticaschijf keert u de platen om en incubeert u ze 's nachts bij 37 graden Celsius.

Meet de volgende dag de zone van de remmingsdiameter in millimeters en interpreteer deze volgens de breekpuntwaarden die door EUCAST zijn opgegeven. De totale bacteriële belasting in het watermonster bleek 3,0 x 10 tot de negende CFU / ml te zijn en de antibioticaresistente bacteriële belasting bleek hoog te zijn. De gesequencede culturele isolaten van antibioticaresistentie behoorden tot de Enterobacteriaceae-familie, waarvan de meeste Escherichia coli en Klebsiella pneumoniae waren.

Daarnaast werden ook zeldzame opportunistische bacteriën geïdentificeerd. De antibioticagevoeligheidstests met behulp van schijfdiffusiemethode toonden een multiple antibioticumresistentie-index van ongeveer 0,2 voor acht isolaten, wat wijst op een hoge mate van resistentie. Comamonas- en Arthrobacter-soorten vertoonden echter geen resistentie tegen een van de geteste antibiotica.

De kweekbare isolaten onthulden de aanwezigheid van antibioticaresistentiegenen die coderen voor de factoren tegen bèta-lactams, trimethoprim en aminoglycosiden. Metagenomische DNA-analyse voor totale bacteriële diversiteit leidde tot de identificatie van 50 phyla, wat wijst op de hoge bacteriële diversiteit waarbij Proteobacteria het meest dominante fylum was, bestaande uit de klassen Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria en Gammaproteobacteria. Op ordeniveau was Burkholderiales de meest voorkomende, behorend tot de Betaproteobacteria-klasse.

Op algemeen niveau waren Pseudomonas, Acinetobacter, Pedobacter, Prosthecobacter, Limnohabitans, Flavobacterium en Comamonas enkele van de overvloedige bacteriën. De metagenomische DNA-analyse onthulde ook meer antibioticaresistentiegenen. Bij deze methode is de seriële verdunningsstap van cruciaal belang, omdat elke fout kan leiden tot een verkeerde interpretatie van de totale CFU en de antibioticaresistente bacteriële belasting.

Ook moet de diameter van de remmingszone zorgvuldig worden gemeten om correct te interpreteren of het isolaat resistent of gevoelig is. Met behulp van deze protocollen kan, naast watermonster, elk ander monster, of het nu gaat om milieu, voedsel of klinisch, worden bestudeerd. Bovendien kunnen naast bacteriën ook andere microbiële populaties in elk ecosysteem worden bestudeerd met behulp van vergelijkbare benaderingen.